Research Projects -
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難病における病的バリアントに特有な疾患進行メカニズムの解明
Grant number：24K10453 2024.04 - 2027.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
濱田 全紀, 中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 山田 大祐
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
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培養軟骨組織体における内軟骨性骨化抑制へのアプローチとメカニズムの解明
Grant number：24K12826 2024.04 - 2027.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
北口 陽平, 宝田 剛志, 太田 智之
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
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軟骨再生による変形性足関節症に対する新規治療の開発
Grant number：24K12374 2024.04 - 2027.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
雑賀 建多, 中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 高尾 知佳
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
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The lncRNA landscape of skeletal muscle cell biotransformation with aging.
Grant number：23K27845 2024.04 - 2026.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
伊藤 達男, 武井 直子, 浜田 道昭, 宝田 剛志, 山崎 晃, 清水 由梨香
Grant amount：\10400000 （ Direct expense: \8000000 、 Indirect expense：\2400000 ）
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Development of new treatment for cartilage regeneration for hip osteoarthritis
Grant number：23K08590 2023.04 - 2026.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
山田 和希, 中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 高尾 知佳, 山田 大祐
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
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Development of human-derived extracellular matrix product using scaffold-free tissue-engineered cartilage
Grant number：23K09099 2023.04 - 2026.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
太田 智之, 宝田 剛志, 高尾 知佳
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
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Spatiotemporal T-cell differentiation dynamics in the tumor "peripheral" environment
Grant number：22K19459 2022.06 - 2024.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory) Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
冨樫 庸介, 宝田 剛志
Grant amount：\6500000 （ Direct expense: \5000000 、 Indirect expense：\1500000 ）
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関節軟骨の光in vivoイメージング技術の開発
Grant number：22K09332 2022.04 - 2025.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
鉄永 智紀, 中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 高尾 知佳, 山田 大祐
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
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Filamin A mediated epithelial-mesenchymal transition during embryonic palate development
Grant number：22K10245 2022.04 - 2025.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
早野 暁, 宝田 剛志, 井澤 俊
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
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Development of new molecular targeted therapy for osteosarcoma lung metastasis
Grant number：22K09401 2022.04 - 2025.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 高尾 知佳, 山田 大祐
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
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新規肉腫モデルを用いた肉腫発生メカニズムの解明と治療標的分子同定の試み
Grant number：22K09378 2022.04 - 2025.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
上原 健敬, 中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 高尾 知佳, 山田 大祐
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
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ヒト関節軟骨オルガノイドを利用した革新的創薬スクリーニング技術の開発
Grant number：21H02643 2021.04 - 2025.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
宝田 剛志, 高尾 知佳, 山田 大祐, 戸口田 淳也
Grant amount：\17160000 （ Direct expense: \13200000 、 Indirect expense：\3960000 ）
高齢化が急速に進行する中で、膝関節軟骨の代表的疾患である変形性関節症（Osteoarthritis, OA）に対する薬物治療開発は遅々として進んでいない。ヒト生体環境/病態を模倣したハイスループット化合物スクリーニングシステムの開発は、薬剤開発の初期段階に極めて重要であるが、ヒト関節軟骨組織（硝子軟骨組織）を均一大量に調整することは従来不可能であった。申請者は、ヒト多能性幹細胞より、高い軟骨分化指向性を有し、拡大培養可能で、前向き品質管理が可能なヒト軟骨前駆細胞を大量に調整する技術を開発することに成功し、「ヒト」の硝子軟骨組織（＝ヒト関節軟骨オルガノイド）を「均一・大量」に、安定的に調整する準備が整った。本研究では、開発したヒト軟骨前駆細胞を細胞源とし、均一大量に作製したOA病態ヒト関節軟骨オルガノイドによるハイスループット化合物スクリーニング系を開発することで、OA治療候補化合物を同定し、独自に開発する疾患モデル動物での治療効果を検証することを目指す。この点において本年度は、ヒト多能性幹細胞株にpiggybacでのDOX inducible RUNX2発現カセットを導入し (hPSC-iRUNX2株の樹立)、同株より申請者らの開発した方法を使用して、ヒト軟骨前駆細胞（hCPC-iRUNX2）を樹立し、継代培養により増やした。DOXを添加することでRUNX2の発現が認められ系の確立に成功した。
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Development of tooth regenerative technology based on the spatiotemporal transcriptome analysis and iPS interference
Grant number：21H04842 2021.04 - 2025.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (A) Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
窪木 拓男, 大野 充昭, 辻 孝, 渡辺 亮, 宝田 剛志
Grant amount：\42510000 （ Direct expense: \32700000 、 Indirect expense：\9810000 ）
本申請研究では，「臓器としての歯の再生」を最終目的に，1細胞レベルでのRNA発現解析に加えて，時空間情報を加味した遺伝子発現解析法を駆使し，歯胚発生における1細胞レベル時空間的トランスクリプトームMapを構築し，これらのデータベースをもとに，iPS干渉法を応用し，歯原性上皮・間葉細胞の誘導方法を開発する.そして，器官原基法により，非歯原性細胞から，生理的機能を有した臓器としての歯を世界で初めて再生することを目的としている．
本年度は，歯胚発生における1細胞レベル時空間特異的トランスクリプトームMapを構築した．
具体的には，マウスE10.5，E11.5，E12.5，E14.5，E18.5の歯胚および非歯原性口腔粘膜組織を摘出し，酵素処理にて約1万細胞の単一細胞を得て，Single cell RNA-Seq (scRNA-Seq)解析し，どの細胞が，どの遺伝子を，どの程度発現しているか1細胞レベルで解析を行った．また，メッシュ状に位置情報となるインデックス配列が付加されたスライドガラスに，E10.5，E11.5，E12.5，E14.5，E16.5の歯胚を含むマウス頭部前頭断の凍結切片を貼り付け，HE染色を行い，組織学的情報を取得した．次に，スライド上でmRNAを単離，位置情報のインデックス配列が付加されたcDNAを合成し，ライブラリー作製後にシークエンスを行い，インデックス情報から，二次元空間での遺伝子発現情報を構築し，遺伝子発現Mapを構築した． -
悪性軟部腫瘍におけるPRRX1の機能解析とその新規薬物療法への応用
Grant number：21K07178 2021.04 - 2024.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
たき平 将太, 中田 英二, 宝田 剛志, 尾崎 敏文, 山田 大祐
Grant amount：\4030000 （ Direct expense: \3100000 、 Indirect expense：\930000 ）
我々は転写制御因子Paired related homeobox 1(PRRX1)について研究を行ってきた。PRRX1は四肢骨格形成に強く関与しているが、腫瘍の悪性化に関与するとの報告がある。オープンデータベースの解析にて悪性軟部腫瘍の1つである悪性末梢神経鞘腫(MPNST)においてPRRX1が比較的高発現していることを見出した。ヒト腫瘍検体においてPRRX1の発現の多寡を免疫染色にて確認し高発現/低発現と群分けし予後と肺転移について相関を評価したところ、高発現グループにおいて５年生存率は低く、転移率も高い結果となった。次にレンチウイルスベクターを用いてPRRX1に対するshRNA(shPRRX1)をヒトMPNST細胞株に導入、PRRX1の発現を抑制した細胞株を作製し、対照群(空ベクター導入群)とshPRRX1導入群間で増殖能、遊走能、浸潤能を検討したところ、増殖能・遊走能・浸潤能いずれも低下する結果となった。次にPiggybac systemを用いてPRRX1をドキシサイクリン依存的に過剰発現させるヒトMPNST細胞株を樹立した。対照群(ドキシサイクリン未処理群)とPRRX1過剰発現群(ドキシサイクリン処理群)間で増殖能、遊走能、浸潤能を検討したところ、PRRX1過剰発現群では増殖能に変化はなく、遊走能、浸潤能は増加していた。次に、PRRX1の発現を抑制した細胞株と対照群、それぞれの細胞株をマウスに皮下移植を行ったところshPRRX1導入群では腫瘍径は有意に縮小していた。本研究によりPRRX1は腫瘍悪性化の原因の可能性が示唆され、その働きを阻害する薬剤を見いだすことで、本来治療が困難なことが多いとされる軟部肉腫に対する新規治療法となり得る可能性が考えられた。本研究では悪性腫瘍のメカニズムの一端を解明しうるだけでなく、新規創薬開発の点においても非常に重要性が高いと考える。
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ヒト肉腫自然発症モデルを利用した血中悪性化指標マーカーの探索
Grant number：21K07192 2021.04 - 2024.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
山田 大祐, 中田 英二, 宝田 剛志, 高尾 知佳
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
申請者らは、ヒト骨肉種では転写制御因子PRRX1が高発現していることを見出しているだけでなく、PRRX1の発現量が高い患者は予後不良を示すことも明らかにしている。さらに、マウス骨肉腫モデルでもPRRX1が発現しているだけでなく、ヒト骨肉腫細胞株143Bにおいては、PRRX1のノックダウンによって増殖性や浸潤性が低下するだけでなく、ドキソルビシンとシスプラチンへの抵抗性が解除されることも見出している。これらの研究実績は、Transl Oncol 誌(2021 Vol. 14 Issue 1 Pages 100960)にて発表を行い、骨肉腫におけるPRRX1の増悪因子としての機能を明らかにした。その後、悪性神経鞘腫においてもPRRX1が増悪因子として機能することも見出しており(未発表データ)、肉腫におけるPRRX1の重要性が明らかになってきている。また、Nature Biomedical Engineering誌(2021 Vol. 5 Issue 8 Pages 926-940)にて、ヒト多能性幹細胞から発生過程を模倣した分化誘導方法を用いて、肢芽間葉系細胞を作成する技術に関しての発表を行い、本研究課題を遂行するための研究ツールの開発にも成功している。研究成果は、AMED及び申請者の所属機関である岡山大学にてプレスリリースを行い、一般向けの内容紹介を掲載して公開されている。さらに、ヒト多能性幹細胞から作成した肺オルガノイドを用いて、前がん病変を再現することにも成功している(Int J Cancer 2021 Vol. 149 Issue 8 Pages 1593-1604)。以上の結果から、ヒト多能性幹細胞を用いた腫瘍モデルを構築するための実験技術に関しては、十分整っていると考えられる。
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光活性型Creシステムを利用した生体内遺伝子操作法の開発
Grant number：20K21373 2020.07 - 2023.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽) 挑戦的研究(萌芽)
宝田 剛志, 高尾 知佳, 山田 大祐, 佐藤 守俊
Grant amount：\6370000 （ Direct expense: \4900000 、 Indirect expense：\1470000 ）
生体内遺伝子操作の精度（時期特異性や、細胞種特異性）は、Cre recombinase (Cre)loxP 部位特異的 DNA組換え酵素反応の応用により格段に上昇した。青光照射でDNA組み換え反応をコントロールできる光活性型Cre(Photoactivatable(PA)-Cre)に着目し、このPA-Cre技術と、テトラサイクリン誘導発現系システム（TetON/OFF）のActb locusへのノックイン技術を組み合わせることで、in vivoでのlight/Dox-dependentなDNA組み換え反応を可能とする遺伝子改変マウス（TRE-PA-Creマウス）の開発に成功した。同マウスを使用することで、個体レベルでの光活性型Creシステムの有用性を実証し、免疫/幹細胞の細胞動態研究（例：どのタイミングで傷害部位へ遊走し、遊走後どれくらい滞在するのか？遊走後の細胞は分化/機能変化の点でどのような運命を辿るのか？）や、がん研究（例：遺伝子変異細胞の動態を極めて早期に生体内で観察）への応用を目指す。本年度は同マウスと交配するための、各種tTAマウス（ROSA-tTA:全身性にtTAを発現するマウス、Foxp3-tTAマウス：制御性T細胞にてtTAを発現するマウス、LepR-tTAマウス：LepR陽性間葉系間質細胞にてtTAを発現するマウス）の開発を実施した。それぞれについてtargeting vectorを作成し、CRISPR/Cas9の系でノックインさせることでマウスの樹立することを目指した。産仔のGenotypingの結果、正しくノックインされたマウスを選別することに成功したため、現在はマウスを増やし、。TRE-PA-Creマウスとの交配を実施中である。
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The role of extracellular vesicles of oral bacteria in systemic disease
Grant number：19H04051 2019.04 - 2023.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
岡村 裕彦, 江口 傑徳, 宝田 剛志, 吉田 賀弥, 池亀 美華, 江國 大輔, 伊原木 聰一郎
Grant amount：\17160000 （ Direct expense: \13200000 、 Indirect expense：\3960000 ）
歯周病原菌によって惹起される歯周病は，慢性炎症をともなう生活習慣病である。歯周病の病態の悪化が糖尿病などの全身性疾患の重症化に関与することが明らかになってきたが，現在でも高齢者を中心に８割以上の人々が何らかの歯周疾患を患っている。口腔は全身状態を示す鏡であり，健全な歯と口腔を維持することは，全身の健康にとって重要と認識されながらも，現状との間には依然として乖離がある。この原因として，歯周病と全身性疾患の重症化を関連づける明確な分子生物学的根拠が乏しいことが挙げられる。我々は，これらの疾患を関連づける新たな因子として歯周病原菌由来の『細胞外分泌小胞』に注目した。
当該年度は，１．歯周病原菌由来の『細胞外分泌小胞』の組織・細胞障害性を調べる。２．細胞外分泌小胞』に含まれる病原因子を同定し，その細胞障害性について調べることを目的とした。
歯周病原菌由来の『細胞外分泌小胞』を標識し，生体内での動向を可視化することに成功した。『細胞外分泌小胞』は，肝臓を含む遠隔臓器に集積した。また，このマウスではインスリンに対する応答性が減弱し，高いレベルの血糖値を示した。培養細胞を用いた実験により，『細胞外分泌小胞』は肝細胞において糖代謝に関わるシグナル伝達経路を阻害することが分かった。回収した『細胞外分泌小胞』からタンパク質を抽出し，質量分析により解析したところ，菌固有のタンパク質分解酵素などが含まれていた。以上の結果より，歯周病原菌は『細胞外分泌小胞』を介して細胞障害性因子を肝臓に到達させ，肝細胞の糖取り込みを抑制することで，糖尿病の重症化に関与すると考えられる。 -
The clarification of bone formation and absorption mechanism in the bone marrow microenvironment
Grant number：19H03842 2019.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Ono Mitsuaki
Grant amount：\17550000 （ Direct expense: \13500000 、 Indirect expense：\4050000 ）
BMP-2 has been widely studied for its potent ability to induce osteoblast differentiation and ectopic bone formation, and is already in clinical use worldwide. On the other hand, we have shown that BMP-2 inhibits bone formation in the bone marrow. However, the mechanism by which BMP-2 suppresses bone formation remains unclear. Therefore, we analyzed the detail of BMP-2 induced bone. Single cell RNA-seq analysis revealed that BMP-2-induced bone formed bone marrow with hematopoietic function. These results suggest that BMP-2 has the ability to regenerate bone marrow as an organ, and may suppress bone formation in the bone marrow in order to reserve space for hematopoiesis.
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Regulation of bone regeneration by exosomes and sugar chains derived from mechanical stress highly reactive mesenchymal stem cells
Grant number：19K07269 2019.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Ikegame Mika
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
We investigated the effect of exosomes secreted from preosteoblasts, on osteoblast differentiation and the effect of mechanical stress on the effect. As a result of adding exosomes obtained from the culture supernatant of the preosteoblast-like cell line (MC3T3-E1) to the osteoblast differentiation culture system, the expression of the osteoblast differentiation marker was suppressed. This effect was slightly strengthened in the exosomes from tensile-stressed cells. Therefore, it was suggested that exosomes produced from preosteoblasts have an osteoblast differentiation inhibitory effect, and that the inhibitory effect is enhanced by mechanical stress.
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Development of new combined cancer immunotherapy for malignant soft tissue tumor
Grant number：19K09551 2019.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Nakata Eiji
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
When PRRX1 was knocked down in an osteosarcoma cell line, which is a hyperlung metastatic strain, and the proliferative capacity was measured by the WST-8 assay, it was confirmed in vitro that the proliferation was strongly suppressed. It was also confirmed that when these cells were transplanted into mice, proliferation was suppressed as compared with the control group. In addition, when the osteosarcoma cells in which PRRX1 was knocked down were examined by wound healing assay and migration assay, the number of invading cells was reduced compared to the control group. Furthermore, osteosarcoma cells in which PRRX1 was knocked down were transplanted under the skin of mice, and 6 weeks later, the lungs of the mice were taken out and the number and size of lung metastases were compared with those of the control group. Then, it was found that the osteosarcoma cell group in which PRRX1 was knocked down had a smaller number of lung metastases.