Research Projects -
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Malnutrition delayed wound healing by HMGB1-related prolonged inflammation
Grant number：19K10128 2019.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Yamashiro Keisuke
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
In Japan, the gap between average life expectancy and healty life expectancy bacomes a big problem. This divergence is caused by diseases such as fractures and lifestyle-related diseases in the elderly. Malnutrition is one of the causes of further exacerbation of these diseases. In this study, we hypothesized that HMGB1, an inflammation mediator, is involved as one of the causes of prolonged inflammation during malnutrition. We made the malnutrition model mice and observed the wound healing process after tooth extraction. The factors related to inflammation (HMGB1 and IL-1β) expression were increasedand the actores related to regeneration and mesenchymal stem cells were decreased in the malnutriotion group compared to the control group. From these results, it was clarified that HMGB1-mediated delayed wound healing occurs in malnutrition.
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I型インターフェロンが顎顔面の形態形成に及ぼす影響
Grant number：19K10381 2019.04 - 2022.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
早野 暁, 川邉 紀章, 宝田 剛志
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
本研究の目的であるI型インターフェロンの機能亢進による全身性骨形成不全の発生機序を解明するため、Singleton-Merten Syndrome 患者および対照群となる健常患者の抜去歯から間葉系幹細胞を単離し、骨芽細胞への分化を試みた。また同時に、健常患者の抜去歯から単離した間葉系幹細胞にI型インターフェロンのリコンビナントプロテイン（IFN-alfa-2a, IFN-alfa-2b, IFN-beta）添加した実験群と、同じく健常患者由来の間葉系幹細胞にI型インターフェロンを添加しない対照群とで骨芽細胞への分化を試みた。どちらの実験でもI型インターフェロンが亢進している群において、重度の骨芽細胞への分化抑制が認められた。興味深いことに後者の実験から骨芽細胞への分化抑制は特にIFN-betaにおいて著しいことが分かった。
これら一連の結果の原因を解明するため、培養後の細胞からRNAを単離し、qPCR法によって骨芽細胞分化マーカー、p53経路の活性、細胞死の状況を確認した。我々の当初の仮説では、I型インターフェロンの機能亢進が間葉系幹細胞においてp53細胞死経路を活性化することで骨芽細胞への分化抑制が生じていると考えていたが、予想に反してp53細胞死経路の活性化はI型インターフェロン亢進群では見られなかった。つまり、I型インターフェロンによる骨芽細胞への分化抑制はアポトーシスによるものではない可能性が示唆された。
この結果はSingleton-Merten Syndrome の全身性骨形成不全の原因を解明する上で非常に重要な情報だと言える。 -
Grant number：18K19646 2018.06 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory) Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Kuboki Takuo
Grant amount：\6240000 （ Direct expense: \4800000 、 Indirect expense：\1440000 ）
Stem cells are required for lifelong homeostasis and regeneration of organs and tissues in mammals. However, aging of stem cells reduces cellular function and results in dysfunctional organs and tissues. Therefore, maintenance of the stemness of stem cells is of crucial importance, although its mechanisms are still unclear. The aim of this study was to identify the master regulator for the maintenance of stemness of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). First, we compared the RNA expression patterns between BMSCs derived from young and old mice, as well as between human BMSCs and human dermal fibroblasts using RNA-seq, and found that 30 transcription factors were highly expressed in BMSCs derived from young mice and in human BMSCs. Next, we found that several transcription factors could inhibit the induction to pluripotent stem (iPS) cells using iPS interfering method. The detailed function of these transcription factors in BMSCs are now being investigated.
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Grant number：18H02991 2018.04 - 2021.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Kuboki Takuo
Grant amount：\17550000 （ Direct expense: \13500000 、 Indirect expense：\4050000 ）
Whole-tooth regeneration is ultimate goal in dental field and the goal of this study is to identify the master transcription factors that characterize tooth germ derived epithelial and mesenchymal cells and develop method to generate those cells. First, we analyzed the mouse embryonic tooth germ and human stem cell from the apical papilla (hSCAP) by RNA-Seq and performed iPS interference to identify the potential transcription factors. Finally, candidate transcription factors were overexpressed in human adult dermal fibroblast (hADF), resulting that hADF was induced into the cells similar to tooth germ derived mesenchymal cells.
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Grant number：18K09832 2018.04 - 2021.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Kawanabe Noriaki
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
In this study, we conducted experiments to clarify the effects of the trigeminal nerve and facial nerve on the morphology of the maxillofacial region during growth. As a result of nerve activity blocking experiments and nerve activity activation experiments of the trigeminal nerve and facial nerve of rats, a decrease in the formation rate of cut teeth, calcification of the pulp, and disorder of the arrangement of ameloblasts and odontoblasts were observed. It was. In addition, as a result of analyzing Sonic hedgehog (Shh) gene-deficient mice and Shh gene-expressing mice, changes in bone and tooth morphology that are thought to be the effect of Shh on long-term maxillofacial morphogenesis were observed. As a result of conducting an experiment using fluorescence bioimaging, no characteristic stem cell dynamics were observed with or without nerve activity blocking / activation.
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Grant number：17H04399 2017.04 - 2021.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Takarada Takeshi
Grant amount：\16640000 （ Direct expense: \12800000 、 Indirect expense：\3840000 ）
In this study, we generated a tTA-dependent photoactivatable Cre-loxP recombinase knock-in mouse model (TRE-PA-Cre mice) using a CRISPR/Cas9 system. These mice were crossed with ROSA26-tdTomato mice (Cre reporter mouse) to visualize DNA recombination as marked by tdTomato expression. We demonstrated that external noninvasive LED blue light illumination allows efficient DNA recombination in the liver of TRE-PA-Cre:ROSA26-tdTomato mice transfected with tTA expression vectors using hydrodynamic tail vein injection. The TRE-PA-Cre mouse established here promises to be useful for optogenetic genome engineering in a noninvasive, spatiotemporal, and cell-type specific manner in vivo.
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Grant number：17K11750 2017.04 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Kimura-Ono Aya
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
Recently, we successfully regenerated the cortical bone-like bone, which is important to maintain the long-term stability of regenerated bone, using Escherichia coli-derived rhBMP-2 (E-rhBMP-2) adsorbed in PLGA membrane in rat model. The purpose of this study was to evaluate the E-rhBMP-2/PLGA membrane using peri-implantitis canine model. First, we generated the peri-implantitis model using beagle dogs and transplanted the autogenous bone to evaluate this animal model. Interestingly, autogenous bone graft could not recover the bone defect caused by peri-implantitis. Next, we transplanted the β-TCP containing E-rhBMP-2 in bone defects and covered with PLGA membrane containing E-rhBMP-2. Only β-TCP containing E-rhBMP-2 was transplanted as control group. As a result, PLGA membrane containing E-rhBMP-2 induced bone formation compared with control group. In conclusion, the PLGA membrane containing E-rhBMP-2 was efficient in bone formation in a peri-implantitis model in beagle dogs.
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必須アミノ酸トリプトファンによる幹細胞老化制御機構の解明・骨質改善治療への応用
Grant number：17K11751 2017.04 - 2018.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
笈田 育尚, 窪木 拓男, 大野 彩, 宝田 剛志, 大野 充昭
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
口腔インプラント治療は，人工歯根が歯槽骨や顎骨と結合することにより強固な骨支持を得るため，骨量と骨質が重要な因子となる．しかし，日本人は欧米人と比べ歯槽骨が解剖学的に菲薄で，インプラント体埋入のために骨造成が必要な場合も少なくない．また，高齢化の進む日本で増加傾向にある骨粗鬆症患者へ口腔インプラント治療がなされる場合も多く，多くの研究者が骨造成や骨質改善に関する研究を進めてきた．
我々は，これまでの研究から骨髄由来間葉系幹細胞の幹細胞性維持という観点からスクリーニングし，同定したトリプトファンが，骨質改善や骨の創傷治癒を促進することが明らかにした．この結果は，トリプトファンの投与が口腔インプラントの骨結合促進においても有用である可能性を強く示唆するものである．しかし，口腔インプラントの埋入に伴うトリプトファンの投与が，①骨のリモデリングを担う骨芽細胞，破骨細胞や間葉系幹細胞にどのような影響を与えるのか，また，②インプラント体の初期固定や長期予後に有意に働くのか，また，トリプトファンによる幹細胞の活性化が骨粗鬆症をはじめとする老化疾患に対して有効なのか，未だその詳細は明らかでない．
そこで，本研究ではトリプトファンの骨代謝関連細胞に与える効果の検討を行うこととした．トリプトファンと間葉系幹細胞の骨芽細胞分化との関係性は明らかにしてきたが，破骨細胞との関係性は未だ不明である．はじめに，トリプトファンが破骨細胞分化に与える影響を検討した．すなわちトリプトファンを投与したマウスの大腿骨を経時的 (0, 3, 7, 14日)にサンプリングし，組織学的，分子生物学的に検討する計画をした．しかし本研究では研究期間が短く解析，評価するまでには至らなかった．
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Pericyte imaging for the early detection of psychiatric diseases
Grant number：16KT0192 2016.07 - 2019.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Takarada Takeshi
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
In this study, we focused on the loss of pericyte existing around the cerebrovascular in Bmal1 KO mice, and tried to develop the tools for visualizing the pericyte for the purpose of directing early detection of the disease. As a result, we have found that the circadian clock system regulates PDGFRβ expression in the pericyte, followed by the regulation of the astrocyte activation state through modulation of cerebral vascular permeability. In addition, we have developped a PET/SPECT imaging probe using IQP, which is a compound having high affinity to PDGFRβ .
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体内時計制御グリアネットワークによる「精神-疼痛」連関メカニズムの解明
Grant number：16H01332 2016.04 - 2018.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型) 新学術領域研究(研究領域提案型)
宝田 剛志
Grant amount：\9490000 （ Direct expense: \7300000 、 Indirect expense：\2190000 ）
グリア病である神経障害性疼痛は、精神的ストレスや精神疾患との関連性が臨床上指摘されている（うつを伴う慢性痛、統合失調症や自閉スペクトラム症での痛覚鈍麻など）。しかし、この「精神と疼痛(痛み)」の関連性（連関）の分子基盤は未解明である。本研究では、睡眠障害やうつ等の精神疾患に関連性が深い時計システム（体内時計）に注目し、「体内時計によるグリアネットワークの制御」という観点から、この「精神と疼痛」の謎に挑んだ。我々の解析結果より、睡眠障害等の精神疾患との関連性が深い体内時計システムが破綻したマウス(Bmal1欠損マウス)では、脳・脊髄組織でのアストロサイトの異常活性化が認められた。同マウスにて行動学的解析を実施した結果、多動といった精神行動異常が観察されただけでなく、神経障害性疼痛モデルを実施した結果、神経障害時におけるアロディニアが消失していた。更なる解析の結果、この病態は、血管周囲に存在するアストロサイト-ペリサイトアセンブリ異常による血液脳関門（BBB）破綻に起因することを見出した(J Neurosci.37:10052-10062,2017)。つまり、BBB恒常性は体内時計システムによるグリアネットワークの上に成り立ち、そのシステム破綻は、アストロサイトの異常活性化という段階を経て、精神/疼痛機構を共に破綻させることが示唆される。また、体内時計システムが破綻したマウスでは、脳幹部位特異的な炎症性サイトカインの上昇が観察され、脳幹の特定神経核での異常が行動異常の原因である可能性を見出した。
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in vivo analysis of Mesenchymal stem cells using Runx2 conditional KO mouse
Grant number：26460387 2014 - 2016
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Takarada Takeshi, Hinoi Eiichi
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\5070000 （ Direct expense: \3900000 、 Indirect expense：\1170000 ）
The cellular origin and essential period for Runx2 function during osteoblast differentiation in intramembranous ossification remain poorly understood. Paired related homeobox 1 (Prx1) is expressed in craniofacial mesenchyme, and Runx2 deficiency in Prx1+-derived cells (Runx2prx1－/－ mice) resulted in defective intramembranous ossification. Double-positive cells for Prx1-GFP and stem cell antigen-1 (Sca1) (Prx1+Sca1+ cells) in the calvaria expressed Runx2 at lower levels and were more homogeneous and primitive as compared with Prx1+Sca1－ cells. These findings indicate that the essential period of Runx2 function on intramembranous ossification would begin at the Prx1+Sca1+ mesenchymal stem cell stage and end at the Osx+Prx1－Sca1－ osteoblast precursor stage.
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体内時計によるグリアネットワーク調節に注目した「精神-疼痛」連関メカニズムの解明
Grant number：26117507 2014 - 2015
文部科学省 科学研究費補助金(新学術領域研究(研究領域提案型)) 新学術領域研究(研究領域提案型)
宝田 剛志
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\8320000 （ Direct expense: \6400000 、 Indirect expense：\1920000 ）
グリア病である神経障害性疼痛は、精神的ストレスや精神疾患との関連性が臨床上指摘されている（うつを伴う慢性痛、統合失調症や自閉スペクトラム症での痛覚鈍麻など）。しかし、この「精神と疼痛(痛み)」の関連性（連関）の分子基盤は未解明である。
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我々の解析結果より、睡眠障害等の精神疾患との関連性が深い体内時計システムが破綻したマウスでは、行動・疼痛機能の異常とともに、脳・脊髄組織でのアストロサイトでの異常活性化が認められる。これにより、血管周囲に存在するアストロサイト-ペリサイトアセンブリが異常をきたす可能性を提唱した。つまり、BBB恒常性は体内時計システムによるグリアネットワークの上に成り立つことを示唆するものである。 -
Grant number：22659065 2010 - 2011
Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology Grants-in-Aid for Scientific Research(挑戦的萌芽研究) 挑戦的萌芽研究
Eiichi HINOI, Takeshi TAKARADA
Authorship：Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid) Grant type：Competitive
Grant amount：\3030000 （ Direct expense: \2700000 、 Indirect expense：\330000 ）
We identified GDF15 as an endocrine factor secreted from osteocytes. Recombinant GDF15 significantly promoted osteoclastic differentiation. The anti-GDF15 antibody prevented bone loss through inhibiting osteoclastic activation in tibias from mice with femoral artery ligation in vivo. These findings suggest that GDF15 could play a pivotal role in the pathogenesis of bone loss relevant to hypoxia through promotion of osteoclastogenesis after secretion from adjacent osteocytes during disuse and/or ischemia in bone.
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Regulatory mechanisms of central nervous system by Runx2
Grant number：22500330 2010 - 2011
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
TAKARADA Takeshi, HINOI Eiichi
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\3510000 （ Direct expense: \2700000 、 Indirect expense：\810000 ）
We have previously shown the functional expression of glutamatergic and GABAergic signaling machineries in different osseous cells including osteoblasts. Runt-related factor 2 (Runx2) is the master regulator of osteoblastic differentiation with ability to accelerate differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts, while we have also demonstrated the expression of mRNA and corresponding protein for Runx2. In this study, we for the first time generated mice carrying a conditional Runx2 allele with exon 4, which encodes the Runt domain, flanked by loxP sites. These mice were crossed with α1(I)-collagen-Cre or α1(II)-collagen-Cre transgenic mice to obtain osteoblast- or chondrocyte-specific Runx2 deficient mice, respectively. In newborn α1(II)-Cre;Runx2^flox/flox mice, mineralization impairment was restricted to skeletal areas undergoing endochondral ossification including long bones and vertebrae. In contrast, no apparent skeletal abnormalities were seen in mutant embryo, newborn, and 3- to 6-week old-mice in which Runx2 had been deleted with the α1(I)-collagen-Cre driver. The Runx2 floxed allele established here is undoubtedly useful for investigating the role of Runx2 in particular cells.
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Grant number：20790250 2008 - 2009
Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology Grants-in-Aid for Scientific Research(若手研究(B)) 若手研究(B)
Takeshi TAKARADA
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
We have investigated the possible role of clock genes in mechanism underlying the regulation of chondrogenic differentiation processes. The results suggested that chondrogenic differentiation may be modulated by clock genes expressed by chondrocytes in association with the inhibition by Per1 of Bmal1/Clock-dependent indian hedgehog expression.
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新規シグナル分子によるグリアニューロン相互回路網構築の可能性探究
Grant number：18053009 2006 - 2007
文部科学省 科学研究費補助金(特定領域研究) 特定領域研究
米田幸雄, 寳田剛志
Grant type：Competitive
Grant amount：\6100000 （ Direct expense: \6100000 ）
本研究では、脳内神経情報伝達物質が骨関節系細胞において細胞間情報伝達に利用される事実に基づいて、骨関節系細胞における情報分子群について脳内ニューロンおよびグリア細胞における機能的発現の可能性を探索した。特に、Runt related factor-2(Runx2)は間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化と成熟過程に必須の転写制御因子であるが、中枢神経系における発現解析は全く行われていない。したがって本研究ではRunx2に焦点を当てて、その中枢神経系における機能的発現の可能性を追究するとともに、一過性脳虚血時における病態生理学的役割について検討した。RT-PCR法による解析の結果、ラット大脳皮質由来培養アストログリア細胞およびC6グリオーマ細胞ともにRunx2のmRNA発現が認められた。C6グリオーマ細胞にRunx2の発現ベクターを導入すると、Matrix metalloproteinase-13(MMP13)のmRNA発現量が有意に上昇することが明らかとなった。次いで、中大脳動脈結紮(MCAO)ラット脳におけるMMP13発現を検討した結果、MCAO負荷により梗塞側でMMP13のmRNA発現量の著明な上昇が認められた。以上の結果より、Runx2は中枢神経系内でも特にアストログリア細胞に強く発現するだけでなく、MMP13の発現制御を介して脳虚血病態出現に何らかの関与を示す可能性が示唆される。
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細胞間コミュニケーションにおけるセリン光学異性体に関する研究
Grant number：17790057 2005 - 2006
文部科学省 科学研究費補助金(若手研究(B)) 若手研究(B)
宝田剛志
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\3400000 （ Direct expense: \3400000 ）
我々の研究グループでは、以前より骨関節組織を構成する骨芽細胞、破骨細胞および軟骨細胞の分化段階を制御する因子の探索を行っているが、近年中枢神経系において興奮性情報伝達物質として機能するグルタミン酸(Glu)が、これらの細胞において情報伝達物質として機能することを世界に先駆けて報告した。我々は、Gluシグナリング機構に関連する因子が骨関節組織においても存在するのではないかとの仮説に基づき、中枢神経系のGlu受容体の一種であるNMDA受容体の機能制御を行うD-Serの軟骨細胞分化に与える影響について解析を始めた。現在までのところ、培養骨芽細胞および軟骨細胞において、D-Ser合成酵素であるSRのmRNAおよびタンパク質の発現を認めており、またラット脛骨の組織切片を用いたin situ hybridization法においても骨芽細胞および軟骨細胞におけるSR mRNAの局在性を確認している。前軟骨細胞株であるATDC5細胞にSRを強制的に安定発現させた結果、軟骨細胞分化の指標であるアルシアンブルーの染色性が有意に抑制され、これが軟骨細胞分化過程において重要な役割を果たすSOX9の細胞内タンパク質の安定性に対して影響を与えることが明らかとなった。これらの結果より、D-Ser合成酵素であるSRが軟骨細胞の分化過程を制御する可能性は充分に高いことが予想され、更なる研究計画の効率的実施によ...