研究者詳細 - 木村　康二

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piggyBac トランスホソンを用いたリフログラミンク因子導入によるウシ羊膜細胞からの栄養膜細胞株樹立の試み

川口高正, 築山智之, 松山秀一, 木村康二, 南直治郎, 山田雅保, 今井裕

第107回日本繁殖生物学会大会 107 P-20 - P-20 2014年8月

記述言語：日本語掲載種別：研究発表ペーパー・要旨（全国大会，その他学術会議）出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】栄養膜細胞は胚発生で起こる最初の細胞分化により作り出される細胞であり，着床や胎盤形成に重要な役割を担っている。マウスやヒトでは着床初期の研究は盛んに行われているが，ウシでは胚発生および着床・妊娠プロセスは大きく異なっていることもあり，未だ不明瞭な部分も多い。さらに，ウシではこれらの研究を進める上で有用と思われる，栄養膜幹細胞株の報告はなく，それから派生する細胞系譜の細胞株の種類も少ない。本研究では，ウシの羊膜細胞から人工栄養膜細胞(induced trophoblast cells; iTB細胞)の樹立を試みた。【方法】妊娠50日齢の胎仔から採取した羊膜細胞に，Oct3/4，Sox2，Klf4およびc−Mycの転写因子を，piggyBacトランスポゾンベクターを用いて導入した。このベクターには，ドキシサイクリン（Dox）添加の有無によって，導入した転写因子の発現が制御できるシステムを組み込んだ。Doxの添加から4日後，遺伝子導入後の細胞をフィーダー細胞上へと移し，10%のFBSを含む培地で培養を行った。【結果】Doxの添加から2週間後，上皮細胞様で敷石状の形態を示すコロニーが出現した。このコロニーは，その細胞形態を維持したまま40回以上継代を行うことができた。得られた細胞株は，幹細胞マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性を部分的に示していた。また，栄養膜細胞関連遺伝子（CDX2，ESRRβ，IFNτ）を発現していた。さらに，低接着ディッシュ上で数日間浮遊培養し，分化を促すと栄養膜小胞(Trophoblastic vesicle)様の胞状球体および二核細胞の形成が認められた。これらの結果から，羊膜細胞にリプログラミング因子を発現させることにより，人工的に栄養膜細胞株を得ることが可能になった。得られた細胞株は，ウシの着床・妊娠プロセスにおける栄養膜細胞の機能や細胞分化の研究のための有用なツールとなると考えられる。

DOI： 10.14882/jrds.107.0_p-20

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インターフェロン(IFN)τはナノ粒子の取り込みを阻害してインターロイキン(IL)-1β産生を抑制する

原教子, 白砂孔明, 臼井文武, 唐澤直義, 木村博昭, 川島晃, 大口昭英, 松山秀一, 木村康二, 高橋将文

The Journal of Reproduction and Development 60 ( Suppl. ) j137 - j137 2014年8月

記述言語：日本語出版者・発行元：(一社)日本繁殖生物学会

【目的】IFNα（IFNA）やIFNβ（IFNB）を含むⅠ型IFNは自己免疫疾患などの治療薬として期待されている。近年，自己免疫疾患などの無菌性炎症においてインフラマソームの役割が注目されている。NLRP3インフラマソームが関与する多発性硬化症のマウスモデルでは，IFNB投与により病態が軽減される。しかし，Ⅰ型IFNは副作用や細胞毒性が高く，臨床使用は制限されている。一方，反芻動物の胚栄養膜細胞から分泌されるIFNτ（IFNT）は，他のⅠ型IFNと同様の免疫調節作用を有し，細胞毒性が低い。本研究はヒト単球細胞（THP-1）を用い，NLRP3インフラマソームを介したIL-1β分泌におよぼすIFNTの影響を検証した。【方法と結果】1）THP-1にNLRP3インフラマソーム活性化因子であるナノ粒子を添加するとIL-1β産生が増加し，IFNT処置により抑制された。また，IFNTはISG15（IFN応答因子）遺伝子発現を刺激したが，インフラマソーム関連遺伝子には変化がなかった。一方，IFNTはIL-10分泌を促進した。2）活性酸素種はNLRP3インフラマソーム活性化に重要である。THP-1にナノ粒子を添加すると活性酸素種産生が増加したが，IFNT処置により抑制された。3）蛍光物質結合型のナノ粒子をTHP-1に添加すると，細胞内への取り込みが増加したが，IFNT処置では抑制された。また，IFNT処置によりナノ粒子の取り込みに関与するMARCO（スカベンジャー受容体）の遺伝子発現が低下した。4）異物を取り込む際に重要なアクチン形成を解析するためにTHP-1に蛍光ファロイジン染色を行うと，ナノ粒子誘導性のアクチン重合の増加がIFNT処置により抑制された。以上から，THP-1においてIFNTはナノ粒子誘導性のNLRP3インフラマソーム性化を制御することでIL-1βを低減することが示された。この抑制機構には，IFNTによるナノ粒子の取り込みと活性酸素種産生の低下，IL-10産生の増加が関与すると考えられた。

DOI： 10.14882/jrds.107.0_p-76

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ウシ子宮内膜組織におけるMX1とMX1B発現に及ぼすI型インターフェロンの応答性およびその受容体の発情周期別比較

白水貴大, 川原学, 木村康二, 高橋ひとみ, 柳川洋二郎, 永野昌志, 白汝嵐, 今川和彦, 高橋昌志

日本繁殖生物学会講演要旨集 107 ( 0 ) OR2 - 24-OR2-24 2014年

記述言語：日本語出版者・発行元：日本繁殖生物学会

【目的】ウシMX1はI型インターフェロン(IFN)-α/β誘導性遺伝子であり，MX1Bというスプライシング変異体が存在する。我々は第2回北海道畜産草地学会において，子宮組織におけるMX1とMX1B mRNAが妊娠中期と比べて妊娠初期で有意に高い発現を示すことを報告した。このことから，MX1とMX1Bの発現には，妊娠認識時にのみ胚より産生されるIFN-τが深く関わることが示唆された。IFN-τはI型IFNに属するが，IFN-α/βとは異なる一過性の産生パターンを示す。本研究では，MX1とMX1BのI型IFN応答性差異の有無を明らかにする目的で，ウシ子宮組織培養系を用いてIFN-τまたはIFN-αによるMX1とMX1B mRNAの発現応答を比較し検証した。さらに，発情周期の違いによる両遺伝子のIFN応答性の差異について，I型IFN受容体発現と併せて検証した。【材料と方法】黄体所見をもとに前期，中期，後期に分けた食肉処理場由来のウシ非妊娠子宮から内膜組織を採取した。これらの組織小片を1時間前培養後，抗ウイルス活性を合わせたIFN-τを含む濃縮妊娠子宮灌流液(D18)またはウシ組換えIFN-α添加で培養し，12および24時間後のMX1とMX1B mRNAの発現量を定量PCRで調べた。また，採取直後の子宮組織におけるI型IFN受容体IFNAR1とIFNAR2の発現量も定量PCRで調べた。【結果と考察】子宮灌流液(D18)またはIFN-α添加によってMX1とMX1Bともに発現が誘導され，MX1Bに対しMX1が有意に高い発現量を示したが，両添加区間で応答性に差はみられなかった。発情周期別で比較した結果，12時間培養後のMX1とMX1Bの発現量ならびに採取直後の子宮組織でのIFNAR1とIFNAR2の発現量は後期で低い傾向がみられた。以上より，発情周期の違いで子宮内膜におけるI型IFN受容体の発現量が変化し，それに伴いI型IFNによるMX1とMX1Bの発現応答性に差異が生じる可能性が示唆された。

DOI： 10.14882/jrds.107.0_OR2-24

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ウシ子宮内膜上皮細胞におけるSide populationの遺伝子発現解析

松山秀一, 古澤軌, 池田光美, 木村康二

日本繁殖生物学会講演要旨集 107 P-69 - P-69 2014年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】ヒトの子宮内膜は，エストロジェンやプロジェステロンの支配を受けて月経周期ごとに脱落と増殖を繰り返し，絶えず更新される。さらに，子宮に存在する組織幹細胞（子宮内膜幹細胞）が子宮内膜の更新に寄与することが示唆されているが，ヒトとは異なる子宮内膜更新メカニズムを有するウシにおいては，子宮における幹細胞の存在について未だ明らかでない。本研究では，ウシの子宮内膜更新メカニズムを明らかにする第一歩として，ウシ子宮における組織幹細胞の存在を明らかにすることを目的とした。【方法および結果】未経産牛の子宮からトリプシン処理により単離し，培養した子宮内膜上皮細胞を用いてHoechst33342にて染色後，フローサイトメトリー解析に供した。その結果，ウシ子宮内膜上皮培養細胞には蛍光強度の低い領域に突出した細胞集団が存在し，この細胞集団はATP binding cassette（ABC）トランスポーターの阻害剤であるベラパミル存在下で消失した。このことから，ヒト等において幹細胞活性を有すると報告されているSide population (SP) 細胞がウシの子宮内膜上皮細胞においても存在することが明らかとなった。さらにセルソーターによって，ウシの子宮内膜上皮培養細胞からSP細胞とそれ以外の細胞（Major population, MP細胞）を分取し，それぞれの細胞における遺伝子発現についてDNAマイクロアレイ法により解析した。その結果，ウシ子宮内膜上皮細胞におけるSP細胞では組織・上皮増殖や細胞接着，免疫機能に関わる遺伝子の発現量が高いことが明らかとなった。

DOI： 10.14882/jrds.107.0_p-69

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Generation of murine-ES-cell-like iPS cells in cattle using piggyBac transposition of doxycycline-inducible transcription factor 査読

T. Kawaguchi, T. Tsukiyama, N. Minami, M. Yamada, K. Kimura, H. Imai

CiRA International Symposium 2013 ~Raising the next generation of stem cell research~, Kyoto, Japan 2013年3月

ウシにおけるマウスES細胞様iPS細胞の樹立の試み査読

川口高正, 南直治郎, 山田雅保, 木村康二, 今井裕

第1回関西生殖医学集談会 2013年3月

ウシ過剰排卵処置時におけるウシ型キスペプチン‐10の単回末梢投与が性腺刺激ホルモン分泌および卵巣機能に及ぼす影響

松山秀一, 大蔵聡, 大石真也, 木村康二

東日本家畜受精卵移植技術研究会大会資料 29th 39 2013年

Transdifferentiation of bovine aminion cells into trophoblast-like cells using piggyBac transposition of doxycycline-inducible reprogramming factors 査読

T. Kawaguchi, T. Tsukiyama, N. Minami, M. Yamada, K. Kimura, H. Imai

Satellite symposium to the International Congress on Animal Reproduction (ICAR) 2012年7月

ウシの月齢が顆粒層細胞のグルタチオン含量とp38 MAPKのリン酸化に及ぼす影響

竹尾駿, 後藤大也, 木村康二, 岩田尚孝, 門司恭典, 桑山岳人

Journal of mammalian ova research = 日本哺乳動物卵子学会誌 29 ( 2 ) S60 2012年4月

Sexual dimorphism during early embryonic development in mammals

Koji Kimura, Shuichi Matsuyama

Journal of Mammalian Ova Research 29 ( 3 ) 103 - 112 2012年

記述言語：英語掲載種別：書評論文，書評，文献紹介等

Although most sexual dimorphism appears after gonadal differentiation, some occur at earlier stages of development. One example of this phenomenon is the skewing of the sex ratio of embryos due to the glucose concentration of the culture medium. This skewing occurs because male and female embryos differ in their abilities to metabolize glucose. Another example is the sexually dimorphic expression of the bovine embryo-derived signal for maternal recognition of pregnancy, IFNT. The difference in expression of X-linked genes between male and female embryos, that results from incomplete X-chromosome inactivation, is considered to be involved, either directly or indirectly, in the sexual dimorphism that appears during early development. © 2012 Japanese Society of Mammalian Ova Research.

DOI： 10.1274/jmor.29.103

Scopus

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CHANGES IN PLASMA STEROID CONCENTRATIONS DURING GESTATION IN COWS WITH SPONTANEOUS ABORTION OF SOMATIC CELL CLONED FETUSES

M. Hirako, H. Takahashi, K. Kimura, N. Adachi, S. Akagi

REPRODUCTION FERTILITY AND DEVELOPMENT 24 ( 1 ) 121 - 121 2012年

Oog1 promoter controls the meiosis-specific gene expression in germ cells 査読

Ishida M, Okazaki E, Tsukamoto S, Kimura K, Ohota Y, Kito S, Imai H, Minami N

The 45th Annual Meeting of the Society for the Study of Reproduction 2012年

Establishment of induced pluripotent stem cells in cattle using piggyBac transposition of doxycycline-inducible transcription factors

T. Kawaguchi, T. Tsukiyama, K. Kimura, N. Minami, M. Yamada, H. Imai

World Congress on Reproductive Biology (WCRB), Cairns, Australia 2011年10月

Identification of Oog1 Promoter Regions in Mouse Growing Oocytes

Miya Ishida, Eriko Okazaki, Satoshi Tsukamoto, Koji Kimura, Yuki Ohta, Seiji Kito, Hiroshi Imai, Naojiro Minami

BIOLOGY OF REPRODUCTION 85 2011年7月

ウシ妊娠認識時に起きる黄体内でのリンパ管新生に対するIFN-τ関与の可能性

新田あかね, 白砂孔明, 羽田真悟, 松井基純, 清水隆, 松山秀一, 木村康二, HEINRICH Bollwein, 宮本明夫

日本繁殖生物学会講演要旨集 85 225 - 225 2011年7月

記述言語：英語掲載種別：研究発表ペーパー・要旨（国際会議）出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】黄体はプロジェステロンを産生することで妊娠成立・維持に重要な役割を果たす。様々な免疫細胞を含む黄体では免疫応答が起こりうるが，免疫応答にはリンパ管が必須である。また妊娠認識時に胚が産生するインターフェロン(IFN)- τは子宮だけでなく黄体や免疫細胞を含む全身系で作用することがわかってきた。本研究では，「IFN-τが妊娠黄体移行に向けた黄体機能を調節する」という仮説のもと，ウシ黄体におけるリンパ管の存在，妊娠黄体におけるリンパ管の変化とIFN-τのリンパ管内皮細胞に対する作用を調べた。<BR>
【方法】1)食肉処理場由来ウシ黄体の凍結切片を作製し，リンパ管内皮細胞の指標であるLYVE1と血管内皮細胞の指標であるvWF の免疫組織化学染色を行った。2)発情周期 Day 16(C16)，妊娠Day 16(P16)とDay40(P40)のウシ黄体を採取し(n=5-7/区)，LYVE1，リンパ管新生因子VEGFCとその受容体VEGFR3の遺伝子発現とLYVE1タンパク質発現を調べた。3)ウシ内腸骨リンパ管から単離したリンパ管内皮細胞(LyEC)の細胞培養を行い，IFN-τまたはIFN-α添加4時間後のリンパ管関連因子の遺伝子発現を調べ，IFN-τ添加区では細胞増殖率と管腔形成度を調べた(n=3-5)。<BR>
【結果】1)vWFと異なる部位でLYVE1が染色された。2)LYVE1 ，VEGFCとVEGFR3 mRNA発現はC16に比べP16もしくはP40で増加し，LYVE1タンパク質発現はP40で増加した。3)IFN-τはLyECのVEGFC mRNA発現を刺激したが，IFN-αは抑制する傾向があった。またIFN-τはLyECの細胞増殖及び管腔形成を促進した。以上から，ウシ黄体にリンパ管が存在し，妊娠黄体への移行期にリンパ管システムの変化が起きはじめ，IFN-τがウシ黄体内のリンパ管新生を調節する可能性が示された。

DOI： 10.14882/jrds.104.0.225.0

Web of Science

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ウシにおける人工多能性幹細胞の樹立の試み

川口高正, 築山智之, 木村康二, 南直治郎, 山田雅保, 今井裕

第136回日本生殖医学会関西支部集談会、ハービスプラザ、大阪 2011年3月

過剰排卵処置牛における血中プロジェステロン濃度と胚数および胚伸長との関係

松山秀一, 坂口陽祐, 木村康二

日本繁殖生物学会講演要旨集 104 1075 - 1075 2011年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

ウシやヒツジでは、人工授精において妊娠初期、特に発情後5日目の血中プロジェステロン濃度が、その後の胚成長および生存に影響を及ぼすことが示唆されている。ところが、過剰排卵処置牛においては、複数の黄体が形成されるため血中プロジェステロン濃度が著しく高まる一方で、子宮内に存在する胚の数は非常に多く、その血中プロジェステロン濃度と胚伸長との関係については明らかでない。本研究では、過剰排卵処置牛における高濃度の血中プロジェステロンが胚の伸長に及ぼす影響について明らかにするため、過剰排卵処置牛の血中プロジェステロン濃度と発情後13日目または14日目に回収した胚の数およびその長径との関係について検討した。黒毛和種を用いて、黄体期中期に過剰排卵処置を行い、さらにPGF_2α類似体の投与により発情を誘起した。発情確認日（Day 0）の夕方と翌日の朝に人工授精を行い、Day 13またはDay 14に非外科的に胚を回収し、回収胚数およびその長径を測定した。また、経時的に採血し、血中プロジェステロン濃度を測定した。Day 13およびDay 14で回収した胚の長径は、それぞれDay 5における血中プロジェステロン濃度が30-40 ng/mlおよび20-30 ng/mlまではプロジェステロン濃度が高いほど大きくなる一方で、それ以上の濃度になると胚の長径が小さくなる傾向が見られた。また、回収胚数とその長径との関係についても、Day 13およびDay 14に回収した胚の数が、それぞれ11-15個および6-10個までは回収胚数が多いほど胚の長径が大きくなる一方で、それ以上になると胚の長径が小さくなる傾向が見られた。以上の結果から、過剰排卵処置牛においても高濃度の血中プロジェステロンが胚伸長に促進的に働くことが示唆されただけでなく、子宮内に多数の胚が存在する場合には、栄養素の競合が起こるために胚伸長が抑制される可能性が考えられた。

DOI： 10.14882/jrds.104.0.1075.0

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マウス卵母細胞特異的遺伝子Oog1のプロモーター解析

石田未弥, 岡崎永里子, 塚本智史, 木村康二, 太田有紀, 鬼頭靖司, 今井裕, 南直治郎

日本繁殖生物学会講演要旨集 104 1004 - 1004 2011年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】組織特異的プロモーターは遺伝子解析における有用なツールである。卵母細胞特異的プロモーターとしてはZp3およびGdf9プロモーターが成長期の卵母細胞で報告されているが、胎子卵巣内卵母細胞(シスト内卵母細胞)および原始卵胞内卵母細胞における特異的な活性を示すプロモーターは未だ報告されていない。本研究においては、卵母細胞において胎齢15.5日から特異的に発現する遺伝子Oog1の上流領域から胎子卵巣内卵母細胞中で転写活性を持つプロモーター配列の同定を目的とした。【方法】ゲノム上に存在する5コピーのOog1遺伝子の上流配列から長さの異なる2種類のプロモーター候補配列（2.7 kb,および3.9 kb）を単離した。これらの候補配列の下流にGFP遺伝子を組み込んだ遺伝子組換えマウスを作製し、卵母細胞におけるGFPの発現解析に基づくプロモーター活性の評価を行った。【結果】2種類の配列を用いた遺伝子組換えマウスの成体卵巣の凍結切片を作製し、GFPシグナルを観察した結果、2.7 kbの配列を用いた組換えマウス系統ではGFPのシグナルは2次卵胞以降の卵胞内卵母細胞で検出された。一方3.9 kbの配列を用いた系統においては１次卵胞以降の卵胞内卵母細胞でシグナルが検出され、2.7 kbの配列を用いた場合よりも強いプロモーター活性が観察された。また、卵巣のRT-PCRの結果、2種類の候補領域は共に胎齢15.5日の胎子卵巣でGFP mRNAの発現を誘導することが明らかとなった。3.9 kbプロモーターには2つのNobox Binding Elementが存在するため、これによってプロモーター活性が増強した可能性が考えられる。本研究によって明らかとなったOog1のプロモーター領域は胎子卵巣内卵母細胞において転写活性を示し、早期に発現を開始する卵母細胞特異的遺伝子の機能解析に有用である。また、その発現制御機構のさらなる解析によって生殖細胞特異的遺伝子の発現調節機構の解明に新たな知見をもたらすものと考えられる。

DOI： 10.14882/jrds.104.0.1004.0

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Identification of Oog1 Promoter Regions which Function During the First Meiosis in Oocytes. 査読

Eriko Okazaki, Satoshi Tsukamoto, Koji Kimura, Yuki Ohta, Seiji Kito, Hiroshi Imai, Naojiro Minami

BIOLOGY OF REPRODUCTION 170 - 170 2010年

The Relationship Between Pregnancy Status and Production of IFN-Tau of Bovine Conceptus by Measuring Expression of Interferon- Stimulated Gene 15 (ISG15) of Peripheral Leukocyte in Cattle

Shuichi Matsuyama, Takatoshi Kojima, Satoshi Kato, Shogo Shiratsuki, Hiroshi Tanaka, Keiichi Nagataki, Shoichi Hoshi, Koichi Muroi, Koji Kimura

BIOLOGY OF REPRODUCTION 152 - 152 2010年

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