Research Projects -
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難病における病的バリアントに特有な疾患進行メカニズムの解明
Grant number：24K10453 2024.04 - 2027.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
濱田 全紀, 中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 山田 大祐
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
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培養軟骨組織体における内軟骨性骨化抑制へのアプローチとメカニズムの解明
Grant number：24K12826 2024.04 - 2027.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
北口 陽平, 宝田 剛志, 太田 智之
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
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軟骨再生による変形性足関節症に対する新規治療の開発
Grant number：24K12374 2024.04 - 2027.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
雑賀 建多, 中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 高尾 知佳
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
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The lncRNA landscape of skeletal muscle cell biotransformation with aging.
Grant number：23K27845 2024.04 - 2026.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
伊藤 達男, 武井 直子, 浜田 道昭, 宝田 剛志, 山崎 晃, 清水 由梨香
Grant amount：\10400000 （ Direct expense: \8000000 、 Indirect expense：\2400000 ）
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Development of new treatment for cartilage regeneration for hip osteoarthritis
Grant number：23K08590 2023.04 - 2026.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
山田 和希, 中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 高尾 知佳, 山田 大祐
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
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Development of human-derived extracellular matrix product using scaffold-free tissue-engineered cartilage
Grant number：23K09099 2023.04 - 2026.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
太田 智之, 宝田 剛志, 高尾 知佳
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
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Spatiotemporal T-cell differentiation dynamics in the tumor "peripheral" environment
Grant number：22K19459 2022.06 - 2024.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory) Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
冨樫 庸介, 宝田 剛志
Grant amount：\6500000 （ Direct expense: \5000000 、 Indirect expense：\1500000 ）
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関節軟骨の光in vivoイメージング技術の開発
Grant number：22K09332 2022.04 - 2025.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
鉄永 智紀, 中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 高尾 知佳, 山田 大祐
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
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Filamin A mediated epithelial-mesenchymal transition during embryonic palate development
Grant number：22K10245 2022.04 - 2025.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
早野 暁, 宝田 剛志, 井澤 俊
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
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Development of new molecular targeted therapy for osteosarcoma lung metastasis
Grant number：22K09401 2022.04 - 2025.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 高尾 知佳, 山田 大祐
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
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新規肉腫モデルを用いた肉腫発生メカニズムの解明と治療標的分子同定の試み
Grant number：22K09378 2022.04 - 2025.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
上原 健敬, 中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 高尾 知佳, 山田 大祐
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
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ヒト関節軟骨オルガノイドを利用した革新的創薬スクリーニング技術の開発
Grant number：21H02643 2021.04 - 2025.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
宝田 剛志, 高尾 知佳, 山田 大祐, 戸口田 淳也
Grant amount：\17160000 （ Direct expense: \13200000 、 Indirect expense：\3960000 ）
高齢化が急速に進行する中で、膝関節軟骨の代表的疾患である変形性関節症（Osteoarthritis, OA）に対する薬物治療開発は遅々として進んでいない。ヒト生体環境/病態を模倣したハイスループット化合物スクリーニングシステムの開発は、薬剤開発の初期段階に極めて重要であるが、ヒト関節軟骨組織（硝子軟骨組織）を均一大量に調整することは従来不可能であった。申請者は、ヒト多能性幹細胞より、高い軟骨分化指向性を有し、拡大培養可能で、前向き品質管理が可能なヒト軟骨前駆細胞を大量に調整する技術を開発することに成功し、「ヒト」の硝子軟骨組織（＝ヒト関節軟骨オルガノイド）を「均一・大量」に、安定的に調整する準備が整った。本研究では、開発したヒト軟骨前駆細胞を細胞源とし、均一大量に作製したOA病態ヒト関節軟骨オルガノイドによるハイスループット化合物スクリーニング系を開発することで、OA治療候補化合物を同定し、独自に開発する疾患モデル動物での治療効果を検証することを目指す。この点において本年度は、ヒト多能性幹細胞株にpiggybacでのDOX inducible RUNX2発現カセットを導入し (hPSC-iRUNX2株の樹立)、同株より申請者らの開発した方法を使用して、ヒト軟骨前駆細胞（hCPC-iRUNX2）を樹立し、継代培養により増やした。DOXを添加することでRUNX2の発現が認められ系の確立に成功した。
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Development of tooth regenerative technology based on the spatiotemporal transcriptome analysis and iPS interference
Grant number：21H04842 2021.04 - 2025.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (A) Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
窪木 拓男, 大野 充昭, 辻 孝, 渡辺 亮, 宝田 剛志
Grant amount：\42510000 （ Direct expense: \32700000 、 Indirect expense：\9810000 ）
本申請研究では，「臓器としての歯の再生」を最終目的に，1細胞レベルでのRNA発現解析に加えて，時空間情報を加味した遺伝子発現解析法を駆使し，歯胚発生における1細胞レベル時空間的トランスクリプトームMapを構築し，これらのデータベースをもとに，iPS干渉法を応用し，歯原性上皮・間葉細胞の誘導方法を開発する.そして，器官原基法により，非歯原性細胞から，生理的機能を有した臓器としての歯を世界で初めて再生することを目的としている．
本年度は，歯胚発生における1細胞レベル時空間特異的トランスクリプトームMapを構築した．
具体的には，マウスE10.5，E11.5，E12.5，E14.5，E18.5の歯胚および非歯原性口腔粘膜組織を摘出し，酵素処理にて約1万細胞の単一細胞を得て，Single cell RNA-Seq (scRNA-Seq)解析し，どの細胞が，どの遺伝子を，どの程度発現しているか1細胞レベルで解析を行った．また，メッシュ状に位置情報となるインデックス配列が付加されたスライドガラスに，E10.5，E11.5，E12.5，E14.5，E16.5の歯胚を含むマウス頭部前頭断の凍結切片を貼り付け，HE染色を行い，組織学的情報を取得した．次に，スライド上でmRNAを単離，位置情報のインデックス配列が付加されたcDNAを合成し，ライブラリー作製後にシークエンスを行い，インデックス情報から，二次元空間での遺伝子発現情報を構築し，遺伝子発現Mapを構築した． -
悪性軟部腫瘍におけるPRRX1の機能解析とその新規薬物療法への応用
Grant number：21K07178 2021.04 - 2024.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
たき平 将太, 中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 山田 大祐
Grant amount：\4030000 （ Direct expense: \3100000 、 Indirect expense：\930000 ）
我々は転写制御因子Paired related homeobox 1(PRRX1)について研究を行ってきた。PRRX1は四肢骨格形成に強く関与しているが、腫瘍の悪性化に関与するとの報告がある。オープンデータベースの解析にて悪性軟部腫瘍の1つである悪性末梢神経鞘腫(MPNST)においてPRRX1が比較的高発現していることを見出した。ヒト腫瘍検体においてPRRX1の発現の多寡を免疫染色にて確認し高発現/低発現と群分けし予後と肺転移について相関を評価したところ、高発現グループにおいて５年生存率は低く、転移率も高い結果となった。次にレンチウイルスベクターを用いてPRRX1に対するshRNA(shPRRX1)をヒトMPNST細胞株に導入、PRRX1の発現を抑制した細胞株を作製し、対照群(空ベクター導入群)とshPRRX1導入群間で増殖能、遊走能、浸潤能を検討したところ、増殖能・遊走能・浸潤能いずれも低下する結果となった。次にPiggybac systemを用いてPRRX1をドキシサイクリン依存的に過剰発現させるヒトMPNST細胞株を樹立した。対照群(ドキシサイクリン未処理群)とPRRX1過剰発現群(ドキシサイクリン処理群)間で増殖能、遊走能、浸潤能を検討したところ、PRRX1過剰発現群では増殖能に変化はなく、遊走能、浸潤能は増加していた。次に、PRRX1の発現を抑制した細胞株と対照群、それぞれの細胞株をマウスに皮下移植を行ったところshPRRX1導入群では腫瘍径は有意に縮小していた。本研究によりPRRX1は腫瘍悪性化の原因の可能性が示唆され、その働きを阻害する薬剤を見いだすことで、本来治療が困難なことが多いとされる軟部肉腫に対する新規治療法となり得る可能性が考えられた。本研究では悪性腫瘍のメカニズムの一端を解明しうるだけでなく、新規創薬開発の点においても非常に重要性が高いと考える。
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ヒト肉腫自然発症モデルを利用した血中悪性化指標マーカーの探索
Grant number：21K07192 2021.04 - 2024.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
山田 大祐, 中田 英二, 宝田 剛志, 高尾 知佳
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
申請者らは、ヒト骨肉種では転写制御因子PRRX1が高発現していることを見出しているだけでなく、PRRX1の発現量が高い患者は予後不良を示すことも明らかにしている。さらに、マウス骨肉腫モデルでもPRRX1が発現しているだけでなく、ヒト骨肉腫細胞株143Bにおいては、PRRX1のノックダウンによって増殖性や浸潤性が低下するだけでなく、ドキソルビシンとシスプラチンへの抵抗性が解除されることも見出している。これらの研究実績は、Transl Oncol 誌(2021 Vol. 14 Issue 1 Pages 100960)にて発表を行い、骨肉腫におけるPRRX1の増悪因子としての機能を明らかにした。その後、悪性神経鞘腫においてもPRRX1が増悪因子として機能することも見出しており(未発表データ)、肉腫におけるPRRX1の重要性が明らかになってきている。また、Nature Biomedical Engineering誌(2021 Vol. 5 Issue 8 Pages 926-940)にて、ヒト多能性幹細胞から発生過程を模倣した分化誘導方法を用いて、肢芽間葉系細胞を作成する技術に関しての発表を行い、本研究課題を遂行するための研究ツールの開発にも成功している。研究成果は、AMED及び申請者の所属機関である岡山大学にてプレスリリースを行い、一般向けの内容紹介を掲載して公開されている。さらに、ヒト多能性幹細胞から作成した肺オルガノイドを用いて、前がん病変を再現することにも成功している(Int J Cancer 2021 Vol. 149 Issue 8 Pages 1593-1604)。以上の結果から、ヒト多能性幹細胞を用いた腫瘍モデルを構築するための実験技術に関しては、十分整っていると考えられる。
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光活性型Creシステムを利用した生体内遺伝子操作法の開発
Grant number：20K21373 2020.07 - 2023.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽) 挑戦的研究(萌芽)
宝田 剛志, 高尾 知佳, 山田 大祐, 佐藤 守俊
Grant amount：\6370000 （ Direct expense: \4900000 、 Indirect expense：\1470000 ）
生体内遺伝子操作の精度（時期特異性や、細胞種特異性）は、Cre recombinase (Cre)loxP 部位特異的 DNA組換え酵素反応の応用により格段に上昇した。青光照射でDNA組み換え反応をコントロールできる光活性型Cre(Photoactivatable(PA)-Cre)に着目し、このPA-Cre技術と、テトラサイクリン誘導発現系システム（TetON/OFF）のActb locusへのノックイン技術を組み合わせることで、in vivoでのlight/Dox-dependentなDNA組み換え反応を可能とする遺伝子改変マウス（TRE-PA-Creマウス）の開発に成功した。同マウスを使用することで、個体レベルでの光活性型Creシステムの有用性を実証し、免疫/幹細胞の細胞動態研究（例：どのタイミングで傷害部位へ遊走し、遊走後どれくらい滞在するのか？遊走後の細胞は分化/機能変化の点でどのような運命を辿るのか？）や、がん研究（例：遺伝子変異細胞の動態を極めて早期に生体内で観察）への応用を目指す。本年度は同マウスと交配するための、各種tTAマウス（ROSA-tTA:全身性にtTAを発現するマウス、Foxp3-tTAマウス：制御性T細胞にてtTAを発現するマウス、LepR-tTAマウス：LepR陽性間葉系間質細胞にてtTAを発現するマウス）の開発を実施した。それぞれについてtargeting vectorを作成し、CRISPR/Cas9の系でノックインさせることでマウスの樹立することを目指した。産仔のGenotypingの結果、正しくノックインされたマウスを選別することに成功したため、現在はマウスを増やし、。TRE-PA-Creマウスとの交配を実施中である。
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The role of extracellular vesicles of oral bacteria in systemic disease
Grant number：19H04051 2019.04 - 2023.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
岡村 裕彦, 江口 傑徳, 宝田 剛志, 吉田 賀弥, 池亀 美華, 江國 大輔, 伊原木 聰一郎
Grant amount：\17160000 （ Direct expense: \13200000 、 Indirect expense：\3960000 ）
歯周病原菌によって惹起される歯周病は，慢性炎症をともなう生活習慣病である。歯周病の病態の悪化が糖尿病などの全身性疾患の重症化に関与することが明らかになってきたが，現在でも高齢者を中心に８割以上の人々が何らかの歯周疾患を患っている。口腔は全身状態を示す鏡であり，健全な歯と口腔を維持することは，全身の健康にとって重要と認識されながらも，現状との間には依然として乖離がある。この原因として，歯周病と全身性疾患の重症化を関連づける明確な分子生物学的根拠が乏しいことが挙げられる。我々は，これらの疾患を関連づける新たな因子として歯周病原菌由来の『細胞外分泌小胞』に注目した。
当該年度は，１．歯周病原菌由来の『細胞外分泌小胞』の組織・細胞障害性を調べる。２．細胞外分泌小胞』に含まれる病原因子を同定し，その細胞障害性について調べることを目的とした。
歯周病原菌由来の『細胞外分泌小胞』を標識し，生体内での動向を可視化することに成功した。『細胞外分泌小胞』は，肝臓を含む遠隔臓器に集積した。また，このマウスではインスリンに対する応答性が減弱し，高いレベルの血糖値を示した。培養細胞を用いた実験により，『細胞外分泌小胞』は肝細胞において糖代謝に関わるシグナル伝達経路を阻害することが分かった。回収した『細胞外分泌小胞』からタンパク質を抽出し，質量分析により解析したところ，菌固有のタンパク質分解酵素などが含まれていた。以上の結果より，歯周病原菌は『細胞外分泌小胞』を介して細胞障害性因子を肝臓に到達させ，肝細胞の糖取り込みを抑制することで，糖尿病の重症化に関与すると考えられる。 -
The clarification of bone formation and absorption mechanism in the bone marrow microenvironment
Grant number：19H03842 2019.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Ono Mitsuaki
Grant amount：\17550000 （ Direct expense: \13500000 、 Indirect expense：\4050000 ）
BMP-2 has been widely studied for its potent ability to induce osteoblast differentiation and ectopic bone formation, and is already in clinical use worldwide. On the other hand, we have shown that BMP-2 inhibits bone formation in the bone marrow. However, the mechanism by which BMP-2 suppresses bone formation remains unclear. Therefore, we analyzed the detail of BMP-2 induced bone. Single cell RNA-seq analysis revealed that BMP-2-induced bone formed bone marrow with hematopoietic function. These results suggest that BMP-2 has the ability to regenerate bone marrow as an organ, and may suppress bone formation in the bone marrow in order to reserve space for hematopoiesis.
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Regulation of bone regeneration by exosomes and sugar chains derived from mechanical stress highly reactive mesenchymal stem cells
Grant number：19K07269 2019.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Ikegame Mika
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
We investigated the effect of exosomes secreted from preosteoblasts, on osteoblast differentiation and the effect of mechanical stress on the effect. As a result of adding exosomes obtained from the culture supernatant of the preosteoblast-like cell line (MC3T3-E1) to the osteoblast differentiation culture system, the expression of the osteoblast differentiation marker was suppressed. This effect was slightly strengthened in the exosomes from tensile-stressed cells. Therefore, it was suggested that exosomes produced from preosteoblasts have an osteoblast differentiation inhibitory effect, and that the inhibitory effect is enhanced by mechanical stress.
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Development of new combined cancer immunotherapy for malignant soft tissue tumor
Grant number：19K09551 2019.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Nakata Eiji
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
When PRRX1 was knocked down in an osteosarcoma cell line, which is a hyperlung metastatic strain, and the proliferative capacity was measured by the WST-8 assay, it was confirmed in vitro that the proliferation was strongly suppressed. It was also confirmed that when these cells were transplanted into mice, proliferation was suppressed as compared with the control group. In addition, when the osteosarcoma cells in which PRRX1 was knocked down were examined by wound healing assay and migration assay, the number of invading cells was reduced compared to the control group. Furthermore, osteosarcoma cells in which PRRX1 was knocked down were transplanted under the skin of mice, and 6 weeks later, the lungs of the mice were taken out and the number and size of lung metastases were compared with those of the control group. Then, it was found that the osteosarcoma cell group in which PRRX1 was knocked down had a smaller number of lung metastases.
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Malnutrition delayed wound healing by HMGB1-related prolonged inflammation
Grant number：19K10128 2019.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Yamashiro Keisuke
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
In Japan, the gap between average life expectancy and healty life expectancy bacomes a big problem. This divergence is caused by diseases such as fractures and lifestyle-related diseases in the elderly. Malnutrition is one of the causes of further exacerbation of these diseases. In this study, we hypothesized that HMGB1, an inflammation mediator, is involved as one of the causes of prolonged inflammation during malnutrition. We made the malnutrition model mice and observed the wound healing process after tooth extraction. The factors related to inflammation (HMGB1 and IL-1β) expression were increasedand the actores related to regeneration and mesenchymal stem cells were decreased in the malnutriotion group compared to the control group. From these results, it was clarified that HMGB1-mediated delayed wound healing occurs in malnutrition.
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I型インターフェロンが顎顔面の形態形成に及ぼす影響
Grant number：19K10381 2019.04 - 2022.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
早野 暁, 川邉 紀章, 宝田 剛志
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
本研究の目的であるI型インターフェロンの機能亢進による全身性骨形成不全の発生機序を解明するため、Singleton-Merten Syndrome 患者および対照群となる健常患者の抜去歯から間葉系幹細胞を単離し、骨芽細胞への分化を試みた。また同時に、健常患者の抜去歯から単離した間葉系幹細胞にI型インターフェロンのリコンビナントプロテイン（IFN-alfa-2a, IFN-alfa-2b, IFN-beta）添加した実験群と、同じく健常患者由来の間葉系幹細胞にI型インターフェロンを添加しない対照群とで骨芽細胞への分化を試みた。どちらの実験でもI型インターフェロンが亢進している群において、重度の骨芽細胞への分化抑制が認められた。興味深いことに後者の実験から骨芽細胞への分化抑制は特にIFN-betaにおいて著しいことが分かった。
これら一連の結果の原因を解明するため、培養後の細胞からRNAを単離し、qPCR法によって骨芽細胞分化マーカー、p53経路の活性、細胞死の状況を確認した。我々の当初の仮説では、I型インターフェロンの機能亢進が間葉系幹細胞においてp53細胞死経路を活性化することで骨芽細胞への分化抑制が生じていると考えていたが、予想に反してp53細胞死経路の活性化はI型インターフェロン亢進群では見られなかった。つまり、I型インターフェロンによる骨芽細胞への分化抑制はアポトーシスによるものではない可能性が示唆された。
この結果はSingleton-Merten Syndrome の全身性骨形成不全の原因を解明する上で非常に重要な情報だと言える。 -
Grant number：18K19646 2018.06 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory) Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Kuboki Takuo
Grant amount：\6240000 （ Direct expense: \4800000 、 Indirect expense：\1440000 ）
Stem cells are required for lifelong homeostasis and regeneration of organs and tissues in mammals. However, aging of stem cells reduces cellular function and results in dysfunctional organs and tissues. Therefore, maintenance of the stemness of stem cells is of crucial importance, although its mechanisms are still unclear. The aim of this study was to identify the master regulator for the maintenance of stemness of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). First, we compared the RNA expression patterns between BMSCs derived from young and old mice, as well as between human BMSCs and human dermal fibroblasts using RNA-seq, and found that 30 transcription factors were highly expressed in BMSCs derived from young mice and in human BMSCs. Next, we found that several transcription factors could inhibit the induction to pluripotent stem (iPS) cells using iPS interfering method. The detailed function of these transcription factors in BMSCs are now being investigated.
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Grant number：18H02991 2018.04 - 2021.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Kuboki Takuo
Grant amount：\17550000 （ Direct expense: \13500000 、 Indirect expense：\4050000 ）
Whole-tooth regeneration is ultimate goal in dental field and the goal of this study is to identify the master transcription factors that characterize tooth germ derived epithelial and mesenchymal cells and develop method to generate those cells. First, we analyzed the mouse embryonic tooth germ and human stem cell from the apical papilla (hSCAP) by RNA-Seq and performed iPS interference to identify the potential transcription factors. Finally, candidate transcription factors were overexpressed in human adult dermal fibroblast (hADF), resulting that hADF was induced into the cells similar to tooth germ derived mesenchymal cells.
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Grant number：18K09832 2018.04 - 2021.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Kawanabe Noriaki
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
In this study, we conducted experiments to clarify the effects of the trigeminal nerve and facial nerve on the morphology of the maxillofacial region during growth. As a result of nerve activity blocking experiments and nerve activity activation experiments of the trigeminal nerve and facial nerve of rats, a decrease in the formation rate of cut teeth, calcification of the pulp, and disorder of the arrangement of ameloblasts and odontoblasts were observed. It was. In addition, as a result of analyzing Sonic hedgehog (Shh) gene-deficient mice and Shh gene-expressing mice, changes in bone and tooth morphology that are thought to be the effect of Shh on long-term maxillofacial morphogenesis were observed. As a result of conducting an experiment using fluorescence bioimaging, no characteristic stem cell dynamics were observed with or without nerve activity blocking / activation.
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Grant number：17H04399 2017.04 - 2021.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Takarada Takeshi
Grant amount：\16640000 （ Direct expense: \12800000 、 Indirect expense：\3840000 ）
In this study, we generated a tTA-dependent photoactivatable Cre-loxP recombinase knock-in mouse model (TRE-PA-Cre mice) using a CRISPR/Cas9 system. These mice were crossed with ROSA26-tdTomato mice (Cre reporter mouse) to visualize DNA recombination as marked by tdTomato expression. We demonstrated that external noninvasive LED blue light illumination allows efficient DNA recombination in the liver of TRE-PA-Cre:ROSA26-tdTomato mice transfected with tTA expression vectors using hydrodynamic tail vein injection. The TRE-PA-Cre mouse established here promises to be useful for optogenetic genome engineering in a noninvasive, spatiotemporal, and cell-type specific manner in vivo.
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Grant number：17K11750 2017.04 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Kimura-Ono Aya
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
Recently, we successfully regenerated the cortical bone-like bone, which is important to maintain the long-term stability of regenerated bone, using Escherichia coli-derived rhBMP-2 (E-rhBMP-2) adsorbed in PLGA membrane in rat model. The purpose of this study was to evaluate the E-rhBMP-2/PLGA membrane using peri-implantitis canine model. First, we generated the peri-implantitis model using beagle dogs and transplanted the autogenous bone to evaluate this animal model. Interestingly, autogenous bone graft could not recover the bone defect caused by peri-implantitis. Next, we transplanted the β-TCP containing E-rhBMP-2 in bone defects and covered with PLGA membrane containing E-rhBMP-2. Only β-TCP containing E-rhBMP-2 was transplanted as control group. As a result, PLGA membrane containing E-rhBMP-2 induced bone formation compared with control group. In conclusion, the PLGA membrane containing E-rhBMP-2 was efficient in bone formation in a peri-implantitis model in beagle dogs.
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必須アミノ酸トリプトファンによる幹細胞老化制御機構の解明・骨質改善治療への応用
Grant number：17K11751 2017.04 - 2018.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
笈田 育尚, 窪木 拓男, 大野 彩, 宝田 剛志, 大野 充昭
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
口腔インプラント治療は，人工歯根が歯槽骨や顎骨と結合することにより強固な骨支持を得るため，骨量と骨質が重要な因子となる．しかし，日本人は欧米人と比べ歯槽骨が解剖学的に菲薄で，インプラント体埋入のために骨造成が必要な場合も少なくない．また，高齢化の進む日本で増加傾向にある骨粗鬆症患者へ口腔インプラント治療がなされる場合も多く，多くの研究者が骨造成や骨質改善に関する研究を進めてきた．
我々は，これまでの研究から骨髄由来間葉系幹細胞の幹細胞性維持という観点からスクリーニングし，同定したトリプトファンが，骨質改善や骨の創傷治癒を促進することが明らかにした．この結果は，トリプトファンの投与が口腔インプラントの骨結合促進においても有用である可能性を強く示唆するものである．しかし，口腔インプラントの埋入に伴うトリプトファンの投与が，①骨のリモデリングを担う骨芽細胞，破骨細胞や間葉系幹細胞にどのような影響を与えるのか，また，②インプラント体の初期固定や長期予後に有意に働くのか，また，トリプトファンによる幹細胞の活性化が骨粗鬆症をはじめとする老化疾患に対して有効なのか，未だその詳細は明らかでない．
そこで，本研究ではトリプトファンの骨代謝関連細胞に与える効果の検討を行うこととした．トリプトファンと間葉系幹細胞の骨芽細胞分化との関係性は明らかにしてきたが，破骨細胞との関係性は未だ不明である．はじめに，トリプトファンが破骨細胞分化に与える影響を検討した．すなわちトリプトファンを投与したマウスの大腿骨を経時的 (0, 3, 7, 14日)にサンプリングし，組織学的，分子生物学的に検討する計画をした．しかし本研究では研究期間が短く解析，評価するまでには至らなかった．
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Pericyte imaging for the early detection of psychiatric diseases
Grant number：16KT0192 2016.07 - 2019.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Takarada Takeshi
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
In this study, we focused on the loss of pericyte existing around the cerebrovascular in Bmal1 KO mice, and tried to develop the tools for visualizing the pericyte for the purpose of directing early detection of the disease. As a result, we have found that the circadian clock system regulates PDGFRβ expression in the pericyte, followed by the regulation of the astrocyte activation state through modulation of cerebral vascular permeability. In addition, we have developped a PET/SPECT imaging probe using IQP, which is a compound having high affinity to PDGFRβ .
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体内時計制御グリアネットワークによる「精神-疼痛」連関メカニズムの解明
Grant number：16H01332 2016.04 - 2018.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型) 新学術領域研究(研究領域提案型)
宝田 剛志
Grant amount：\9490000 （ Direct expense: \7300000 、 Indirect expense：\2190000 ）
グリア病である神経障害性疼痛は、精神的ストレスや精神疾患との関連性が臨床上指摘されている（うつを伴う慢性痛、統合失調症や自閉スペクトラム症での痛覚鈍麻など）。しかし、この「精神と疼痛(痛み)」の関連性（連関）の分子基盤は未解明である。本研究では、睡眠障害やうつ等の精神疾患に関連性が深い時計システム（体内時計）に注目し、「体内時計によるグリアネットワークの制御」という観点から、この「精神と疼痛」の謎に挑んだ。我々の解析結果より、睡眠障害等の精神疾患との関連性が深い体内時計システムが破綻したマウス(Bmal1欠損マウス)では、脳・脊髄組織でのアストロサイトの異常活性化が認められた。同マウスにて行動学的解析を実施した結果、多動といった精神行動異常が観察されただけでなく、神経障害性疼痛モデルを実施した結果、神経障害時におけるアロディニアが消失していた。更なる解析の結果、この病態は、血管周囲に存在するアストロサイト-ペリサイトアセンブリ異常による血液脳関門（BBB）破綻に起因することを見出した(J Neurosci.37:10052-10062,2017)。つまり、BBB恒常性は体内時計システムによるグリアネットワークの上に成り立ち、そのシステム破綻は、アストロサイトの異常活性化という段階を経て、精神/疼痛機構を共に破綻させることが示唆される。また、体内時計システムが破綻したマウスでは、脳幹部位特異的な炎症性サイトカインの上昇が観察され、脳幹の特定神経核での異常が行動異常の原因である可能性を見出した。
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in vivo analysis of Mesenchymal stem cells using Runx2 conditional KO mouse
Grant number：26460387 2014 - 2016
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Takarada Takeshi, Hinoi Eiichi
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\5070000 （ Direct expense: \3900000 、 Indirect expense：\1170000 ）
The cellular origin and essential period for Runx2 function during osteoblast differentiation in intramembranous ossification remain poorly understood. Paired related homeobox 1 (Prx1) is expressed in craniofacial mesenchyme, and Runx2 deficiency in Prx1+-derived cells (Runx2prx1－/－ mice) resulted in defective intramembranous ossification. Double-positive cells for Prx1-GFP and stem cell antigen-1 (Sca1) (Prx1+Sca1+ cells) in the calvaria expressed Runx2 at lower levels and were more homogeneous and primitive as compared with Prx1+Sca1－ cells. These findings indicate that the essential period of Runx2 function on intramembranous ossification would begin at the Prx1+Sca1+ mesenchymal stem cell stage and end at the Osx+Prx1－Sca1－ osteoblast precursor stage.
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体内時計によるグリアネットワーク調節に注目した「精神-疼痛」連関メカニズムの解明
Grant number：26117507 2014 - 2015
文部科学省 科学研究費補助金(新学術領域研究(研究領域提案型)) 新学術領域研究(研究領域提案型)
宝田 剛志
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\8320000 （ Direct expense: \6400000 、 Indirect expense：\1920000 ）
グリア病である神経障害性疼痛は、精神的ストレスや精神疾患との関連性が臨床上指摘されている（うつを伴う慢性痛、統合失調症や自閉スペクトラム症での痛覚鈍麻など）。しかし、この「精神と疼痛(痛み)」の関連性（連関）の分子基盤は未解明である。
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我々の解析結果より、睡眠障害等の精神疾患との関連性が深い体内時計システムが破綻したマウスでは、行動・疼痛機能の異常とともに、脳・脊髄組織でのアストロサイトでの異常活性化が認められる。これにより、血管周囲に存在するアストロサイト-ペリサイトアセンブリが異常をきたす可能性を提唱した。つまり、BBB恒常性は体内時計システムによるグリアネットワークの上に成り立つことを示唆するものである。 -
Grant number：22659065 2010 - 2011
Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology Grants-in-Aid for Scientific Research(挑戦的萌芽研究) 挑戦的萌芽研究
Eiichi HINOI, Takeshi TAKARADA
Authorship：Collaborating Investigator(s) (not designated on Grant-in-Aid) Grant type：Competitive
Grant amount：\3030000 （ Direct expense: \2700000 、 Indirect expense：\330000 ）
We identified GDF15 as an endocrine factor secreted from osteocytes. Recombinant GDF15 significantly promoted osteoclastic differentiation. The anti-GDF15 antibody prevented bone loss through inhibiting osteoclastic activation in tibias from mice with femoral artery ligation in vivo. These findings suggest that GDF15 could play a pivotal role in the pathogenesis of bone loss relevant to hypoxia through promotion of osteoclastogenesis after secretion from adjacent osteocytes during disuse and/or ischemia in bone.
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Regulatory mechanisms of central nervous system by Runx2
Grant number：22500330 2010 - 2011
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
TAKARADA Takeshi, HINOI Eiichi
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\3510000 （ Direct expense: \2700000 、 Indirect expense：\810000 ）
We have previously shown the functional expression of glutamatergic and GABAergic signaling machineries in different osseous cells including osteoblasts. Runt-related factor 2 (Runx2) is the master regulator of osteoblastic differentiation with ability to accelerate differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts, while we have also demonstrated the expression of mRNA and corresponding protein for Runx2. In this study, we for the first time generated mice carrying a conditional Runx2 allele with exon 4, which encodes the Runt domain, flanked by loxP sites. These mice were crossed with α1(I)-collagen-Cre or α1(II)-collagen-Cre transgenic mice to obtain osteoblast- or chondrocyte-specific Runx2 deficient mice, respectively. In newborn α1(II)-Cre;Runx2^flox/flox mice, mineralization impairment was restricted to skeletal areas undergoing endochondral ossification including long bones and vertebrae. In contrast, no apparent skeletal abnormalities were seen in mutant embryo, newborn, and 3- to 6-week old-mice in which Runx2 had been deleted with the α1(I)-collagen-Cre driver. The Runx2 floxed allele established here is undoubtedly useful for investigating the role of Runx2 in particular cells.
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Grant number：20790250 2008 - 2009
Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology Grants-in-Aid for Scientific Research(若手研究(B)) 若手研究(B)
Takeshi TAKARADA
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
We have investigated the possible role of clock genes in mechanism underlying the regulation of chondrogenic differentiation processes. The results suggested that chondrogenic differentiation may be modulated by clock genes expressed by chondrocytes in association with the inhibition by Per1 of Bmal1/Clock-dependent indian hedgehog expression.
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新規シグナル分子によるグリアニューロン相互回路網構築の可能性探究
Grant number：18053009 2006 - 2007
文部科学省 科学研究費補助金(特定領域研究) 特定領域研究
米田幸雄, 寳田剛志
Grant type：Competitive
Grant amount：\6100000 （ Direct expense: \6100000 ）
本研究では、脳内神経情報伝達物質が骨関節系細胞において細胞間情報伝達に利用される事実に基づいて、骨関節系細胞における情報分子群について脳内ニューロンおよびグリア細胞における機能的発現の可能性を探索した。特に、Runt related factor-2(Runx2)は間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化と成熟過程に必須の転写制御因子であるが、中枢神経系における発現解析は全く行われていない。したがって本研究ではRunx2に焦点を当てて、その中枢神経系における機能的発現の可能性を追究するとともに、一過性脳虚血時における病態生理学的役割について検討した。RT-PCR法による解析の結果、ラット大脳皮質由来培養アストログリア細胞およびC6グリオーマ細胞ともにRunx2のmRNA発現が認められた。C6グリオーマ細胞にRunx2の発現ベクターを導入すると、Matrix metalloproteinase-13(MMP13)のmRNA発現量が有意に上昇することが明らかとなった。次いで、中大脳動脈結紮(MCAO)ラット脳におけるMMP13発現を検討した結果、MCAO負荷により梗塞側でMMP13のmRNA発現量の著明な上昇が認められた。以上の結果より、Runx2は中枢神経系内でも特にアストログリア細胞に強く発現するだけでなく、MMP13の発現制御を介して脳虚血病態出現に何らかの関与を示す可能性が示唆される。
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細胞間コミュニケーションにおけるセリン光学異性体に関する研究
Grant number：17790057 2005 - 2006
文部科学省 科学研究費補助金(若手研究(B)) 若手研究(B)
宝田剛志
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\3400000 （ Direct expense: \3400000 ）
我々の研究グループでは、以前より骨関節組織を構成する骨芽細胞、破骨細胞および軟骨細胞の分化段階を制御する因子の探索を行っているが、近年中枢神経系において興奮性情報伝達物質として機能するグルタミン酸(Glu)が、これらの細胞において情報伝達物質として機能することを世界に先駆けて報告した。我々は、Gluシグナリング機構に関連する因子が骨関節組織においても存在するのではないかとの仮説に基づき、中枢神経系のGlu受容体の一種であるNMDA受容体の機能制御を行うD-Serの軟骨細胞分化に与える影響について解析を始めた。現在までのところ、培養骨芽細胞および軟骨細胞において、D-Ser合成酵素であるSRのmRNAおよびタンパク質の発現を認めており、またラット脛骨の組織切片を用いたin situ hybridization法においても骨芽細胞および軟骨細胞におけるSR mRNAの局在性を確認している。前軟骨細胞株であるATDC5細胞にSRを強制的に安定発現させた結果、軟骨細胞分化の指標であるアルシアンブルーの染色性が有意に抑制され、これが軟骨細胞分化過程において重要な役割を果たすSOX9の細胞内タンパク質の安定性に対して影響を与えることが明らかとなった。これらの結果より、D-Ser合成酵素であるSRが軟骨細胞の分化過程を制御する可能性は充分に高いことが予想され、更なる研究計画の効率的実施によ...