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酸化的DNA障害を認識する高等真核生物由来の修復酵素
Grant number：10151233 1998
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究(A)
井出 博, 寺東 宏明
Grant amount：\2000000 （ Direct expense: \2000000 ）
本研究では,酸化的損傷に対する塩基除去修復酵素hOGG1ならびにmNthl1の生化学的な酵素特性解析を行い,原核生物のホモログとの機能的な相違を検討した.
1. 8-oxoGおよびme-Fapyを含むオリゴヌクレオチドを基質として,hOGG1およびFpgの両基質に対する活性と酵素パラメーターを調べた.8-oxoG,me-Fapyはともに両酵素の基質となることが示されたが,切断生成物は,hOGG1ではβ-脱離生成物であるのに対し,Fpgではβ,δ-脱離生成物であった.hOGG1の8-oxoGおよびme-Fapyに対するkcat,Kmは数倍程度異なったが,反応効率(kcat/Km)は同程度であった.Fpgでも同様な検討を行ったところ,hOGG1に比べ高いkcatが得られたが,基質特異性に関してはhOGG1と同様な結果が得られた.NaBH_4存在下,8-oxoGあるいはme-Fapyを含む基質とhOGG1,Fpgをインキュベートし,生成物をSDS-PAGEで分析した.その結果,両酵素で基質-酵素間のクロスリンク複合体の存在が確認された.これは,反応中間体として,酵素-基質間でSchiff baseが形成されることを示している.
2. 様々な損傷を含むオリゴヌクレオチド基質を用いてmNthl1と大腸菌ホモローグ(EndoIII)の基質認識の差を検討した.TGの立体異性体(5S,6R体と5R,6S体)に対する活性は,両酵素の間で有為な差は認められなかった.また,EndoIIIではTGとURに対する活性は同程度であったが,DHTに対する活性は著しく低く,TGの約1/15であった.mNthl1でもTGとURに対する活性は同程度であったが,DHTでは低かった.しかし,DHTに対する活性はEndoIIIの場合ほどの大きな差はなく,TGの1/2程度であった. -
Development of novel probe molecules for specific detection of abasic sites in DNA
Grant number：09558070 1997 - 1999
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
IDE Hiroshi, KUBO Kihei, TERATO Hiroaki, OHYAMA Yoshihiko, SASAMOTO Kazumi
Grant amount：\8100000 （ Direct expense: \8100000 ）
Abasic sites are the most ubiquitous damage found in cellular DNA. Therefore, it is essential to develop a method to detect abasic sites to study cytotoxic and genotoxic effects of DNA damage as well as DNA repair.
In this study, a probe molecule (ARP) specifically reacting with the aldehyde group of abasic sites was synthesized for highly sensitive and convenient detection of abasic sites formed in DNA.
For immobilization of DNA, a protamine sulfate-coated plate was used instead of the conventional UV-irradiated plate to enhance DNA binding. As the result, the time for immobilization was shortened to 1h without any loss of signals. The amount of tritium-labeled DNA bound to the plate was proportional to the DNA concentration employed. When DNA containing AP sites was treated with ARP in solution prior to coating the protamine-plate, the sensitivity of the assay was greatly increased.
HeLa RC355 cells were treated by a very low concentration of an alkylating agent (MMS) that does not affect cell survival. The assay of chromosomal DNA extracted from the cell with ARP revealed that as low as five abasic sites per 10ィイD16ィエD1 nucleotides could be detected, demonstrating a high sensitivity of the ARP method. Furthermore, the ARP assay proved to be very useful for detection of abasic sites resulting from excision of damaged base by DNA N-glycosylases in vitro and in vivo.
In collaboration with Dojindo Co. Ltd., ARP is now commercially available as a reagent or a part of the DNA damage assay kit containing ARP, standard abasic DNA, and plates for immobilization of sample DNA. -
酸化的DNA障害を認識する高等真核生物由来の修復酵素
Grant number：09253238 1997
日本学術振興会 科学研究費助成事業 重点領域研究
井出 博, 寺東 宏明
Grant amount：\2300000 （ Direct expense: \2300000 ）
本研究では、オリゴヌクレオチドに対する酸化損傷の導入法の開発を行うとともに、これを基質として高等動物由来DNA修復酵素の酵素特性の解析を行った。
1 酵素基質合成
thymine glycol(TG)は、チミンを1ケ所だけ含むオリゴヌクレオチドを過マンガン酸カリウムで酸化することにより導入した。目的とする生成物(19TG)は、逆相HPLC及びゲル濾過により精製した。次に、19TGのアルカリ処理により、ureaを含むオリゴヌクレオチド(19UREA)を調製した。
2 酵素特性の解析
methylpurine DNA glycosylase(hMPG)は、ヒト細胞における主要なアルキル化塩基修復酵素であり、基質特異性も大腸菌のAlkAと多くの部分でオーバーラップしている。hMPGを大腸菌で発現しタンパク質を精製後、アルキル化及び酸化損傷塩基を含むオリゴヌクレオチド基質を用いて基質特異性を検討した。hMPGは、7-methylguanine,ethenoadenine,hypoxanthineを認識したが、同様な条件下で酸化損傷5-formyluracil及び8-oxoguanineは認識しなかった。
最近クローニングされたマウスのendonucleaseIIIホモログ(mNth1)の酵素特性の解析を行った。[^3H]TGを導入したM13DNAとmNth1をインキュベートすると、放射活性がDNAからリリースされ、HPLC分析により遊離のTGであることを確認した。19TG及び19UREAを基質としてmNth1を作用させると、TGおよびureaの3'側でβ脱離した生成物が確認された。以上の結果は、mNth1がendonucleaseIIIと同様に酸化的なピリミジン塩基損傷の修復に関わる酵素であり、同一タンパク質内にN-グリコシラーゼとAPリアーゼ活性をもつことを示している。 -
放射線抵抗性細菌における放射線抵抗性の誘導機構の解明
Grant number：06780440 1994
日本学術振興会 科学研究費助成事業 奨励研究(A)
寺東 宏明
Grant amount：\900000 （ Direct expense: \900000 ）
本研究の目的は放射線抵抗性細菌における放射線抵抗性の誘導機構の解明である.あるイベントに対し,ある活性が誘導されるためには,その活性を担う蛋白質が誘導されてこなければならない.この誘導は大きく二つに分けられ,一つは活性を担う蛋白質の新規合成であり,もう一つは蛋白質が不活性な状態から活性のある状態への移行という二つの方式が考えられる.本研究では蛋白質の新規合成,すなわち誘導蛋白質の確認から研究を始めた.
本年度の研究実績をまとめると放射線抵抗性細菌Rubrobacter radiotoleransで放射線によって誘導される蛋白質を二次元電気泳動ゲル上で3つのスポットとして検出することが出来た.
まず本種の可溶性画分の抽出方法を検討した.本種はAchromopeptidaseによって細胞壁を破壊することが必要であるが,試料中へのその混入を避けるため,0.2M sucroseによる高張溶液での処理を確立した.次にradioisotope(RI)を使わずに二次元電気泳動ゲルの銀染色でスポットの変化をみたが確認できなかった.よって^<35>S-methionineの取り込みにより蛋白質の新規合成をみるために,ラベル条件の検討を行った.この結果からRI濃度1.85 MBq/ml.ラベル時間1hで行うこととした.次に照射条件の検討を行った.放射線照射誘導蛋白質においては,低線量と高線量では誘導されてくるものが異なることが考えられるが,本研究においては高線量での照射誘導を目的とした.その結果8kGyでD_<37>である16kGyと同様の,誘導が起こることがわかった.次に泳動条件の検討を行った.一次元目をpH4.5-6の等電点電気泳動,二次元目を7.5%アクリルアミドゲル電気泳動で行うこととした.それによりpI5付近,分子量40kDa付近に,放射線照射時のみに現れる3つのスポットが検出された.これをシークエンス対象物として現在大量調製中である. -
Study on DNA repair enzymes
Grant type：Competitive
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DNA修復酵素に関する研究
Grant type：Competitive
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環境変異原の生物影響に関する研究
Grant type：Competitive
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Study on biological effects of envionmental mutagens
Grant type：Competitive