Research Projects -
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Ex Vivo Gene Delivery Using an Adenovirus Vector in Treatment for Dental Implant
Grant number：12470419 2000 - 2001
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
KANYAMA Manabu, NAKANISHI Tohru, TAKIGAWA Masaharu, KUBOKI Takuo, ARAKAWA Hikaru
Grant amount：\8200000 （ Direct expense: \8200000 ）
The purpose of this study was to contribute to shortening the healing period of the dental implant and expanding its application by ex vivo gene delivery using an adenovirus vector. It has been well-documented that connective tissue growth factor (CTGF) is up-regulated in the healing process at the bone fracture site in vivo and known as a potent stimulator for the proliferation and differentiation of osteoblasts in vitro. Therefore, CTGF gene transfer to the osteoblasts could be a promising strategy to accelerate bone formation. First, we investigated the possibility of recombinant adenovirus to transfer CTGF genes to a mouse osteoblastic (MC3T3-E1) cell line in vitro. Recombinant adenovirus encoding the LacZ gene and the human CTGF gene with CAG promotor (Ax1CACTGF) were applied to the MC3T3-E1 cells with 5, 10 and 50 multiplicity of infection (MOI). As the result, the MOI 50 transfection dosage produced almost 80% X-gal staining of the cells without any obvious cell damages and Ax1CACTGF transfection caused a marked up-regulation in CTGF mRNA expression and CTGF protein even 7 days after transfection. Second, we investigated the spatial and temporal expression of CTGF in the rat tooth extraction sockets to know the mechanisms of new alveolar bone formation. As the result, CTGF was expressed in the endothelial cells migrating into the granulation tissue at the sockets during 4 days after tooth extraction. Osteoblast-like cells proliferated in the sockets with CTGF expression at 4, 7, 10 and 14 days after extraction. Finally, we tried the ex vivo gene delivery, but we could not isolate osteoblasts from the defects of rat alveolar bone.
Based on these findings, adenovirus-mediated CTGF gene transduction to the cultured osteoblast-like cells was highly successful. However, in order to do the ex vivo gene transfer, it is necessary to develop the new methods of isolating osteoblasts. -
アデノウイルスベクター法を用いた早期osseointegrationの獲得
Grant number：11877338 1999 - 2001
日本学術振興会 科学研究費助成事業 萌芽的研究 萌芽的研究
李 起学, 滝川 正春, 中西 徹, 窪木 拓男
Grant amount：\2200000 （ Direct expense: \2200000 ）
休止期や分裂増殖の遅い細胞へも高い効率で遺伝子導入が可能であり,in vivo遺伝子導入が容易な,アデノウイルスベクター法を用い,アデノウイルスベクターに骨形成能が高いCTGF, TGF-βの遺伝子を組み込む方法を用い,続いて,ラット脛骨にアデノウイルスベクターを投与し,周囲組織(骨芽細胞,間葉系細胞)に感染,遺伝子導入させることで,持続的にそれらの遺伝子を発現させ,早期osseointegrationの獲得を試みることを目的とした実験を行ってきた。
前年度において,アテロコラーゲンとウイルスベクターの複合化と,複合化したウイルスベクターのin vivo LacZ遺伝子導入を行った。しかし導入効率が低く他のキャリアを用いた実験系が必要であると考えられた。そこで本年度はポリ乳酸や他の高分子生体材料をキャリアとして用いウイルスベクターと複合化を行いin vivo実験を行った。
1.ポリ乳酸とウイルスベクターの複合化
ポリ乳酸とウイルスベクター液を混ぜ凍結乾燥を行い,複合化させることに成功した。
2.複合化したウイルスベクターのin vivo LacZ遺伝子導入
ラット脛骨内に1で作製したLacZ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを注入し,経時的にラットを屠殺し,脛骨におけるLacZ遺伝子発現をX-gal染色にて観察したところ,ポリ乳酸を用いても導入効率の上昇にはつながらなかった。
3.ウイルスベクターの他臓器への感染の有無
2のラット屠殺時,固定直前に気管,肝臓,膵臓,腎臓,骨格筋を摘出し,total RNAを抽出し,LacZに対するprimerを用い,RT-PCRを行ったところ,他臓器にLacZ遺伝子の発現は認められなかったことから,ウイルスベクターの他臓器への影響がないことが確認できた。 -
The cloning and application of growth factors in restorative dentine
Grant number：10470417 1998 - 1999
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
KANYAMA Manabu, SUZUKI Kouji, KUBOKI Takuo, TAKIGAWA Masaharu
Grant amount：\11500000 （ Direct expense: \11500000 ）
This study first sought to find unknown genes that expressed specifically to be made the restorative dentine by odontblast. Next, to confirm that foreign genes can be transferred to dental pulp of rats and to clarify the in vivo transfer availability of the adenovirus vectors.
When tooth was prepared the cavity by diamond points, we detected the specific 14 clones from dental pulp by subtractive hybridization.
Recombinant adenovirus harboring LacZ gene was injected into the prepared tooth cavity of 6-week-old Wistar rats. At 1week after injection, the tooth was dissected and X-gal staining examined the expression of delivered LacZ. To investigate the expression of transferred gene in other organs, total RNA was extracted from liver, kidney, heart, and brain and expression of LacZ mRNA were analysed by RT-PCR. Expression of LacZ was observed a few odontblasts in the cavity. In the other organs, expression of the delivered transgene was not observed. Based on these findings, direct gene delivery into the tooth cavity using adenovirus vector is feasible as an effective in vivo method. -
Effect of mechanical stress on chondrocytes metabolism
Grant number：10470415 1998 - 1999
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
KUBOKI Takuo, HATTORI Takako, TAKIGAWA Masaharu
Grant amount：\11300000 （ Direct expense: \11300000 ）
To clarify the mechanism of cartilage degradation induced by mechanical stress, we investigated the influence of cyclic tension force (CTF) on the metabolism of cultured chondrocytes, The chondrocytes were exposed to CTF by using Flexercell strain unit. Five or 15 kPa of high frequency CTF significantly inhibited the syntheses of DNA, proteoglycan, collagen and protein. Fifteen kPa of high frequency CTF induced the expression of interleukin-1 (IL-1), matrix metalloproteinase (MMP)-2 and -9 mRNA, and increased the production of pro-and active-Mmp-9. the degradation of proteoglycan was inhibited by MMP Inhibitor, indicating that MMPs are involved in the degradation of proteoglycan induced by high frequency CTF.
Moreover reducing the frequency of CTF from high to low decreased the inhibition of proteoglycan synthesis. These findings suggest that the CTF frequency is one of the key determinants of the chondrocyte metabolism. Low magnitude CTF, whether high or low frequency, did not cause the gene expression of cartilage degradation factors, suggesting that this magnitude of CTF causes only minor change of cartilage matrix. High magnitude and frequency CTF caused the gene expression of IL-1 and MMP-9, followed by increases in the production of MMP-2 and -8 protein suggest that excessive and continuous cyclic mechanical stress induces the production of IL-1 and MMP-9, resulting in cartilage degradation. -
主要組織適合性抗原からみた顎関節症の免疫遺伝学的要因の研究
Grant number：09877376 1997 - 1998
日本学術振興会 科学研究費助成事業 萌芽的研究 萌芽的研究
山下 敦, 窪木 拓男
Grant amount：\1500000 （ Direct expense: \1500000 ）
顎関節症の発症における遺伝的素因は,顎関節内障患者の家族歴からこの可能性が推測されているのみ(TaUentsら,1996)で,全く推測の域を出ていない.本申請は,当講座で行った双生児研究に引き統き,顎関節症に関連する遺伝的素因をヒトMHCすなわちHLAのタイプから免疫遺伝学的に解明しようとするものである。
現在まで、1)変形性顎関節症群16名:重度の顎関節の変形を伴うもの、2)顎関節リウマチ群5名:慢性関節リウマチが顎関節にも波及したものの2群に分けて継続して末梢血採取を行っている。サシブル数が少ないこともあり、はっきりした傾向は明言できないが、顎関節リウマチ群は、従来遺伝的なリスクが高いと報告された遺伝形質を持っていたが、変形性顎関節症の場合にはその傾向は曖昧であった。 -
顎関節潤滑因子産生機序に関する研究
Grant number：09671988 1997 - 1998
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
篠田 一樹, 辻 清薫, 窪木 拓男
Grant amount：\2600000 （ Direct expense: \2600000 ）
1.関節円板前方転位患者と変形性顎関節症患者,正常者の顎関節滑液の採取ならびに滑液中のヒアルロン酸濃度の測定
顎関節潤滑因子であるヒアルロン酸,リウブリシンの濃度の低下が滑液中において生じると,関節潤滑が円滑に行われなくなることにより関節円板転位を引き起こし,また,関節軟骨への栄養供給が低下することによって軟骨の破壊が進行し,結果として変形性関節症を引き起こすことが考えられている(Kamelchuk et al,1995)。本研究では,まず,関節円板前方転位患者と変形性顎関節症患者の患側顎関節から治療目的として希釈回収法にて滑液を採取した。また,ボランティアの正常者の顎関節から同様に希釈回収法にて滑液を採取した。そして,タンパク量測定キットならびに吸光度測定機器を用いて総タンパク濃度を測定したところ関節円板前方転位患者と変形性顎関節症患者のタンパク濃度が正常者のそれと比較して有意に高いことが明かとなった。続いて,各サンプルをSDS-PAGEにて電気泳動し,それぞれのタンパクの構成に違いがあるかを一次元電気泳動解析装置にて検討したところ,SDS-PAGEレベルでは特に各群で有意差は認められなかった。現在,市販されている抗ヒトヒアルロン酸抗体を用いたwestern blottingにて各群のヒアルロン酸のバンドの強度を測定し,各群に有意差があるか検討中である。 -
Chronic skeletal muscle pain and regeonal hemodynamic abnormality
Grant number：08457528 1996 - 1997
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
YAMASHITA Atsushi, AZUMA Yoshiharu, KUBOKI Takuo
Grant amount：\5800000 （ Direct expense: \5800000 ）
1) Effect of cold pressor test (CPT) on resting masseter muscle hemodynamics.
Since CPT was reported to evoke an increase of muscle sympathetic nerve activity in the human skeletal muscle (Victor et al.1987), CPT-induced hemodymanic change in the resting human masseter muscle was measured by using a near infrared spectroscopy device. Results : CPT induced strong increase in intramuscular blood volume and oxygen saturation levels. Moreover, after cessation of 4 degree C CPT task clear rebound Hb decrease was demonstrated. Therefore it can be speculated that increase in muscle sympathetic nerve activity induces hyperemia in normal subjects.
2) Effect of alpha and beta adrenergic blocking agents on intramuscular hemodynamic changes.
This study evaluated that the effect of intravenous infusion of non-selective alpha- and beta-adrenergic blocking agents on masseter muscle hemodynamics. Results : Intramuscular blood volume and oxygen saturation levels significantly increased by intravenous infusion of alpha blocking agent and trended to decrease by beta blocking agent.
3) Comparison of hemodynamic response to CPT between healthy subjects and chronic trapezius muscle pain subjects.
This study determined the difference in blood volume of the upper trapezius muscle area between normal and chronic shouder muscle pain subjects during CPT.Results : In both group of subjects the mean blood volume increased above the baseline livel during CPT,however, pain subjects exibited significantly lower mean blood volume during CPT.These results suggest that intramuscular hemodynamic abnormality might be related to the chronic muscle pain pathophysiology. -
Osteoarthritis of the TMJ and Mechanical Stress
Grant number：07672110 1995 - 1996
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
KUBOKI Takuo, YAMASHITA Atsushi
Grant amount：\2300000 （ Direct expense: \2300000 ）
Excessive mechanical stress has been proposed as a cause breakdown of the articular cartilage. To investigate the effect of mechanical stress on chondrocyte metabolism, we examined the extracellular matrix synthesis and the gene expression of cartilage degradation factors and growth factors.
1.15 kPa cyclic mechanical stress (CTF) caused less increase in proteoglycan (PG) synthesis than 5 kPa (230.3 and 179.1% increase at 5 and 15 kPa)
2.5 kPa of CTF caused more decrease in DNA synthesis (50.0 and 30.1% decrease, at 5 and 15 kPa).
3.The mean normalized IL-1beta mRNA level against the corresponding control transiently increased during both level of CTF.
4.The mean normalized bFGF mRNA level against the corresponding control transiently increased during 15 kPa of CTF,while remarkable change was not observed at 5 kPa of CTF.
5.The mean normalized MMP-9 mRNA level against the corresponding control progressively increased during 15 kPa of CTF,while the transient increase was observed during 5 kPa of CTF.
6.Mean normalized MMP-2, TIMP-1, agrecan, collagen type II and type X mRNA level against the control did not show remarkable change at the both level of CTF.
7.When 15 kPa of CTF was applied, the production level of pro-MMP-9 did not change, but the level of active form MMP-9 was slightly increased, while 5 kPa of CTF was applied, the production level of pro-MMP-9 did not show remarkable change and it was not activated to active form MMP-9. Both level of CTF did not change the production of MMP-2. -
片側噛みしめ時におけるヒト顎関節関節円板動態
Grant number：05771684 1993
日本学術振興会 科学研究費助成事業 奨励研究(A) 奨励研究(A)
窪木 拓男
Grant amount：\900000 （ Direct expense: \900000 ）
顎関節内障の発症には顎関節負荷の異常が密接に関連していると推測される。申請者は1986年より行ってきた顎関節部負荷のモデル解析に始まり、これまで顎関節部負荷が顎関節構造に与える影響について研究を行ってきた。その結果、持続片側噛みしめにより顎関節断層エックス線写真上において非噛みしめ側下顎頭の著しい後上方変位と前関節空隙の縮小が誘発されることを見出した。
しかし、関節硬組織のみを描出対象とするエックス線写真法では関節円板動態や筋活動状態を把握することはできない。したがって、本研究では関節円板の描出が可能なMRI法を用い、実験的前歯部噛みしめによる下顎頭-関節円板関係の変化を直接明らかとした。
本研究の結果、実験的前歯部噛みしめにより、T1強調MR画像上でも前関節空隙の縮小が生じ、滑液の層を描出していると思われる高信号域が移動、縮小することが明らかとなった。また、この層の移動を定量的に評価することを目的に、下顎頭-関節結節を結んだ直線上の信号強度の変化をプロファイル像として比較する方法を開発した。関節空隙の縮小は、関節負荷受圧複合体(関節結節上の関節軟骨、上関節腔の滑液、関節円板、下関節腔の滑液、下顎頭上の関節軟骨)の移動ならびに圧縮変形に起因することが明らかとなった。 -
成人顎関節の骨改造能に関する研究
Grant number：04671183 1992
日本学術振興会 科学研究費助成事業 一般研究(C) 一般研究(C)
矢谷 博文, 窪木 拓男
Grant amount：\1900000 （ Direct expense: \1900000 ）
ヒト顎関節に生じる形態学的変化(リモデリング)については、下顎頭骨折や顎外科矯正処置後にみられたとする症例が数例報告されているだけで、ほとんど明らかにされていないといってよい。また、この形態学的変化は新しい下顎頭位に対する適応変化の一つの表われであると解釈されているが、その証拠はない。
そこで、関節円板が前方偏位した94名の顎関節内障患者の188顎関節(このうち61関節は復位性、58関節は非復位性関節円板前方転位と診断された)に、保存療法後にどのような形態的変化が現われるかを放射線学的に検討し、次のような結果を得た。
1.形態的変化のほとんどは下顎頭に生じ、側頭骨(下顎窩、関節結節)にはほとんど変化が生じなかった。すなわち、39の下顎頭に進行性リモデリング、15の下顎頭に退行性リモデリングが生じたのに対して、3関節結節に退行性変化が生じたのみであった。
2.進行性変化としては、下顎頭の二重輪郭像の出現および下顎頭全体が丸みを帯びるという変化が観察された。これに対して、退行性変化としては、下顎頭前関節面あるいは後関節面の扁平化、下顎頭の短縮化、あるいは関節結節の扁平化が観察された。
3.顎関節の形態学的変化を起こす頻度と患者の年齢には関連があり、高齢になるにつれて、進行性リモデリングの頻度は減少し、退行性リモデリングの頻度は増加した。
4.正常顎関節にはほとんど形態的変化が生じなかったのに対し、復位性関節円板前方転位では36%、非復位性関節円板前方転位では41%に形態変化が生じた。復位性関節円板前方転位ではそのほとんどが進行性リモデリングであった(34%)のに対し、非復位性関節円板前方転位は進行性変化と退行性変化の頻度がそれぞれ23%と18%であった。
5.円板の復位が得られた関節と得られなかった関節では、前者のほうが形態的変化を起こす頻度が高く、そのほとんどは進行性リモデリングであった。すなわち、円板復位に得られた関節全体の42%に進行性、3%に退行性リモデリングが生じたのに対し、復位の得られなかった関節全体の13%に進行性、17%に退行性リモデリングが生じた。
6.保存治療により下顎頭位が後方あるいは上方に変位した関節では形態的変化がまったくみられず、前方あるいは下方に変化した関節では47%、下顎頭位が変らなかった関節では33%に形態変化が観察された。前方あるいは下方に変位した場合のほとんどは進行性リモデリングであった(41%)のに対し、下顎頭位が変らなかった関節では、19%が進行性、14%が退行性変化であった。
以上より、ヒト顎関節は成人であっても本質的にリモデリング能を有しており、進行性および退行性リモデリングは保存治療により変えられた異なる関節内環境に対する異なる適応変化であると考えられた。また、形態変化を生じた患者の予後は良好であることから、これらの形態変化は関節内環境が正常化されたことの一つの指標となり得ることが示唆された。 -
顎関節円板,顎関節軟骨の耐圧縮特性に関する生物力学的ならびに組織学的研究
Grant number：03771429 1991
日本学術振興会 科学研究費助成事業 奨励研究(A) 奨励研究(A)
窪木 拓男
Grant amount：\900000 （ Direct expense: \900000 ）