共同研究・競争的資金等の研究 - 窪木 拓男
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細胞バーコーディング技術を応用したin vivo高解像度細胞系譜解析システムの構築
研究課題/領域番号：24K21302 2024年06月 - 2027年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 挑戦的研究(開拓)
大野 充昭, 窪木 拓男, 王 紫儀
配分額：26000000円 （ 直接経費：20000000円 、 間接経費：6000000円 ）
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空間的1細胞エピゲノム解析から紐解く歯胚発生メカニズムの解明
研究課題/領域番号：24K22188 2024年06月 - 2027年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽)
窪木 拓男, 大野 充昭, 王 紫儀
配分額：6370000円 （ 直接経費：4900000円 、 間接経費：1470000円 ）
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1細胞解析で解き明かすMSCsの免疫調節メカニズムとオートファジー
研究課題/領域番号：24K02633 2024年04月 - 2027年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
秋山 謙太郎, 窪木 拓男, 大野 充昭
配分額：18460000円 （ 直接経費：14200000円 、 間接経費：4260000円 ）
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エピゲノムに着目した変形性関節症関連因子WISP1の発現制御機構の解明
研究課題/領域番号：24K13044 2024年04月 - 2027年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
前田 あずさ, 窪木 拓男
配分額：4550000円 （ 直接経費：3500000円 、 間接経費：1050000円 ）
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新規センシング技術と機械学習による歯への機械的負荷を定量化する評価システムの構築
研究課題/領域番号：23K09294 2023年04月 - 2027年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
水口 一, 窪木 拓男, 水口 真実, 三木 春奈
配分額：4680000円 （ 直接経費：3600000円 、 間接経費：1080000円 ）
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MR画像による長期予後調査より関節円板後部結合組織の偽円板化と予後との関連を探る
研究課題/領域番号：23K09295 2023年04月 - 2026年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
三木 春奈, 水口 一, 窪木 拓男
配分額：4680000円 （ 直接経費：3600000円 、 間接経費：1080000円 ）
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MSC/2型Mφ1細胞間連携による炎症・再生連関促進の分子メカニズム解明
研究課題/領域番号：22K19627 2022年06月 - 2025年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽) 挑戦的研究(萌芽)
秋山 謙太郎, 窪木 拓男, 大野 充昭
配分額：6370000円 （ 直接経費：4900000円 、 間接経費：1470000円 ）
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BMP-2誘導性骨髄から紐解く骨髄ニッチ細胞・CAR細胞の起源と発生メカニズム
研究課題/領域番号：22K19625 2022年06月 - 2024年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽) 挑戦的研究(萌芽)
大野 充昭, 窪木 拓男
配分額：6500000円 （ 直接経費：5000000円 、 間接経費：1500000円 ）
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咀嚼が唾液中BDNFならびに認知症発症に与える影響-ヒト高齢者を対象とした研究-
研究課題/領域番号：22K10101 2022年04月 - 2025年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
三野 卓哉, 窪木 拓男, 大野 彩, 大野 充昭, 山下 徹, 黒崎 陽子
配分額：4160000円 （ 直接経費：3200000円 、 間接経費：960000円 ）
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時空間的トランスクリプトーム解析を応用した歯肉角化制御メカニズムの解明
研究課題/領域番号：22K10100 2022年04月 - 2025年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
縄稚 久美子, 納所 秋二, 大野 充昭, 窪木 拓男, 大野 彩
配分額：4160000円 （ 直接経費：3200000円 、 間接経費：960000円 ）
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高齢者の低栄養における腸内細菌叢の役割解明と新規シンバイオティクス療法の開発
研究課題/領域番号：22K10057 2022年04月 - 2025年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
小山 絵理, 後藤 和義, 大野 彩, 窪木 拓男, 大森 江, 大野 充昭
配分額：4290000円 （ 直接経費：3300000円 、 間接経費：990000円 ）
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IoTセンサーを利用した高齢者の口腔関連日常生活動作の測定と要介護後期介入転換
研究課題/領域番号：22K10076 2022年04月 - 2025年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
藤原 彩, 窪木 拓男, 大野 彩, 水口 一
配分額：4160000円 （ 直接経費：3200000円 、 間接経費：960000円 ）
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高齢者の固定性インプラントを活用したシステム非依存的補綴治療介入の有効性の検討
研究課題/領域番号：22K10058 2022年04月 - 2025年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
黒崎 陽子, 窪木 拓男, 三野 卓哉, 大野 彩
配分額：4290000円 （ 直接経費：3300000円 、 間接経費：990000円 ）
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1細胞エピゲノム解析から紐解く象牙芽細胞分化制御メカニズムと治療法への応用
研究課題/領域番号：22H03280 2022年04月 - 2025年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
大野 充昭, 窪木 拓男
配分額：17550000円 （ 直接経費：13500000円 、 間接経費：4050000円 ）
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1細胞エピゲノム解析から紐解く象牙芽細胞分化制御メカニズムと治療法への応用
研究課題/領域番号：23K24538 2022年04月 - 2025年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
大野 充昭, 窪木 拓男, 王 紫儀
配分額：17550000円 （ 直接経費：13500000円 、 間接経費：4050000円 ）
本研究では，歯科界において必須の情報でありながら未解決である象牙芽細胞マスター遺伝子の同定，さらにはダイレクトリプログラミングによる象牙芽細胞分化誘導法を確立する．具体的には，位置情報を付加した1細胞レベルでの解析に加えて，細胞分化の時間軸を加味した分化経 路推定解析を駆使し，候補転写因子群の抽出を行う．そして，iPS細胞樹立技術を逆手に取ったマスター遺伝子同定法を駆使して象牙芽細胞分化のマスター遺伝子を同定し，同定したマスター遺伝子や誘導した象牙芽細胞を利用して，象牙質再生療法の基盤技術を確立する事を目的としている．
2022年度に，生後5~7日齢のCol1a1-GFPマウスの歯胚を摘出後，酵素処理により細胞の単一化を行った.GFP陽性象牙芽細胞およびGFP陽性骨芽 細胞が含まれる CD45 (白血球)，Ter119 (赤血球)，CD31 (血管内皮細胞)陰性分画に存在する細胞をセルソーターにて分離し，約5000個の単一細胞を得て，シングル解析システム (10x chromium)にてscRNA-seq解析を実施した.そして，細胞のアノテーションを行い，間葉系幹細胞が象牙芽細胞へと分化する過程を，velocity解析およびtrajectory解析を駆使し，解析した．その結果，歯胚に存在するMki67陽性の細胞増殖能が高い間葉系幹細胞を同定することができた．また，この細胞が，全象牙細胞から象牙芽細胞へと分化する過程を明らかにすることができた．
今後，本結果から抽出された遺伝子に対し，機能解析を行う予定である． -
時空間的トランスクリプトーム解析・iPS干渉法を応用した歯の再生技術の開発
研究課題/領域番号：21H04842 2021年04月 - 2025年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(A) 基盤研究(A)
窪木 拓男, 大野 充昭, 辻 孝, 渡辺 亮, 宝田 剛志
配分額：42510000円 （ 直接経費：32700000円 、 間接経費：9810000円 ）
本申請研究では，「臓器としての歯の再生」を最終目的に，1細胞レベルでのRNA発現解析に加えて，時空間情報を加味した遺伝子発現解析法を駆使し，歯胚発生における1細胞レベル時空間的トランスクリプトームMapを構築し，これらのデータベースをもとに，iPS干渉法を応用し，歯原性上皮・間葉細胞の誘導方法を開発する.そして，器官原基法により，非歯原性細胞から，生理的機能を有した臓器としての歯を世界で初めて再生することを目的としている．
本年度は，歯胚発生における1細胞レベル時空間特異的トランスクリプトームMapを構築した．
具体的には，マウスE10.5，E11.5，E12.5，E14.5，E18.5の歯胚および非歯原性口腔粘膜組織を摘出し，酵素処理にて約1万細胞の単一細胞を得て，Single cell RNA-Seq (scRNA-Seq)解析し，どの細胞が，どの遺伝子を，どの程度発現しているか1細胞レベルで解析を行った．また，メッシュ状に位置情報となるインデックス配列が付加されたスライドガラスに，E10.5，E11.5，E12.5，E14.5，E16.5の歯胚を含むマウス頭部前頭断の凍結切片を貼り付け，HE染色を行い，組織学的情報を取得した．次に，スライド上でmRNAを単離，位置情報のインデックス配列が付加されたcDNAを合成し，ライブラリー作製後にシークエンスを行い，インデックス情報から，二次元空間での遺伝子発現情報を構築し，遺伝子発現Mapを構築した． -
変形性関節症におけるエピジェネティクスを介したWISP1遺伝子発現制御機構の解明
研究課題/領域番号：21K10019 2021年04月 - 2024年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
前田 あずさ, 窪木 拓男, 大野 充昭
配分額：4160000円 （ 直接経費：3200000円 、 間接経費：960000円 ）
世界でも群を抜いた高齢化率を示している我が国において，医療費や介護給付費による財源圧迫を回避すべく健康寿命の延伸は喫緊の課題であり，国民が要支援となる最大の原因である変形性関節症 (OA) の発症原因や予防法の解明は，臨床的・医療経済学的に大変意義深い．これまでに変形性関節症の原因遺伝子のひとつとされているWISP1遺伝子に着目し，WISP1遺伝子の発現抑制下では変形性関節症の進行が抑制されることを証明してきたが，本研究では，変形性関節症の予防法の確立を視野に入れ，変形性関節症を発症した関節軟骨でWISP1遺伝子がどのように発現制御されているのか解明することを目的としている．
ヒト間葉系幹細胞 (hBMSCs) の軟骨分化過程ではDNAメチル基転移酵素 (DNMT3A) が高発現しており，DNMT3Aを強制発現させたhBMSCsでは軟骨分化が促進されることがわかっているが，軟骨細胞分化に伴い発現することが確認されているWISP1遺伝子が，軟骨細胞分化過程においてどのようにDNAメチル化修飾の影響を受けるのかを検討した．DNAメチル化阻害薬である5-aza-2-deoxycytidine (5-aza) で24時間処理したhBMSCsをマイクロマス培養法にて21日間培養し，軟骨細胞分化過程におけるWISP1遺伝子の発現パターンを定量性RT-PCR法にて評価したところ，コントロール群と比較して5-aza処理群ではWISP1遺伝子の発現は低下しており，脱メチル化によりWISP1遺伝子の発現が低下することが確認された． -
機械学習を応用した咀嚼機能低下を精度高く検出する新規検査方法，評価基準の開発
研究課題/領域番号：21K09977 2021年04月 - 2024年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
水口 真実, 窪木 拓男, 水口 一, 三木 春奈, 小山 絵理
配分額：4160000円 （ 直接経費：3200000円 、 間接経費：960000円 ）
要介護高齢者の増大に対して，要介護状態の発症を遅らせ，健康寿命を延伸することが強く望まれている。近年，フレイルが高齢者の自立喪失の有意なリスク因子であると報告された。フレイルサイクルの一端に口腔機能，特に咀嚼嚥下機能の低下による低栄養がある。そこで，口腔機能低下に関するリスク因子を早期に発見し，早期に口腔機能，栄養状態の改善を図ることができれば，高齢者の要介護状態への転落を遅延できると考えている。
実際の食事時の筋電図を音声波形解析技術の応用と機械学習により，早期の咀嚼機能低下を類推する試みを開始したが，教師データ獲得が困難であったため，他のリスク因子を検討する中でACTN3遺伝子多型が抽出された。そこで遺伝子多型との関連を検討することとした。
咀嚼嚥下機能の維持，賦活を目的とし行われる筋機能訓練により，オーラルディアドコキネシスに加え，舌圧も改善することが知られている。この舌圧は骨格筋量よりも体幹筋量の影響を受け，舌機能や舌骨上筋群は速筋繊維が優位な筋と言われている。一方，サルコペニア発症時には速筋線維優位な筋線維の萎縮が生じ，速筋はサルコペニアの影響を大きく受ける。このサルコペニア発症のリスク因子の一つに，ACTN3遺伝子R577X多型による筋線維の萎縮が明らかとなっているが，これらと舌機能低下並びに嚥下障害を呈するリスクについての関連は明らかでない。
そこで本年度は，ACTN3遺伝子R577X多型を評価するための予備的検討を行った。特に，高齢者を対象にDNAを採取する必要があることから，被検者負担の少ない採取方法並びにその結果の妥当性について検討した。その結果，唾液中，頬粘膜の擦過（10回，20回）を行い，R577X多型を評価したところ，同一の結果が得られた。これより，頬粘膜の10回擦過によってR577X多型を評価するのに十分なDNA採取ができることが明らかとなった。 -
Mφオートファジー異常から見た歯周病やインプラント周囲炎の新規治療戦略
研究課題/領域番号：21H03131 2021年04月 - 2024年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
秋山 謙太郎, 窪木 拓男, 大野 充昭
配分額：17290000円 （ 直接経費：13300000円 、 間接経費：3990000円 ）
本研究は，歯周病やインプラント周囲炎における病態形成メカニズムを，歯槽骨破壊局所に集積するMφの活性化に注目し，オートファジー異常の観点から解明するとともに，炎症性サイトカインの産生経路を特定し，免疫トレランス獲得につながる新たな検査技術や 新規組織再生療 法開発につなげることを目的としている. 本年度の研究実績の概要を以下に示す．
１）実験的マウス周囲炎モデルにおけるマクロファージの分布
週齢の異なるマウス(C57BL/6, 5週齢および50週齢)の下顎第一臼歯に5-0絹糸を結紮した結果，5週齢と比較して50週齢で明らかな歯槽骨破壊が観察された．また，蛍光免疫染色によるマクロファージの分布を確認したところ，50週齢で炎症巣周囲に多くのマクロファージが分布していた．特に，炎症性マクロファージであるCD80陽性M1の分布が観察され，抗炎症性であるCD206陽性M2の分布は５週齢と比べて少ないことがわかった．また，組織の免疫トレランス維持に重要な役割を果たすと考えられている間葉系幹細胞の分布を検討したところ，50週齢ではPDGFra陽性間葉系幹細胞の分布は少ないことがわかった．
２）週齢の違いによる間葉系幹細胞とマクロファージの相互作用
５週齢，50週齢それぞれから単離・培養したマクロファージと間葉系幹細胞をカルチャーインサートを用いて共培養したところ，５週齢間葉系幹細胞はM1からM2へのマクロファージの極性変化を強く誘導したのに対して，50週齢間葉系幹細胞ではあまり誘導されないことがわかった． -
iPS干渉法を利用した間葉系幹細胞の幹細胞性制御機構の解明
研究課題/領域番号：20K21679 2020年07月 - 2023年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽) 挑戦的研究(萌芽)
窪木 拓男, 渡辺 亮, 大野 充昭, 秋山 謙太郎
配分額：6500000円 （ 直接経費：5000000円 、 間接経費：1500000円 ）
近年，加齢変化が引き起こす疾患群に共通するホストの本質的変化として，ステムセルエイジングが注目されている。我々は加齢に伴い間葉系幹細胞(MSCs)の免疫調節能が著明に低下すること，また，骨芽細胞分化能の低下と脂肪細胞分化傾向への転換により，脂肪髄を呈することも明らかにしてきた。その結果，傷害組織で休眠から覚める，もしくは新たに動員されるMSCsの機能が低下し，局所の組織修復能や免疫調節能が低下，加齢性疾患の罹患感受性が上昇すると考えられる。したがって，骨髄MSCsの老化を防ぎ，幹細胞性が高いフラクションをいかに保つかが，これらの加齢性疾患におけるホストの病因の理解，さらには予防と治療に寄与するものと考えられる。そこで本研究は，骨髄MSCsの幹細胞性維持機構を解明することを目的に以下の計画を立てた。1)MSCs幹細胞性維持に関わる因子の探索:ヒト骨髄MSCsとヒト成人皮膚線維芽細胞 (hADFs)から，RNAを抽出し，RNA-Seqにて網羅的に比較検討を行い，転写因子に焦点を絞り，データベースを構築し，関連遺伝子を抽出する。2) 1)にて抽出した関連遺伝子から，iPS干渉法を駆使し，骨髄MSCsの幹細胞性維持に関わるマスター遺伝子の同定を試みる。また，このマスター遺伝子を利用して，hADFsからMSCsを作成する技術を確立する。今年度は，MSCs幹細胞性維持に関わる因子の探索を目的に，ヒト骨髄MSCsとhADFsから，RNAを抽出し，RNA-Seqにて網羅的に比較検討を行い，転写因子に焦点を絞り，データベースを構築し，関連遺伝子を抽出した。そして，抽出した転写因子の強制発現ベクターを作製し，iPS干渉法にて，さらなる絞り込みに成功した。