研究者詳細 - 木村　康二

【Female genital tractの収縮を再考する】卵管の平滑筋収縮

木村康二

HORMONE FRONTIER IN GYNECOLOGY 26 ( 3 ) 185 - 189 2019年9月

記述言語：日本語出版者・発行元：(株)メディカルレビュー社

卵管の平滑筋の運動は配偶子や胚の輸送を担う重要な機能の1つである。卵管の平滑筋は自律的な収縮弛緩による蠕動運動を行うことで輸送機能は果たしている。消化管と同じくある種のペースメーカー細胞の存在が示唆されているが、その詳細はいまだ解明されていない。また、卵管の平滑筋による輸送機能は性周期に依存して変化しており、これは卵巣由来の性ステロイドホルモンの直接または間接的な影響によるものと考えられている。(著者抄録)

DOI： 10.34449/j0015.26.03_0029-0033

CiNii Books

排卵前後のウシ卵管上皮における繊毛形成過程の進行

伊藤さやか, 山本ゆき, 木村康二

The Journal of Reproduction and Development 65 ( Suppl. ) j83 - j83 2019年9月

記述言語：日本語出版者・発行元：(公社)日本繁殖生物学会

【目的】卵管上皮には繊毛細胞および分泌細胞（非繊毛細胞）が存在し，両細胞の割合は発情周期を通じて変化する。我々は，繊毛細胞の割合が増加するにもかかわらず分裂するのは非繊毛細胞のみであること（Ito ら, 2016），卵管上皮には非繊毛細胞から繊毛細胞への段階的な細胞が存在すること（第111回大会）を明らかにしており，非繊毛細胞が繊毛細胞へと分化することを示唆してきた。本研究では，繊毛形成過程に注目した卵管上皮細胞の詳細なキャラクタリゼーションを行うことにより，ウシ卵管における非繊毛細胞から繊毛細胞への分化経路のさらなる検討を行った。【方法】各発情周期のウシ卵管膨大部上皮組織におけるKi67，Acetylated tubulin（Ac tubulin: 繊毛マーカー），繊毛形成に必須の転写因子FOXJ1およびMYB，細胞周期の制御に関わる転写因子PAX8の共局在を免疫組織化学により検討し，上皮組織内腔表面1 mmあたりの細胞数の変化を調べた。その後各発情周期の卵管上皮細胞におけるMYBおよびFOXJ1 mRNA 発現を調べた。【結果】全ての卵管上皮細胞はPAX8かFOXJ1を発現し，共発現する細胞は存在しなかったが，FOXJ1⁺細胞中にはAc tubulin⁺細胞とAc tubulin^-細胞が存在した。よって，非繊毛細胞はPAX8⁺細胞とFOXJ1⁺細胞に分類されることが明らかとなった。非繊毛細胞中にはMYB⁺/PAX8⁺またはMYB⁺/FOXJ1⁺細胞が存在し，MYB⁺/Ki67⁺細胞は認められなかった。Ki67⁺および MYB⁺細胞数は卵胞期に増加した。卵管上皮細胞におけるMYB mRNA発現は卵胞期に有意に減少した一方，FOXJ1 mRNA発現は増加した。このことから，排卵前後に卵管上皮構成細胞が大きく変化すると同時に繊毛形成関連遺伝子の発現も変動することが明らかとなった。本研究より，ウシ卵管上皮の一部の非繊毛細胞は排卵前に繊毛形成過程に入り，排卵後に繊毛形成が完了することが示唆された。

DOI： 10.14882/jrds.112.0_or2-11

ウシ子宮内膜細胞によるマクロファージ誘引に対する暑熱ストレスの影響

酒井駿介, 山本ゆき, 木村康二

The Journal of Reproduction and Development 65 ( Suppl. ) j128 - j128 2019年9月

記述言語：日本語出版者・発行元：(公社)日本繁殖生物学会

【背景】分娩後子宮腔への細菌侵入によりほぼすべてのウシは子宮内膜炎を発症する。これに対し，子宮内膜細胞は様々なマクロファージ（MΦ）誘引物質を分泌し，主要感染部位である子宮内膜上皮層へMΦを呼び込み，細菌を除去することで子宮内膜炎を治癒する。しかし，夏季に子宮内膜炎を発症した場合，症状が長期化し，夏季不妊の一因と考えられている。本研究ではこの夏季の子宮内膜炎治癒の遅延は暑熱ストレスによる子宮内膜の免疫機能低下によると仮定し，暑熱環境下での子宮内膜細胞の免疫反応および MΦの走化性を検討した。【方法】単離した子宮内膜上皮および間質細胞にリポ多糖（LPS）を添加後，38.5°Cまたは 40.5°Cで培養した。培養終了後，MCP1 の遺伝子発現および上清中の濃度を定量的 RT-PCR または EIA によってそれぞれ測定した。また，ウシ静脈血から単離した単球をMΦに分化後，38.5°Cまたは 40.5°Cで培養し，CCR2 遺伝子発現を定量的 RT-PCR により測定するとともに，暑熱環境下でのMΦの走化性を Migration Assay によって検討した。【結果】38.5°Cで培養した子宮内膜上皮および間質細胞において MCP1 遺伝子発現は LPS により有意に増加した。しかし，40.5°Cで培養した上皮細胞において LPS 刺激性 MCP1 遺伝子発現は有意に抑制され，反対に間質細胞では有意に増加した。また，上皮細胞において MCP1 分泌は暑熱ストレスおよび LPS の有無にかかわらず検出限界以下だった（<0.15 ng/ml）。一方，38.5°Cで培養した間質細胞において LPS 刺激性 MCP1 産生は暑熱ストレスによって有意に増加した。また，MΦにおける CCR2 遺伝子発現および走化性に暑熱ストレスは影響しなかった。以上のことから，暑熱ストレスは MΦ の遊走性に影響しない一方，子宮内膜間質細胞の MCP1 産生を増加させることで，MΦが上皮層へ誘引されず，間質層に留まり，夏季の子宮内膜炎症状が長期化する一因となることが示唆された。

DOI： 10.14882/jrds.112.0_p-69

ウシ子宮内膜side population細胞における幹細胞マーカーの発現解析

舘林亮輝, 中村翔, 美辺詩織, 古澤軌, 阿部良哉, 森田康広, 大蔵聡, 木村康二, 松山秀一

The Journal of Reproduction and Development 65 ( Suppl. ) j133 - j133 2019年9月

記述言語：日本語出版者・発行元：(公社)日本繁殖生物学会

【目的】ウシの子宮内膜は分娩時の胎盤剥離とともに大きく損傷する一方で，速やかに再生されることにより再び受胎可能な状態となる。この子宮内膜の再生時に生じる不具合が受胎性の低下を引き起こすと考えられるが，ウシの分娩後における子宮内膜再生メカニズムは未だ明らかでない。子宮は中胚葉由来の組織であり，ヒトの月経周期毎に起こる子宮内膜更新には子宮内膜の間葉系幹細胞が関与することが示唆されている。我々は，組織幹細胞の集団として考えられているside population細胞（SP細胞）がウシ子宮内膜間質細胞に存在することを明らかにしており，ウシの分娩後においても子宮内膜の間葉系幹細胞が子宮内膜再生に寄与する可能性が考えられた。本研究では，ウシ子宮内膜SP細胞が幹細胞の特徴を有することを確認するため，SP細胞およびmain population細胞（MP細胞）における幹細胞マーカー遺伝子の発現量を比較，検討した。【方法】食肉センター由来のウシ子宮（n=4）からコラゲナーゼ処理により子宮内膜間質細胞を単離した。Hoechst33342にて染色後，フローサイトメトリー解析により蛍光強度の低い領域に突出した細胞集団として確認した細胞のうち，ABCG2の阻害剤であるベラパミル存在下で消失した細胞をSP細胞として同定した。また，蛍光強度が高い主要な細胞集団をMP細胞として，セルソーターにより各細胞をそれぞれ分取した。各々の細胞でRNAを抽出し，qRT-PCR法を用いて，間葉系幹細胞マーカー遺伝子であるMCAMおよびABCG2のmRNA発現量を測定した。【結果】今回採取した子宮内膜間質細胞におけるSP細胞の割合は，2.13±0.43%であった。SP細胞におけるMCAM mRNA発現量は，MP細胞と比較して有意に高かった（P<0.05）。また，ABCG2 mRNA遺伝子発現量についてはSP細胞で高い傾向にあった（P=0.053）。これらの結果から，SP細胞の遺伝子発現は間葉系幹細胞としての特徴を持つことが示唆された。

DOI： 10.14882/jrds.112.0_p-79

ウシ卵管培養平滑筋細胞におけるカルシウムオシレーション制御メカニズムの探索

山本ゆき, 黒川真帆, 木村康二

The Journal of Reproduction and Development 65 ( Suppl. ) j134 - j134 2019年9月

記述言語：日本語出版者・発行元：(公社)日本繁殖生物学会

【背景】卵管などの平滑筋組織は一般的に，様々なイオンおよびイオンチャネルによって律動的な自発収縮を生み出している。著者らはこれまでに，ウシ卵管組織片を用いて自発収縮に関与するイオンチャネルを明らかにした。さらに詳細な細胞機能を検討するため，培養卵管平滑筋細胞のカルシウム変動を観察したところ様々なパターンの自発的オシレーションが認められた。細胞内カルシウム濃度の上昇は筋収縮を引き起こすことから，このオシレーション制御機構の検討は自発収縮発生メカニズムの解明につながる。そこで培養ウシ卵管平滑筋細胞のカルシウムオシレーションを制御する機構について，1) カルシウムチャネル［電位依存性カルシウムチャネル（VDCC）および小胞体上カルシウムチャネル（IP3Rおよび RyR）］，2) 卵管収縮を亢進するホルモン（オキシトシン:OT），3) 細胞密度の関連，を検討した。【結果および考察】1) 卵管組織の自発収縮を抑制したVDCCブロッカーの添加，または IP3R阻害剤とRyR阻害剤の共添加では，コントロールと同様に時間に伴いオシレーション回数が低下した。オシレーションに必要なカルシウム供給経路について他のチャネルや機構の可能性が考えられた。2) OT添加後1–2 分においてわずかにオシレーション頻度が上昇した。しかし細胞個々に解析すると，細胞によってOTへの反応が異なることが明らかとなった。OT受容体発現の有無や細胞周期との関係など，細胞の状態の違いを検討する必要がある。3) コンフルエント前（<70%）とコンフルエントの状態でカルシウム変動周期を解析および比較したところ，コンフルエント状態において高頻度の周期を示す細胞が有意に増加した。このことから細胞密度の増加がカルシウムオシレーションの頻度制御に関与していることが明らかとなった。その詳細なメカニズムについては今後検討を進める。

DOI： 10.14882/jrds.112.0_p-82

インターフェロン-τ化学合成ペプチドによるウシ子宮内膜細胞活性リガンド領域の探索

ウシ主席卵胞および次席卵胞の顆粒層細胞において発現する遺伝子の網羅的解析

大下雪奈, 渡辺雄貴, 春日崇, 中平陽子, 棟朝亜理紗, 木村康二, 松山秀一, 大蔵聡, 真方文絵, 松田二子

日本獣医学会学術集会講演要旨集 162回 439 - 439 2019年8月

鈴木惇文, 木村康二, 唄花子, 川原学, 高橋昌志

北海道畜産草地学会報 7 ( 1 ) 7 - 15 2019年

記述言語：英語出版者・発行元：北海道畜産草地学会

インターフェロン-τ（IFN-τ：195 aa）は反芻動物特異的に分泌される分子であり、妊娠認識及び妊娠の成立に重要な役割を持っている。IFN-τの研究には組換え体が用いられている。しかし、組換え体は作製、入手の難しさや様々な法律による生体投与への使用制限のため、生体研究の妨げとなっている。そこで、本研究では組換え体に変わるIFN-τ構成ペプチドを化学合成し、活性リガンド部位の探索並びに、効果の評価検証を目的とした。IFN-τのアミノ酸配列や立体構造を考慮し、11種のペプチド（長鎖：27-28 aa, 短鎖：7-17 aa）を化学合成した。先ず、ペプチドを培養子宮内膜間質細胞に添加し、インターフェロン刺激遺伝子（ISGs）の遺伝子発現量を測定することでIFN-τ活性の有無を評価した。次に、組換えIFN-τとペプチドを同時に添加することでペプチドとIFN-τの競合を評価した。組換えIFN-τの添加によってISGsの発現量の増加がみられたが、合成ペプチドの添加による増加はみられなかった。また、組換えIFN-τとペプチドの同時添加によるISGsの抑制もみられなかった。そのため、今回合成したペプチドは活性リガンド領域を有していない、もしくは立体構造が変化したため、受容体への結合能を十分に有していないことが示唆された。

DOI： 10.32253/hlgs.7.1_7

ウマ子宮内膜におけるPGF2α自己増幅機構

香西圭輔, 徳山翔太, Szostek Anna Z, 登石裕子, 角田修男, 田谷一善, 阪谷美樹, 高橋昌志, 南保泰雄, Skarzynski Dariusz J, 山本ゆき, 木村康二, 奥田潔

馬の科学 = Equine science 56 ( 4 ) 282 - 293 2019年

暑熱環境下におけるウシ子宮内膜細胞のマクロファージ走化性物質産生の変化

酒井駿介, 山本ゆき, 木村康二

日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web) 42nd 2019年

卵管自発収縮に関わるイオンチャネルと培養平滑筋細胞内カルシウム変動

山本ゆき, 山本ゆき, 黒川真帆, 小川泰司, 木村康二, 木村康二

日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web) 42nd 2019年

着床前ウシ頸管および外子宮口周辺粘膜におけるインターフェロン誘導遺伝子の発現

国井宏樹, 伊藤月乃, 小木曽貴季, 鈴木惇文, 古山敬祐, Md. Abdus, Shabur Talkder, Balboula Ahmed Zaky, 唄花子, 川原学, 永野昌志, 木村康二, 高橋昌志

北海道牛受精卵移植研究会会報 37 17 - 17 2018年8月

ウシ黄体におけるbetaglycanの役割とその発現調節

長谷川啓喜, 山下真路, 伊藤典彦, 岡本芳晴, 窪友瑛, 伊賀浩輔, 木村康二, 菱沼貢, 奥田潔, 西村亮, 西村亮

日本畜産学会大会講演要旨 124th 205 - 205 2018年3月

ウシ伸長期胚の非外科的移植技術—Non-surgical Transfer Method of Elongating Bovine Conceptus

木村, 康二

岡山大学農学部学術報告 107 19 - 24 2018年2月

記述言語：日本語出版者・発行元：岡山大学農学部

The objectives of the present study were to establish a non-surgical transfer method for elongating bovine conceptuses and to combine this method with biopsy and sexing. Bovine conceptuses were recovered from donor cows on day 13-14 of the estrus cycle. In experiment 1, day 13 conceptuses were transferred to recipient cows using a standard day 7 embryo transfer (ET) method. The pregnancy rate of day 13 conceptus transfer (CT) is comparable to that of day 7 ET. In experiment 2, day 14 conceptuses were transferred using modified methods (balloon catheters or ET guns with modified sheaths). Using the standard ET method, no pregnancies were obtained;however, when balloon catheters or ET guns with modified sheaths were used, the pregnancy rates after CT were 48.0％ and 44.8％, respectively. In experiment 3, day 14 conceptuses were biopsied without a micromanipulator, sexed using the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method, and transferred to recipient cows. The pregnancy rate of biopsied conceptuses was 46.2％ and did not differ significantly from that of unbiopsied with conceptuses. Moreover, all pregnant cows transferred conceptuses following biopsy and sexing delivered calves with the expected sexes. These results suggested that the non-surgical bovine conceptus transfer (CT) method was comparable to day 7 ET, and that this technique enables biopsy and sexing without expensive equipment such as a micromanipulator or specialized skills.

ウシ子宮内膜上皮細胞を用いた暑熱負荷培養およびインターフェロン・タウ応答性の検証

小松正明, 鈴木惇文, 国井宏樹, 川原学, 木村康二, 高橋昌志, 唄花子

日本繁殖生物学会講演要旨集 111 ( 0 ) P - 38-P-38 2018年

記述言語：日本語出版者・発行元：日本繁殖生物学会

【目的】夏期の暑熱ストレスは，人工授精受胎率低下を引き起こすなど，家畜繁殖性に悪影響を与えることが知られている。これまでに，ウシの卵子や卵巣，胚に対する暑熱ストレスの影響は報告されているが，母体子宮への影響は不明である。ウシを含む反芻動物の妊娠認識および成立はインターフェロン・タウ（IFNT）が役割を担う。IFNTは孵化後の胚から産生され，子宮内膜上の I 型IFN受容体（IFNAR）を介して働き，黄体退行を抑制する。また，インターフェロン誘導性因子（ISGs）の発現を誘導する。本研究ではこの妊娠認識に着目し，子宮内膜上皮細胞におけるIFNT応答性を暑熱負荷培養条件下で評価し，子宮への暑熱ストレスの影響を検証した。【方法】食肉検査場由来ウシ子宮から子宮内膜組織を採取し，上皮細胞を単離，培養した。単離した上皮細胞をウシの平常時の体温である38.5 ℃および暑熱時の体温である40.5 ℃の暑熱条件下で3，6，12時間培養後，RNA抽出，cDNA合成を行い，定量PCRにより暑熱ストレス指標である熱ショックタンパク質（HSP）群の発現を解析した。また，上皮細胞を同様の暑熱負荷条件下にて組換えウシIFNT（500 IU）を添加し12時間培養した。各処理区において定量PCRによるISGs（ISG15, MX1a）およびIFNAR（IFNAR1, IFNAR2）の発現解析を行った。【結果と考察】HSPのmRNA発現量は，12時間の暑熱負荷によりHSP27, 60, 90の全てが対照区と比べ有意に上昇した。この結果から，12時間の暑熱処理により，細胞への十分なストレス負荷が確認された。ISGs の発現はIFNT添加により有意に増加したが，暑熱負荷による影響はみられなかった。また，IFNAR発現へのIFNT添加および暑熱の影響もみとめられなかった。以上より，培養子宮上皮細胞でのIFNAR発現およびIFNTによるISGs（ISG15, MX1a）発現への暑熱ストレスの影響は少ないことが示唆された。

DOI： 10.14882/jrds.111.0_P-38

暑熱によるウシ子宮内膜のプロスタグランジン分泌増加と温度感受性チャネルの関係

山田亜依, 高見恵都, 酒井駿介, 山本ゆき, 山本ゆき, 木村康二, 木村康二

Journal of Reproduction and Development 64 ( Suppl Japanese Issue ) P-39 - P-39 2018年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】地球温暖化に伴い夏季のウシ受胎率の低下が問題視されており，暑熱ストレス（HS）による生殖系内分泌の異常がその一因として考えられている。これまでに，我々は培養ウシ子宮内膜間質細胞においてHSがプロスタグランジン（PG）分泌を促進することを報告したが（Sakai et al., JRD, 2018），そのメカニズムは明らかにされていない。細胞の温度感受性システムとしてTransient Receptor Potential（TRP）チャネルの関与が報告されている。TRPチャネルは細胞膜に存在するイオンチャネル型受容体の1つであり，その中でも特に体温付近でTRPV3・V4・M2が機能することが明らかとなっている。そこで，本研究ではウシ子宮内膜においてHS環境下でのPG産生に対するTRPV3・V4・M2の関与について検証した。【方法】ウシ子宮内膜組織において，TRPV3，V4，およびM2 の局在を免疫組織化学により調べた。また，培養ウシ子宮内膜間質細胞にTRPV3またはV4阻害剤を0, 10, 100, 1000nM，もしくはTRPM2阻害剤を0, 10, 50, 100 µMの濃度で添加し，それぞれを40.5°Cもしくは38.5°Cで培養した。培養終了後，上清中のPG濃度をEIAにより測定した。【結果】TRPV3はウシ子宮内膜において明瞭な発現は観察されなかったが，TRPV4はわずかに内腔上皮細胞のみで検出された。TRPM2は子宮内膜組織の全域に局在し，特に内腔上皮細胞および腺上皮細胞では，間質細胞・子宮筋層・血管内皮細胞よりも強く検出された。子宮内膜間質細胞におけるPG産生はHSによって増加し，TRPV3・V4阻害剤添加はこの増加を抑制しなかった。一方，TRPM2阻害剤添加はHSによるPG分泌増加を有意に抑制した（P <0.05）。これらの結果より，温度感受性TRPチャネルはウシ子宮内膜に発現し，その中でも特にTRPM2がHSによるPG分泌上昇に関与する可能性が示唆された。

DOI： 10.14882/jrds.111.0_p-39

ウシ卵管自発収縮に関与するイオンチャネルと平滑筋細胞内カルシウム変動の解析

山本ゆき, 山本ゆき, 黒川真帆, 小川泰司, 木村康二, 木村康二

Journal of Reproduction and Development 64 ( Suppl Japanese Issue ) OR2-14 - OR2-14 2018年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】卵管は律動的自発収縮が引き起こす蠕動運動により初期胚を子宮へ輸送するが，収縮の制御機構は明らかでない。消化管では内在性のペースメーカーが自発的に脱分極し，その刺激が平滑筋細胞に伝達されて蠕動運動が起こる。この機構にはイオンの流出入による膜電位変化が重要であり，また平滑筋細胞の収縮には細胞内Ca²⁺濃度の上昇が必須である。本研究では，これらの基礎知見を基にウシ卵管蠕動運動の発生・制御機構を明らかにすることを目的とした。【方法】1）ウシ卵管自発収縮に関与するチャネルを明らかにするため，収縮試験（マグヌス法）を用いてA) Ca²⁺供給経路：電位依存性Ca²⁺チャネル（VDCC），小胞体Ca²⁺放出チャネル（IP3R，RyR），B) 脱分極誘発：Na⁺チャネル，Cl^-チャネル，C) 再分極および過分極：電位依存性Kチャネル（VDKC）およびCa²⁺依存性Kチャネル（BK，SK），D) 細胞間刺激伝達：ギャップジャンクション（GJ）が収縮に与える影響を検討した。2）培養平滑筋細胞内Ca²⁺を可視化し，細胞内Ca²⁺変動を解析した。【結果および考察】1）A) VDCC阻害により収縮の振幅は減少した。IP3RとRyRを同時に阻害すると収縮回数と振幅が減少した。VDCCを介した細胞外Ca²⁺流入と小胞体からのCa²⁺放出が自発収縮に必須であることが示された。B) Cl^-チャネル阻害により収縮回数が減少したため，脱分極の発生に関与する可能性が示された。C) VDKC阻害は収縮回数および振幅を減少させた。BK阻害は収縮回数を減少させた一方，BKとSK阻害ではそれぞれ振幅が増加した。VDKC，BK，SKのいずれも再分極・過分極に関与する可能性が示された。D) GJ阻害が収縮を抑制したため，細胞間刺激伝達はGJを介することが示された。2）培養平滑筋細胞がコンフルエントの状態においてCa²⁺変動が観察されたため，Ca²⁺変動の発生には細胞間接着が必要であると示された。

DOI： 10.14882/jrds.111.0_or2-14