研究者詳細 - 木村　康二

ウシ初期黄体における低酸素環境のglucose transporter 1(GLUT1)発現を介した機能亢進

西村亮, 西村亮, 長谷川啓喜, 山下真路, 伊藤典彦, 岡本芳晴, 竹内崇, 窪友瑛, 伊賀浩輔, 木村康二, 菱沼貢, 奥田潔, 奥田潔

日本獣医学会学術集会講演要旨集 160th 431 - 431 2017年8月

ウシ初期および中期黄体細胞のプロジェステロン(P4)分泌に及ぼす低酸素環境の影響

長谷川啓喜, 西村亮, 菱沼貢, 山下真路, 伊藤典彦, 岡本芳晴, 窪友瑛, 伊賀浩輔, 木村康二, 奥田潔

日本畜産学会大会講演要旨集 122回 160 - 160 2017年3月

The effect of interferon tau on human placental cells

Nao Tanikawa, Yugo Suzue, Schuichi Matsuyama, Koji Kimura, Hisataka Iwata, Takehito Kuwayama, Koumei Shirasuna

JOURNAL OF REPRODUCTIVE IMMUNOLOGY 118 134 - 134 2016年11月

農家で実施可能なウシ伸長胚を利用した雌雄産み分け技術 (特集目指せ、確実な子牛生産)

松山秀一, 中村翔, 木村康二

養牛の友 ( 488 ) 34 - 37 2016年11月

ウシ伸長胚を利用した現場実施可能な雌雄産み分け技術

松山秀一, 中村翔, 木村康二

畜産技術 = Livestock technology 2016 ( 738 ) 8 - 11 2016年11月

サブユニット特異的なI型インターフェロン(IFN)受容体発現抑制によるIFN-τシグナル関連遺伝子発現への影響

白水貴大, 鈴木惇文, 岩野弘暉, 小木曽貴季, 金星佑, 唄花子, 川原学, 木村康二, 高橋昌志

日本繁殖生物学会講演要旨集 109 ( 0 ) P - 14-P-14 2016年

記述言語：日本語出版者・発行元：日本繁殖生物学会

<p>【目的】着床前のウシ子宮では，胚より分泌されるインターフェロンタウ（IFN-τ）が，IFNAR1（R1）とIFNAR2（R2）の二量体で構成されるI型IFN受容体を介したJAK/STAT経路によってIFN誘導性遺伝子（ISGs）の発現を誘導する。しかし，ウシ子宮におけるIFN-τシグナルの受容体サブユニット依存的なISGs発現調節機構は不明である。本研究では，ウシ子宮内膜上皮細胞におけるI型IFN受容体サブユニットの発現抑制がIFN-τ刺激による遺伝子発現へ及ぼす影響を検証した。【材料と方法】食肉処理場より採材したウシ子宮内膜組織由来の初代培養細胞を実験に供試した。細胞にR1またはR2のsiRNAを導入しRNA干渉した。導入24時間後のR1，R2の発現抑制効果を定量PCRで検証した。さらに，siRNA導入24時間後に組換えウシIFN-τを添加し，12および24時間後の1）抗ウイルス能（MX1，2，ISG15），2）IFNシグナル伝達制御（STAT1，2，IRF1，2，3，9），3）I型IFN受容体発現の維持（COPS5）および4）着床時の細胞増殖（TGF-β1，2）に関連する遺伝子群の発現量を定量PCRで解析した。【結果と考察】R1またはR2のsiRNA導入によるRNA干渉はR1，R2の発現をそれぞれ特異的に抑制した。R1またはR2の発現抑制はIFN-τによるMX1，2，ISG15，STAT1，2，IRF1，2，3，9，COPS5発現の誘導を有意に抑制した。特に，R2と比べてR1抑制時に高い発現抑制効果を示した。TGF-β1，2の発現については，R1，R2の発現抑制による影響は見られず，JAK/STATシグナルから直接制御されない可能性が示唆された。【結論】IFN-τのIFNARを介したJAK/STAT経路にはR1依存的なシグナル伝達機構が存在することが明らかとなった。</p>

DOI： 10.14882/jrds.109.0_P-14

着床前ゲノム選抜技術開発に向けたウシ伸長胚保存法の検討

藤井貴志, 平山博樹, 陰山聡一, 内藤学, 福田茂夫, 吉野仁美, 松山秀一, 木村康二, 早川宏之, 津田栄, 森安悟

Journal of Reproduction and Development 62 ( Suppl Japanese Issue ) P-101 - P-101 2016年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】受精卵の段階でゲノム育種価推定ができれば，より効率的なゲノム育種が可能となる。近年，受精卵移植に長径数ミリから数センチに発生した伸長胚を利用する技術が開発されており，伸長胚であれば，受胎性を損なわずにSNP解析に十分な量の細胞を採取できると考えられる。一方，SNP解析が終了するまでの間伸長胚を体外で保存する必要があるが，伸長胚の保存法はない。本研究では，伸長胚保存法の基礎検討を行った。【方法】過剰排卵処理により採取した胚齢15～16日の伸長胚を以下の3つの方法で保存した。〈凍結保存〉伸長胚を1.5M Etylene Glycol（EG），0.1M Trehaloseを含む保存液と共に0.25 mlストローに封入し，10分または60分間平衡後，緩慢凍結法により凍結した。〈ガラス化保存〉7.5%EG，7.5%DMSOを含む平衡液および15%EG，15%DMSO，1.5M Sucroseを含むガラス化液に3分および1分または10分および5分浸漬後，ナイロンメッシュに乗せ，液体窒素に直接浸してガラス化した。〈非凍結保存〉伸長胚を0%，20%，50%血清および50%血清＋III型不凍タンパク質（AFP）を含むTCM-199培地と共に0.5 mlチューブに封入し，4℃の冷蔵庫内で7日間非凍結保存した。各方法で保存した伸長胚は，蛍光イメージング試薬により保存後の死細胞率を解析した。【結果】緩慢凍結保存後の死細胞率は，10分平衡区で平均1.32%，60分平衡区で平均2.48%であり，新鮮胚（平均0.96%）と比較して差はなかった。一方，ガラス化保存後の死細胞率は，平衡液3分-ガラス化液1分区で平均18.36%，平衡液10分-ガラス化液5分区で平均19.61%であり，両区とも新鮮胚と比較して有意（P<0.05）に高かった。非凍結保存後の死細胞率は，0%，20%，50%血清および50%血清＋III型AFP区で，それぞれ平均36.28%，21.58%，12.28%および14.76%であり，いずれも新鮮胚と比較して有意（P<0.01）に高かったが，血清濃度が上昇するにつれ死細胞率は減少した。以上より，現状では，緩慢凍結法が伸長胚の保存法として最も適していると考えられた。今後，保存方法の最適化と受胎率調査を行う。

DOI： 10.14882/jrds.109.0_p-101

ウシ伸長胚を用いた着床前ゲノム選抜技術開発に向けたSNP解析精度の検討

平山博樹, 内藤学, 鹿島聖志, 藤井貴志, 陰山聡一, 坂井ひとみ, 杉本喜憲, 松山秀一, 木村康二, 早川宏之, 森安悟

Journal of Reproduction and Development 62 ( Suppl Japanese Issue ) 2016年

ウシ過剰排卵処置時におけるニューロキニンB受容体作動薬の末梢投与が黄体形成ホルモン分泌および回収胚の品質に及ぼす影響

中村翔, 木村康二, 美辺詩織, 大石真也, 大蔵聡, 松山秀一

Journal of Reproduction and Development 62 ( Suppl Japanese Issue ) OR2-27 - OR2-27 2016年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】現在行われている過剰排卵処置では，回収胚の数と品質にばらつきが出るといった問題が度々生じている。また，現在の過剰排卵処置では，黄体形成ホルモン（LH）分泌の抑制が起こることが知られており，このLH分泌抑制が卵子の成熟過程に影響を及ぼし，前述した問題を引き起こすと考えられるが，その改善は未だなされていない。視床下部弓状核に局在するニューロキニンB，ダイノルフィンおよびキスペプチンが共存するKNDyニューロンとよばれるニューロン群は生殖機能の制御に重要な役割を果たすと考えられており，近年，ウシにおいてニューロキニンB受容体作動薬であるsenktideの末梢投与がLH分泌を亢進することが報告されている。そこで本研究では，ウシの過剰排卵処置時においてsenktideの末梢投与が，性腺刺激ホルモン分泌および回収胚の品質に及ぼす影響について検討を行った。【方法および結果】黒毛和種繁殖雌牛（n=12）を用い，ブタ卵胞刺激ホルモン製剤を3日間漸減投与することにより過剰排卵処置を行った。過剰排卵処置開始72時間後からニューロキニンB受容体作動薬であるsenktide（30または300 nmol/min）を静脈内に2時間投与し，投与前後におけるLHの分泌動態を調べた。また，発情後7日目に採胚を行い，回収胚の品質をIETSグレードで評価するとともに，CodeⅠまたはCodeⅡの胚盤胞期胚からRNAを抽出し，DNAマイクロアレイおよびQPCR解析を行った。過剰排卵処置牛へのsenktideの末梢投与は，LH分泌を亢進した。また，senktideの投与により回収胚に対する高品質胚の割合が増加した。さらに，胚における遺伝子発現パターンが変化し，シトクロム酸化酵素1などの代謝亢進に関与する遺伝子発現が上昇した。以上の結果から，過剰排卵処置牛へのsenktideの投与はLH分泌を亢進させるとともに，胚における代謝亢進に関与する遺伝子発現を上昇させ，胚の品質を向上させる可能性が示された。

DOI： 10.14882/jrds.109.0_or2-27

ウシの子宮機能と受胎性について—Relationship between uterine function and establishment of pregnancy in cattle

木村康二, 松山秀一

家畜感染症学会誌 = The journal of farm animal in infectious disease 5 ( 4 ) 145 - 151 2016年

ウシ黄体退行における testosterone の役割

入江結唯, 羽柴一久, 木村康二, 奥田潔

日本繁殖生物学会講演要旨集 109 OR2-34 - OR2-34 2016年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】雌ウシならびにヤギにおいて黄体退行時に血中testosterone（T）濃度が一時的に上昇する。また，ヤギへのT合成阻害剤投与によってTの血中の濃度上昇を抑制すると，黄体の寿命が延長することから，Tは黄体退行に関与すると考えられている。このようにTが黄体退行に関与することが示唆されているが，そのメカニズムは明らかではない。本研究では，ウシ黄体退行機構を解明することを目的とし，発情周期を通じた黄体組織におけるTの受容体であるandrogen receptor (AR) mRNA発現の変化ならびに中期および後期黄体細胞の機能に及ぼすTの影響について検討した。【方法】食肉センターより採取した卵巣を肉眼的所見により排卵日を0日として，初期（Days 2–3），形成期（Days 5–6），中期（Days 8–12），後期（Days 15–17）および退行期（Days 19–21）に分類した。その後，各周期の黄体組織におけるAR mRNA発現量を定量的RT-PCR法により検討した。また，中期および後期黄体から単離した黄体細胞を一晩培養後，T（10，100および1000 pg/ml）を添加し，24および48時間後の上清中progesterone（P4）濃度をenzyme immunoassay（EIA）により，細胞生存率をMTT assayにより測定した。【結果および考察】発情周期を通じた黄体組織におけるAR mRNA発現量は，初期および形成期と比較して後期において有意に高かった（P<0.05）。中期および後期黄体細胞における24および48時間培養上清中P4濃度においてTの影響は認められなかった。また，中期黄体細胞における細胞生存率は，いずれの培養時間においてもTの影響は認められなかった。一方，後期黄体細胞における細胞生存率は，24時間培養した実験区ではTによる影響は認められなかったが，48時間において無添加区と比較して，T添加区（100および1000 pg/ml）において有意に減少した（P<0.05）。本研究より，黄体退行時に上昇する血中Tは後期黄体に作用し黄体細胞の生存性を減少させることが明らかとなり，Tが構造的黄体退行に関与する可能性が示された。

DOI： 10.14882/jrds.109.0_or2-34

ウシ黄体維持機構におけるepidermal growth factor receptorのcore fucosylationの役割

羽柴一久, 小林純子, 佐野栄宏, 前田恵, 木村吉伸, 奥田潔, 木村康二

日本繁殖生物学会講演要旨集 109 OR2-33 - OR2-33 2016年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】Epidermal growth factor receptor（EGFR）に結合するN型糖鎖上のcore fucoseは，epidermal growth factor（EGF）のEGFRへの結合に重要である。EGFは黄体細胞の生存を維持し，EGFRへの結合親和性は機能黄体において高いことから，黄体においてもEGFRの黄体維持作用にcore fucosylationの関与が考えられる。本研究では，1）発情周期を通じたウシ黄体のcore fucosylationレベルとfucose含有糖タンパク質の局在，2）黄体細胞のEGFR糖鎖のcore fucosylationの有無，3） EGFの黄体機能維持作用に及ぼすcore fucosylationの影響を検討した。【方法】1）発情周期を通じた黄体（初期：Days 2–3，形成期：Days 5–6，中期Days 8–12，後期：Days 15–17，退行期：Days 19–21）の膜画分のcore fucosylationレベルをfucoseを認識するAALレクチンを用いて検討し，fucose含有糖タンパク質の局在を解析した。2）中期黄体細胞から免疫沈降法によりEGFRタンパク質を回収後，core fucosylationの有無を調べた。3）中期黄体細胞にα-fucosidase（0.01，0.1 units/ml）を添加してcore fucoseを切断し，16時間後のcore fucosylationレベル，上清中のprogesterone（P4）濃度と生存率を検討した。黄体細胞にα-fucosidase（0.1 units/ml）とEGF（5，10 ng/ml）を単独又は組み合わせて添加し，24時間後のP4濃度と生存率を調べた。【結果】1）黄体の糖タンパク質のcore fucosylationレベルは後期，退行期と比較して，初期，形成期と中期に高く，fucose含有糖タンパク質は黄体細胞に局在した。2）黄体細胞のEGFR糖鎖はcore fucosylationを受けていた。3）黄体細胞の糖タンパク質のcore fucosylationレベルと生存率は，α-fucosidase添加区において減少し，P4産生に変化はなかった。EGFによる生存率の増加は，α-fucosidaseの共添加により減少し，P4産生に変化はなかった。以上より，EGFの黄体機能維持作用にEGFRのcore fucosylationが重要であり，core fucosylationの低下が黄体の構造的退行に関与する可能性が示された。

DOI： 10.14882/jrds.109.0_or2-33

ウシ子宮内膜細胞における黄体退行制御メカニズムに及ぼす暑熱ストレス (HS) の影響

酒井駿介, 八木まみ, 久世真理子, 山本ゆき, 木村康二, 奥田潔

日本繁殖生物学会講演要旨集 109 OR1-2 - OR1-2 2016年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】世界的な地球温暖化に伴い，夏季のウシ受胎率の低下が問題視されており，その一因として夏季のHSがウシの発情周期に影響を及ぼすことが報告されている。発情発現には黄体の存在が密接に関与しており，黄体は子宮内膜から分泌されるPGF2 alpha（PGF）により黄体退行が誘導され，PGE2により維持される。子宮内膜による黄体退行制御のためのPGs産生はoxytocin（OT）およびTNF alpha（TNF）によって調節されるが，この黄体退行制御メカニズムに対するHSの影響は不明である。本研究はHSによる発情周期の乱れの一因を明らかにするために，黄体退行を制御する子宮内分泌機能に及ぼすHSの影響を検討した。【方法】培養ウシ子宮内膜上皮細胞にOT，間質細胞にTNFを添加し，40.5°Cで10時間，38.5°Cで14時間，最後に40.5°Cで10時間培養した。1）培養上清中のPGE2およびPGF濃度をEIA，2）間質細胞のPG合成酵素およびTNF受容体mRNA発現を定量的RT-PCR法により測定した。【結果】1）上皮細胞のPGE2およびPGF産生はOTにより増加したが，HSによる影響は見られなかった。一方，間質細胞においてPGE2およびPGF産生はTNFにより増加し，HS処理によりさらに増加した。また，0.6 nMのTNFを添加した間質細胞においてPGE2/PGF比はHS処理により有意に増加した。2） TNF添加によりCOX2 mRNA発現は有意に増加し，PLA2およびPGES mRNA発現は増加傾向が見られた（P=0.08，0.06）。HS処理によりPLA2，PGESおよびTNFR-1 mRNA発現は有意に増加し，COX2 mRNA発現は増加傾向が見られた（P=0.09）。さらにPGES mRNA発現はTNFとHSの同時処理によってさらに増加した。また，TNFおよびHSによるPGFS，CBR1およびTNFR-2 mRNA発現の変化は見られなかった。以上のことからHSによる発情周期の変化は黄体退行時の間質細胞における内分泌機能の変化が関与する可能性が示された。HSによるPGES mRNA発現増加によるPGE2/PGF産生比の増加が黄体制御メカニズムに影響したことが原因だと考えられる。

DOI： 10.14882/jrds.109.0_or1-2

ウシ胚におけるインターフェロンτの局在

細江実佐, 林憲悟, 作本亮介, 古澤軌, 池田光美, 大越勝広, 徳永智之, 木村康二, 松山秀一, 野口純子, 高橋透

日本畜産学会大会講演要旨 119th 204 2015年3月

ウシ過剰排卵処置時におけるウシ型キスペプチン‐10の静脈内への頻回投与が性腺刺激ホルモン分泌および排卵成績に及ぼす影響

松山秀一, 大蔵聡, 大石真也, 木村康二

日本はい移植学雑誌 37 ( 1 ) 34 2015年1月

ウシ黄体におけるtestosterone合成酵素の遺伝子発現

入江結唯, 羽柴一久, 吉岡伸, 木村康二, 山本ゆき, 奥田潔

Journal of Reproduction and Development 61 ( Suppl Japanese Issue ) P-36 - P-36 2015年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】雌ウシにおいてtestosterone (T）は卵巣から分泌され，黄体退行時に血中T濃度の一時的な増加が認められる。さらに，黄体においてTが産生され，培養黄体細胞においてTがprogesterone (P4）分泌を低下させることから，Tが黄体において局所機能調節因子として働くことが考えられている。また，Tは2つの経路によって合成される（pregnenolone (PREG）→P4→TとPREG→dehydroepiandrosterone (DHEA）→T）。しかし，黄体中のT合成とその調節メカニズムは明らかでない。本研究では，ウシ黄体退行機構を解明するために，発情周期を通じた黄体とprostaglandin F2α （PGF）の投与により黄体退行を誘導した黄体中のPREG→DHEA→T経路を介したT合成に関与するcholesterol side-chain cleavage enzyme （P450scc），cytochrome P450 （CYP17A1）およびhydroxysteroid dehydrogenases （HSD17B1, HSD3B）mRNA発現の変化について調べた。【方法】卵巣を排卵日を0日として，初期（Days 2–3），形成期（Days 5–6），中期（Days 8–12），後期（Days 15–17）および退行期（Days 19–21）に分類した。また，中期黄体を有するウシにPGFを投与し，0，4，12および24 h後の黄体を回収した。その後，黄体中P450scc，CYP17A1，HSD17B1およびHSD3B mRNA発現量を定量的RT-PCR法により検討した。【結果】発情周期を通じた黄体中HSD3B mRNA発現量は後期と比較して退行期に低かったが，P450scc，CYP17A1およびHSD17B1 mRNA発現量に変化は認められなかった。PGF投与後の黄体中P450scc mRNA発現量は，0 hと比較してPGF投与後4と12 hで有意に減少した。HSD3B mRNA発現量は12と24 hで有意に減少したが，CYP17A1とHSD17B1 mRNA発現量に変化は認められなかった。本研究において，PREG→DHEA→T経路はウシ黄体退行期におけるT合成に関与しないことが示唆された。今後，PREG→P4→T経路の黄体退行への関与を検討する。

DOI： 10.14882/jrds.108.0_p-36

ウシ卵管における細胞模型エストロジェン受容体(GPER)を介したestradiol-17β(E₂)の作用

西江拓海, 小林芳彦, 山本ゆき, 木村康二, 奥田潔, 奥田潔

日本畜産学会大会講演要旨 119th 2015年

ウマ子宮内膜におけるglucocorticoid receptor, 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type1 および type 2 発現の周期的変化

塩谷陽紀, SZOSTEK Anna Z, 山本ゆき, 木村康二, 奥田潔

日本繁殖生物学会講演要旨集 108 P-62 - P-62 2015年

記述言語：日本語出版者・発行元：公益社団法人日本繁殖生物学会

【目的】ウマにおいて子宮由来の prostaglandins （PGs）は発情周期の調節や妊娠の成立に重要だが，その合成調節機構には不明な点が多い。ラットやウシにおいて，活性型 glucocorticoid （GC）の cortisol （Cr）は黄体退行を誘導する子宮内膜からの PGF2α 産生を抑制する。我々は GC 活性化酵素の 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type1 （11β-HSD1）がウシ子宮内膜に発現し局所的に子宮の PGs 合成能を調節する可能性を示してきた。本研究では発情周期のウマにおける子宮機能調節への GC の関与を明らかにする目的で，子宮内膜組織の GC receptor （GCR）, 11β-HSD1 および GC 不活性化酵素の 11β-HSD type2 （11β-HSD2）発現の周期的変化を検討した。【方法】屠畜場で採取したウマ子宮内膜組織を卵巣の肉眼的所見から黄体初期，黄体中期，黄体後期および卵胞期の4グループに分類し，GCR, 11β-HSD1 および 11β-HSD2 の遺伝子およびタンパク質発現をそれぞれ定量的 RT-PCR 法および western blot 法を用いて解析した。【結果および考察】子宮内膜組織における各遺伝子発現に周期的な変化はなかったが，GCR タンパク質発現は黄体中期に比べ黄体後期の方が有意に高かったことから，黄体後期では Cr に対する感受性が高いことが示唆された。また，11β-HSD2 タンパク質発現は卵胞期に比べ黄体中期で高かったことから，ウマ子宮内膜では黄体中期で Cr から不活性型 GC の cortison へ活発に転換されている可能性が示された。以上の結果より，循環血液から供給される GC は，発情周期中のウマ子宮内膜において局所的にその活性が制御され，子宮機能調節に関与することが推察された。現在，PGs 合成も含め GC が子宮内膜の機能に与える影響を検討中である。

DOI： 10.14882/jrds.108.0_p-62