研究者詳細 - 木村　康二

MISC - 木村　康二

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ウシの子宮内膜老化細胞に対するBPTESの効果と作用機序の解明

千田鈴乃, 市川怜, 山田直季, 中村翔, 大蔵聡, 伊東楓, 杉野耀亮, 木村康二, 木村康二, 松山秀一

日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web) 47th 2024年

3次元培養法を用いたウシ子宮腺管腔構造の形成

杉野耀亮, 藤原希, 山本ゆき, 木村康二

組織培養研究(Web) 42 ( 2 ) 2024年

エストラジオール-17βによる直接的な卵管平滑筋収縮弛緩運動制御

窪田早耶香, 大河原里紗, 木村康二, 木村康二

日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web) 46th 2023年

ウシ子宮腺の3次元培養におけるゲル組成や添加因子がその形態変化に与える影響

杉野耀亮, 佐藤太紀, 藤原希, 木村康二

日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web) 46th 2023年

ウシ未成熟精巣の器官培養における精原細胞の増殖とセルトリ細胞機能の評価

清水亮佑, 山本ゆき, 木村康二, 永岡謙太郎

日本畜産学会大会講演要旨 131st 2023年

牛過剰排卵処置の簡易化

木村康二

臨床獣医 41 ( 7 ) 2023年

上皮成長因子による3次元培養下でのウシ子宮腺の形態学的変化

杉野耀亮, 佐藤太紀, 藤原希, 木村康二, 木村康二

日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web) 45th 2022年

収縮能を維持した卵管平滑筋細胞の培養技術の開発

窪田早耶香, 山本ゆき, 山本ゆき, 木村康二

日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web) 45th 2022年

ウシ子宮腺による精子誘引

渡邊りお, 渡邊りお, 宗友真帆, 杉野耀亮, 木村康二

日本畜産学会大会講演要旨 130th 2022年

ポビドンヨード子宮内投与後のウシ子宮内膜における遺伝子発現変化およびside population細胞の変遷

舘林亮輝, 舘林亮輝, 中村翔, 北川悠梨, 加治佐実希, 市川怜, 森田康広, 森田康広, 大蔵聡, 木村康二, 松山秀一

日本繁殖生物学会講演要旨集(Web) 114th P-59 - P-59 2021年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

ポビドンヨードの子宮内投与は，殺菌作用の他に子宮内膜上皮の剥離・再生を誘導することが報告されており，畜産現場においてはウシの受胎性を回復させる目的でポビドンヨードの子宮内投与が行われている。我々はこれまでに，幹細胞・前駆細胞様の特徴を持つウシ子宮内膜side population（SP）細胞が分娩後の子宮内膜再生に寄与する可能性を報告している。本研究では，ポビドンヨード投与後の子宮内膜再生機序を明らかにすることを目的に，ポビドンヨードのウシ子宮内投与後の子宮内膜細胞における遺伝子発現変化および子宮内膜SP細胞の変遷を分娩後の子宮内膜再生過程と比較，検討した。正常な発情周期を示す黒毛和種牛（11頭）を用い，発情後7日目に50 mLの2%ポビドンヨード液を各子宮角に50 mLずつ投与した。投与日を0日とし，0（投与前），2，7，14日目に子宮内膜組織をバイオプシー鉗子にて採取した。また，分娩後の黒毛和種牛（6頭）から，分娩後10，30，50，100日目に子宮内膜組織をバイオプシー鉗子にて採取した。子宮内膜組織から細胞を単離し，Hoechst33342で染色後，フローサイトメトリー解析を行い，SP細胞の割合を算出した。ポビドンヨード投与前に0.332%だったSP細胞の割合は投与後7日目（0.778%）に増加し，その後14日目（0.334%）には減少した。一方，分娩後におけるSP細胞の割合は，分娩後10日目に最も低い割合となり，分娩後100日目まで徐々に増加していた。これらの結果から，ポビドンヨード投与後は分娩後とは異なるSP細胞の変遷を経ることが示された。また，マイクロアレイ解析により，経時的に発現が変動した遺伝子について比較したところ，ポピドンヨード投与後および分娩後に共通して変動する遺伝子は少ないことが明らかとなった。以上の結果から，ポビドンヨードを子宮内に投与した後の子宮内膜再生は，分娩後のものとは異なる機序である可能性が示された。

DOI： 10.14882/jrds.114.0_p-59

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3次元培養におけるウシ子宮腺様構造の形成と関与する因子

杉野耀亮, 佐藤太紀, 藤原希, 山本ゆき, 山本ゆき, 木村康二, 木村康二

日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web) 44th 2021年

3次元培養したウシ卵管上皮細胞は生体組織とは異なる特有の性質を持つ

杉野耀亮, 伊藤さやか, 山本ゆき, 木村康二

日本繁殖生物学会講演要旨集(Web) 114th OR-29 - OR-29 2021年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】卵管上皮組織における繊毛細胞と非繊毛細胞の構成比は発情ステージを通して変化し，胚輸送や発達のための最適な環境を生み出している。その詳細なメカニズムは未だ不明であるが，生体組織をそのまま用いてそのメカニズムを解明することは困難であるため，3次元培養法による体外モデルの作出が必要となる。卵管のような管腔を有する組織の上皮細胞は3次元培養下で生体組織を再現するシスト（内腔有する細胞塊）を形成する。本研究は，体外ウシ卵管上皮モデルの確立を目指し，ウシ卵管上皮細胞シストの性質を免疫組織化学にて評価した。【方法】ウシ卵管を4つの発情ステージに区分し（Irelandら, 1980），各ステージの卵管膨大部上皮細胞を 2% マトリゲル含培養液で培養した。形成したシストの Cytokeratin，Vimentin，FOXJ1，PAX8 および Acetylated-α-tubulin（AcTUB）発現を免疫組織化学を用いて検討し，上皮間葉系細胞の区分，シスト1つあたりの FOXJ1，PAX8 および AcTUB 陽性/陰性細胞割合を発情ステージ間で比較すると同時に AcTUB の局在を評価した。【結果・考察】全てのシストは Cytokeratin 陽性細胞のみで構成されていたが細胞形態の扁平化や多層化が認められた。生体組織とは異なりシスト1つあたりの FOXJ1 陽性/PAX8 陰性細胞，FOXJ1 陰性/PAX8 陽性細胞および AcTUB 陽性/FOXJ1 陽性細胞割合は発情ステージを通して変化せず，生体組織には存在しない PAX8 陽性/FOXJ1 陽性細胞や PAX8 陰性/FOXJ1 陰性細胞が認められた。また，生体組織には見られない AcTUB の細胞内凝集やシストを構成する細胞の内腔側だけでなく外部側での存在も認められた。以上から，本研究において体外で作出したウシ卵管上皮細胞シストは生体組織とは異なる性質を持つことが示唆された。

DOI： 10.14882/jrds.114.0_or-29

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J-GLOBAL

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当帰芍薬散による卵管緊張度上昇反応のメカニズムの検討

窪田早耶香, 山本ゆき, 木村康二

日本繁殖生物学会講演要旨集 114 OR-28 - OR-28 2021年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】適切なタイミングでの配偶子や胚の卵管輸送は妊娠の成立に不可欠であり，これは卵管平滑筋の収縮弛緩運動によって制御されている。ヒト不妊の改善法の一つとして当帰芍薬散（TSS）が処方されているが，その科学的根拠は定かでない。TSS は卵管収縮弛緩運動の促進因子として働くエストラジオール-17β（E2）様作用を有するため，E2 の受容体を介して卵管輸送能の向上に貢献する可能性がある。本研究では，TSS がG protein-coupled estrogen receptor 1（GPER1）を介してウシ卵管収縮弛緩運動に与える影響を検討した。【方法】卵巣の所見によりウシ卵管峡部を排卵直後，黄体期，排卵前の 3 つのステージに分け，長軸方向で収縮試験（マグヌス法）を行った。低濃度（100 µg/ml）および高濃度（1000 µg/ml）TSS エキス添加後1時間までの各ステージの卵管における収縮頻度，収縮弛緩力，緊張度を経時的に測定した。また，TSS 添加 20 分前に低濃度（2.5 µM）および高濃度（25 µM）の GPER1 アンタゴニスト（G-15）を添加し，同様に測定した。さらに，ウエスタンブロット法を用いて各ステージの卵管平滑筋における GPER1 のタンパク質発現量を測定した。【結果・考察】TSS は，どのステージの収縮頻度および収縮弛緩力にも有意な変化を及ぼさなかった。一方で，全てのステージにおいて有意な緊張度の増加が認められ，特に排卵直後の卵管においてその効果が高かった（P < 0.05）。また，TSS と G-15 の共添加では，高濃度 G-15 添加区において TSS 誘導性の緊張度増加は有意に抑制された（P < 0.05）。GPER1 のタンパク質発現量はステージ間で有意な差が見られなかった。以上の結果より，TSS は GPER1 を介して緊張度を増加させることで卵管収縮弛緩運動に影響する可能性がある。しかし，ステージ間で TSS の効果が異なるメカニズムについては未だ明らかとなっていないため，さらなる検討が必要である。

DOI： 10.14882/jrds.114.0_or-28

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排卵前のウシ卵管峡部収縮の増大におけるギャップ結合の関与

山本ゆき, 窪田早耶香, 木村康二

日本繁殖生物学会講演要旨集 114 OR-27 - OR-27 2021年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】哺乳動物の卵管峡部は，受精前は精子を，受精後には初期胚を輸送する。この輸送には平滑筋収縮が重要であり，排卵前後に活発になると言われているがその詳細は明らかでない。筋収縮は，電気刺激の発生と細胞間伝達，筋細胞の収縮という過程からなり，我々はこれまでに複数のイオンチャネルとギャップ結合がウシ卵管自発収縮に関与することを確認している。本研究ではこれらの因子が発情周期中の卵管収縮制御に関与するかを検討し，卵管収縮制御機構の一端を明らかにすることを目的とした。【材料と方法】1) 排卵直後（E:排卵1–4日後），黄体中後期（ML:排卵11–17日後），排卵前（F: 排卵1–3日前）のウシ卵管峡部を用いてマグヌス法による収縮試験を行い，各発情ステージにおける長軸方向の収縮頻度および振幅を検討した。2) ウシ卵管自発収縮に関与すると推定されるイオンチャネル（Cacna1c, IPTR1, RyR3, ATP2A2, ANO1, KCNN2, KCNN3）とギャップ結合因子（Cx43）について，定量的RT-PCR 法により卵管峡部平滑筋組織におけるmRNA発現量を検討した。3) 発情ステージ間で遺伝子発現量の異なる因子を選抜し，ウェスタンブロット法によりタンパク質発現量を検討した。【結果および考察】1）発情ステージ間で，収縮頻度に有意な差は認められなかった。一方，振幅はE，ML期に対しF 期で有意に高い値を示した。排卵前の卵管峡部における振幅の増大は，精子輸送をサポートすると考えられる。2) 振幅制御に関与する各因子の遺伝子発現量を検討したところ，Cx43がF期においてML期より有意に高かった。他の因子では有意な差は認められなかった。3) Cx43タンパク質発現量は，F期でE 期よりも有意に高い値を示した。以上より，ウシ卵管峡部平滑筋において振幅の増大する排卵前にギャップ結合タンパク質の発現量が増加することが示された。ギャップ結合による細胞間刺激伝達の増加が，排卵前の振幅増大を引き起こすメカニズムの一つであると推察された。

DOI： 10.14882/jrds.114.0_or-27

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ウシの子宮内膜における精子走化性因子発現の検討

宗友真帆, 酒井駿介, 山本ゆき, 木村康二

The Journal of Reproduction and Development 66 ( Suppl. ) j78 - j78 2020年9月

記述言語：日本語出版者・発行元：(公社)日本繁殖生物学会

【目的】ウシにおいて腟内に射精された精子は子宮内を通り，卵管へ運ばれる。子宮内における卵管付近までの精子輸送には平滑筋の関与が報告されているが，その詳細は完全には明らかになっていない。一方，ヒト卵胞液由来のRANTESや，ウシの卵管や顆粒膜細胞由来のSDF1などのケモカインが，受精時に精子を誘引する走化性因子として機能することが近年報告されている。このことから，子宮内における精子輸送にもこれらのケモカインが走化性因子として関与しているのではないかと考え，本研究では，発情周期中のウシ子宮内膜組織におけるケモカイン発現の変化について検討した。【方法】食肉センター由来の子宮を，卵巣の肉眼的所見によってウシの発情周期を4つに分類した（排卵日= 0日，Stage I: 1～4日，Stage II: 5～10日，Stage III: 11～17日，Stage IV: 18～20日）。各Stageの主席卵胞もしくは黄体と同側のウシ子宮角上端における子宮内膜を採取し，SDF1およびRANTES mRNA発現量の変化を定量的RT-PCR法を用いて検討した。【結果】子宮内膜組織におけるSDF1 mRNA発現は発情周期すべてのステージで見られ，Stage IVの子宮内膜組織におけるSDF1 mRNA発現はStage IIとStage IIIに比べ有意に高かった。Stage Iの子宮内膜組織においてSDF1 mRNA発現はStage IIとStage IIIと比べ高い数値を示したが，有意な差は見られなかった。SDF1と同じく，子宮内膜組織におけるRANTESのmRNA発現は発情周期すべてのステージで検出されたが，Stage間での有意な差は認められなかった。以上より，これらの走化性因子が子宮角上端付近に発現し，精子の誘引に関係している可能性が示された。さらに，SDF1は発情前後に発現が増加していたことからエストラジオール17βなどの性ステロイドホルモンの影響を受けて発現が制御される可能性が示された。

DOI： 10.14882/jrds.113.0_p-67

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ウシ子宮内膜side population(SP)細胞の遺伝子発現解析と分娩後におけるSP細胞割合の推移

舘林亮輝, 中村翔, 美辺詩織, 古澤軌, 阿部良哉, 加治佐実希, 森田康広, 大蔵聡, 木村康二, 松山秀一

The Journal of Reproduction and Development 66 ( Suppl. ) j41 - j41 2020年9月

当帰芍薬散がウシ卵管収縮弛緩運動に与える影響

窪田早耶香, 山本ゆき, 木村康二

The Journal of Reproduction and Development 66 ( Suppl. ) j75 - j75 2020年9月

記述言語：日本語出版者・発行元：(公社)日本繁殖生物学会

【目的】初期胚や配偶子の輸送には卵管収縮弛緩運動が不可欠であり，その異常は不妊の原因の1つと考えられている。婦人科系の諸症状を改善する三大漢方薬の1つとして知られている当帰芍薬散（TSS）は，当帰・芍薬・川芎・茯苓・蒼朮・沢瀉の6つの成分から構成されている。TSS は，プロスタグランジン（PG）F2α惹起の子宮収縮を抑制する作用や，エストロジェンレセプター (ER)αや ERβを介さないE2様作用を示す。また，TSS 構成成分の一つである当帰や芍薬中のペオニフロリンが卵管収縮弛緩因子である PGE2 産生を抑制することから，TSS と卵管収縮弛緩因子との関連性が示唆されている。本研究では，TSS の卵管収縮弛緩運動を改善させる不妊治療への有用性を明らかにする目的で，TSS がウシ卵管収縮に与える影響を検討した。【方法】ウシ卵管峡部組織を子宮側から5 mm ずつ 3 片に切り取り，マグヌス法を用いてクレブスリンガー液（KRS）で溶解した TSS エキス（100 µg/ml, 1000 µg/ml）添加後1時間までの収縮頻度，振幅，緊張度を経時的に測定した。使用したウシ卵管組織は，卵巣の所見により排卵直後，黄体期，排卵前の3つのステージに分け，各ステージの TSS の影響を検討した。【結果・考察】収縮頻度および振幅は，どのステージにおいても有意な変化は見られなかった。一方で，緊張度は全ステージで有意に亢進した（P < 0.05）。排卵直後の卵管では対照区に対して100 µg/ml および1000 µg/ml TSS エキス添加で，その他の卵管では1000 µg/ml TSS エキス添加でのみ緊張度の有意な亢進が観察された（P < 0.05）。TSS エキス添加前からの経時的な変化を検討したところ，排卵直後の卵管では添加 9 分後以降，その他の卵管では添加 30 分後以降に有意な上昇が認められた（P < 0.05）。以上の結果から，TSS は緊張度を亢進させることでウシ卵管収縮運動を促進しており，特に排卵直後の卵管において，その効果が高いことが示された。

DOI： 10.14882/jrds.113.0_p-62

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培養ウシ卵管平滑筋細胞のCa2+変動解析

山本ゆき, 石本健太, 木村康二

The Journal of Reproduction and Development 66 ( Suppl. ) j76 - j76 2020年9月

記述言語：日本語出版者・発行元：(公社)日本繁殖生物学会

【目的】卵管は平滑筋の自発的な収縮弛緩運動によって配偶子や初期胚を輸送する。筋収縮には細胞内Ca²⁺濃度の上昇が必須であり，我々はこれまでに，培養ウシ卵管平滑筋細胞が自発的なCa²⁺変動を示すことを見出している。しかしその変動パターンや制御機構は明らかでない。本研究では培養卵管平滑筋細胞のCa²⁺変動パターンやCa²⁺濃度上昇に関与するメカニズムを検討し，卵管平滑筋細胞の収縮活動制御機構を明らかにすることを目的とした。【方法】ウシ卵管峡部より単離，培養した平滑筋細胞のライブセルCa²⁺イメージングを実施した。撮影した動画を用いて，1）Spatio-Temporal Mapping 解析による細胞内Ca²⁺上昇の伝播パターン，2）低密度（<70% コンフルエント）および高密度（>100%コンフルエント）状態における培養平滑筋細胞のCa²⁺上昇パターンとCa²⁺パルス頻度，3）電位依存性Ca²⁺チャネル（VDCC），IP₃受容体，リアノジン受容体の阻害剤が培養平滑筋細胞のCa²⁺変動に与える影響，について検討した。【結果】1）細胞内Ca²⁺変動には，同時に細胞全体のCa²⁺濃度が上昇するFlashと，細胞の端から逆方向へウェーブ状に伝播するWaveの2種類のパターンが認められた。2）低密度の状態では，WaveよりFlashを示す細胞数が有意に多かったが，高密度の状態ではWaveを示す細胞数が増加した。また，Wave を示す細胞のCa²⁺パルス頻度が低密度状態に対して高密度において有意に高かった。一方，Flash を示す細胞のパルス頻度は密度によって変化しなかった。細胞間接着がCa²⁺Waveの発生に関与することが推察された。3）VDCCおよびリアノジン受容体阻害剤は細胞内Ca²⁺変動に影響を及ぼさなかったが，IP₃受容体阻害剤は直ちにCa²⁺パルスを数分間停止させた。培養ウシ卵管平滑筋細胞の自発的Ca²⁺変動は，小胞体上のIP₃受容体の開口によって発生することが示唆された。

DOI： 10.14882/jrds.113.0_p-63

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ウシ卵管上皮細胞の3次元培養における細胞凝集体およびシスト形成能の評価

杉野耀亮, 伊藤さやか, 佐藤太紀, 酒井駿介, 梅原依吹, 窪田早耶香, 宗友真帆, 山本ゆき, 木村康二

The Journal of Reproduction and Development 66 ( Suppl. ) j76 - j76 2020年9月

記述言語：日本語出版者・発行元：(公社)日本繁殖生物学会

【目的】卵管は子宮と卵巣の間に位置し，胚の輸送や発達などの生殖機能の維持に重要である。この上皮組織は主に繊毛細胞と分泌細胞で構成され，その細胞構成比は発情周期によって変化することが明らかとなっているが，未だこの詳細なメカニズムは不明である。そこで我々はこれを解明するために，卵管上皮組織を体外で再現することに着目した。一般的に，上皮細胞は細胞外基質内での3次元培養下で細胞凝集体を形成後，立体的な胞状構造（シスト）を形成することで知られる。本研究は，ウシ卵管上皮細胞を3次元培養し，細胞凝集体およびシスト形成能を評価した。【方法】食肉センター由来のウシ卵管を卵巣の肉眼的所見をもとに4つの発情周期（stageⅠ～Ⅳ）に区分した（Irelandら, 1980）。各発情周期の卵管膨大部から上皮組織を回収し，酵素処理および濾過より細胞懸濁液を得た。2%マトリゲル，10% FBS加DMEM/F12で再懸濁後，マトリゲルでコートした48穴プレートに 1.0, 2.5, 5.0×10⁵ cells/well となるよう播種した。14日間培養後，実体顕微鏡下で細胞凝集体および内腔を有する細胞外層が明瞭な構造体（シスト）を回収し，それぞれの形成数およびシスト形成率・外径を評価した。【結果・考察】どの発情周期の卵管上皮細胞においても凝集体およびシストは形成された。凝集体形成数はstageⅠからstageⅢにかけて有意に減少し（P<0.05），stageⅢとstageⅣでは同程度だった。また細胞播種濃度依存的に有意に増加した（P<0.05）。一方，シスト形成数，形成率および外径は発情周期間で有意な差はなかったが，細胞播種濃度依存的に有意に増加した（P<0.05）。以上から，発情周期の変化は細胞凝集体形成に影響する一方で，シスト形成能には影響しないことが示され，各発情周期のウシ卵管上皮細胞には一様にシストを形成する能力があると考えられる。

DOI： 10.14882/jrds.113.0_p-64

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暑熱環境下におけるウシ子宮内膜間質細胞は小胞体ストレス応答経路を介してIL-6発現を増加させる

酒井駿介, 山本ゆき, 木村康二

The Journal of Reproduction and Development 66 ( Suppl. ) j41 - j41 2020年9月

記述言語：日本語出版者・発行元：(公社)日本繁殖生物学会

【背景】分娩後のウシは子宮腔への細菌侵入により子宮内膜炎を発症する。これに対し，子宮内膜細胞は細菌を認識してIL-6を分泌し，免疫細胞を子宮内膜上皮層まで誘引することで子宮内膜炎は治癒する。子宮内膜炎を夏季に発症した場合，症状の長期化が報告されており，申請者は暑熱環境下の子宮内膜間質細胞におけるIL-6産生増加がこの一因である可能性を示してきた。ストレス下の細胞内では変性タンパク質が増加し，小胞体ストレスを生じる。様々な疾患においても小胞体ストレスはIL-6の過剰分泌を伴う慢性炎症の原因となる。本研究では，暑熱環境下で培養した子宮内膜間質細胞における小胞体ストレスの有無，小胞体ストレスとIL-6産生の関係性を検討した。【材料】単離した子宮内膜間質細胞にリポ多糖（LPS）を添加し，38.5℃もしくは40.5℃で培養し，BiP mRNA発現（小胞体ストレスマーカー）を定量的RT-PCR法によって測定した。さらに，間質細胞にLPSと同時に各種小胞体ストレス応答経路阻害剤（Toyocamycin，KIRA6およびSalubrinal），または小胞体ストレス促進剤（NaF）をそれぞれ添加後，38.5℃もしくは40.5℃で培養し，IL-6 mRNA発現の変化を定量的RT-PCR法を用いて測定した。【結果】暑熱環境下で培養した子宮内膜間質細胞においてBiP mRNA発現は有意に増加した。また，暑熱によるIL-6 mRNA発現増加は各種小胞体ストレス応答経路阻害剤により有意に抑制された。さらに，NaF添加により，暑熱環境下における間質細胞のIL-6 mRNA発現は変化しない一方で，38.5℃で培養した間質細胞においてIL-6 mRNA発現は有意に増加し，暑熱環境下での発現レベルと有意な差は見られなかった。以上の結果から，ウシ子宮内膜間質細胞は暑熱環境下において小胞体ストレス応答経路を介して過度にIL-6を分泌し，夏季の子宮内膜炎症状長期化の一因となる可能性が考えられる。

DOI： 10.14882/jrds.113.0_aw1-3

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