Research Projects -
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Involvement of DNA damage and mutation in heavy particle, BNCT, and alpha internal radiation therapy
Grant number：22K12372 2022.04 - 2025.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
寺東 宏明
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
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Development of practical water purification system using water cavitation and plasma
Grant number：20K04446 2020.04 - 2023.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
猪原 哲, 寺東 宏明
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
循環型社会と安全安心が担保された社会を世界的な視点で実現するためには，水質浄化を含めた水処理は必須の課題であるものの，高度化・多様化した現在は，既存の水処理技術では限界がある。本研究は，水中プラズマを使った水処理装置の実用化を目指したものである。独自のプラズマ発生方式である「水中キャビテーション放電」を採用し，実用化のために必要な知見を明らかにすることを目的とした。当初の2020年度の実施計画は，プラズマリアクタの設計・試作を行い，プラズマ発生テストおよび殺菌効果の実証することであった。
今年度の初期の研究において、実際の現地の被処理水の導電率（約50mS/m、国内の約5倍）を想定した電極設計とリアクタ設計が必要になることが分かった。これを受けて、イオン交換樹脂カートリッジを水処理装置に組み込み、プラズマ発生を促進する方法を検討したが、必要流量と水圧との関係からさらに検討が必要であることが分かった。高導電率中でも十分なプラズ発生が得られるためには、電極部でのキャビテーション気泡量を増加させる必要がある。３Ｄプリンターを用いて各種条件のリアクタを製作し、電極設置条件に対する気泡発生量の最適条件を実験的に調べた。 -
Development of dormancy breaking technology for temperate fruit tree with pulsed high voltage application
Grant number：17K06305 2017.04 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Ihara Satoshi
Grant amount：\4810000 （ Direct expense: \3700000 、 Indirect expense：\1110000 ）
The rise in temperature due to climate change has an effect on agricultural products, especially on temperate fruit trees. Temperate fruit trees dormant during the growth cycle, but dormancy awakening is significantly affected by temperature rise. If dormancy and awakening are not sufficient, the yield will be reduced due to flowering and poor fruiting. Cyanamide is used as a dormant breaker, but its effect is not sufficient. This study is a basic study for the development of a technique for breaking dormancy of temperate fruit trees. Peach was selected as an experimental sample, and changes in germination rate by applying pulse power and quantitative analysis of plant hormones were performed. As a result, it was found that the abscisic acid concentration was changed by the application of pulse power, and it was clarified that the application of pulse power contributed to the physiological action in dormancy and arousal.
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Fundamental research on high speed water treatment for large volume water using water cavitation and plasma
Grant number：26420238 2014.04 - 2017.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Ihara Satoshi
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
Purpose of this research is to build technology on purification of water with large volume using one-path treatment. Especially water cavitation and discharge plasma were used simultaneously for purification in this research.
Escherichia coli whose initial number density was 2×1015 m-3 was used as a specimen for testing. In our experiments, 5 pair of electrodes was used, and a sterilization ratio of about 83 %, 97 % were obtained at a treatment time of 6, 18 seconds, respectively. A treatment time of 6 seconds corresponds to one-path treatment. From the results, it seems that more than 90 % of sterilization ratio is obtained at 15 pair of electrodes. -
Elucidation of radiation biological effect with quantitative and qualitative analyses of base damage cluster
Grant number：25340034 2013.04 - 2016.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Terato Hiroaki, KONDO Toshihiro, TOKUYAMA Yuka
Grant amount：\4030000 （ Direct expense: \3100000 、 Indirect expense：\930000 ）
Clustered DNA damage is a specific type of DNA damage with ionizing radiation. In this study, we analyzed the yield of clustered base damage in cultured cells irradiated with various heavy ion beams, and investigated the repair process in post-irradiation cultured cells. Chinese hamster ovary (CHO) cells were irradiated by carbon, silicon, argon and iron ion beams with LETs of 13, 55, 90 and 200 keV/μm, respectively. The cell electrophoresis indicated that clustered base damage yields decreased as the LET increased. Then, clustered DNA damage repair was investigated using DNA repair mutant cells. DNA double-strand breaks accumulated in the mutant cells lacking Xrcc1 after irradiation, and the cell viability decreased. On the other hand, mouse embryonic fibroblast (Mef) cells lacking both Nth1 and Ogg1 became more resistant than the wild type. Thus, clustered base damage seems to be involved in the expression of heavy ion beam biological effects via the repair process.
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Analysis of DNA adducts damage as a sensitive probe for the sick building syndrome
Grant number：24655143 2012.04 - 2016.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
Kondo Toshihiro, Terato Hiroaki, Tokuyama Yuka, Ichiba Masayoshi
Grant amount：\2080000 （ Direct expense: \1600000 、 Indirect expense：\480000 ）
The present study examined the methods of analysis of DNA adducts damage in carcinogenesis as a result of formaldehyde is the causative agent of sick house syndrome is induced. It was investigated separation conditions by high-performance liquid chromatography of deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs), which is a standard substance. Find the signal of dNTP- amino acid adduct by HPLC carried out in vitro reaction experiment of dNTP and amino acid with formaldehyde was detected signal peak, but was not confirmed by mass spectrometry. It was confirmed the separation of the four types of standard dNTPs in the high-performance liquid chromatography mass spectrometer (LC / MS).
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Fundamental Research on Control of temperate fruit trees growth using Pulsed High Voltage Application
Grant number：24656191 2012.04 - 2014.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
SATOSHI Ihara, TERATO Hiroaki, YAMANE Hisayo
Grant amount：\3510000 （ Direct expense: \2700000 、 Indirect expense：\810000 ）
In this research the effects of high voltage applications on growth of peach was investigated experimentally. The length of peach branch was 70 mm, the peak value of applied voltage was range from 5 to 30 kV, and pulse width was 500 ns constant. At this condition deposited energy to branch was range from 5 to 10 mJ. Specimens of branch were cultivated on water vessel from July to January of next year. During the cultivation germination ratio was observed. From this experiments germination ratio with high voltage application was decreased rather than without application.
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Elucidation of in vivo repair system for 5-formyluracil termed as FO system
Grant number：22510062 2010 - 2012
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
TERATO Hiroaki, KONDO Toshihiro, TOKUYAMA Yuka
Grant amount：\3120000 （ Direct expense: \2400000 、 Indirect expense：\720000 ）
In this study, we focused on elucidation of repair system for 5-formyluracil (5-foU) as a major thymine oxidative lesion. We here assumed the FO system as an integration of multiple repair pathways for 5-foU including the base excision repair, the mismatch repair, and the nucleotide pool sanitization. The result of this study leads the elucidation of 5-foU repair system and also achieves novel technical advance of analytical chemistry for DNA damage.
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ATP依存性プロテアーゼ系と共役したDNAータンパク質クロスリンク修復機構
Grant number：18310039 2006 - 2008
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
井出 博, 田内 広, 寺東 宏明
Grant amount：\18330000 （ Direct expense: \15600000 、 Indirect expense：\2730000 ）
DNA-タンパク質クロスロスリンク(DPC)は,タンパク質がDNAに共有結合して生じるゲノム損傷であるが,その修復機構は解明されていない。これまでの大腸菌を用いた研究で,DPC修復にはヌクレオチド除去修復(NER)と相同組換え(HR)が関与していることが明らかとなった。さらに,NERで働くUvrABCヌクレアーゼが除去できるクロスリンクタンパクのサイズには上限があり,これ以上のサイズのタンパクを含むDPCは,HRで回避されることが示された。本年度は,DPCに対するHR機構の詳細を検討した。
大腸菌のHRは,RecBCD依存的経路あるいはRecFOR依存的経路で進行する。DPCのHRに対する両経路の関与を明らかにするため,recBおよびrecF欠損株のDPC誘発剤感受性を調べた。recBは高感受性を示したが,recFはまったく感受性を示さなかった。RecFOR経路で働くrecJ,recQの欠損株も感受性は示さなかった。
したがって,DPCのHRはRecBCD依存的経路のみで進行し,これはゲノム損傷のHRにおいてDPCに特徴的な応答であることが示された。HRのpostsynaptic stageで働く因子を調べた結果,ruvAB,ruvC,recG欠損株がDPC誘発剤に高感受性を示した。RuvABおよびRuvCは,Holliday構造の移動と解消に関わっていると考えられるが,RecGの役割についてはさらに検討が必要である。HR後の複製再開に関わる因子を明らかにするため,priA,priB,priC,rep欠損株の感受性を調べた。priA欠損株は高感受性を示したが,priBおよびpriC欠損株は弱い感受性で,rep欠損株は感受性を示さなかった。したがって,複製再開はPriA-PriBあるいはPriA-Pric経路で進行し,両経路は相補的に働いていると考えた。 -
クラスター損傷の直接検出に基づく新規定量法の開発
Grant number：17651029 2005 - 2006
日本学術振興会 科学研究費助成事業 萌芽研究
井出 博, 寺東 宏明, 古澤 佳也
Grant amount：\3400000 （ Direct expense: \3400000 ）
前年度は,モデルオリゴヌクレオチド基質を用いてクラスター損傷の解析法を検討した。本年度は,細胞内におけるクラスター損傷の生成量を解析し,損傷生成量とLETの関係およびDNA修復の影響を検討した。
照射にはAA8細胞(修復野生型)と塩基除去修復経路の最終段階で働くXRCC1を欠損したEM9細胞を用い,γ線(0.2keV/mm),Cイオン(13keV/mm),Feイオン(200keV/mm)で照射した。照射した細胞の一部は,コロニー形成により生存率を調べ,残りはクラスター損傷(DNA二重鎖切断)を評価するため,アガロースプラグに包埋しスタティックフィールドゲル電気泳動により分析した。AA8細胞の生存率は,いずれの放射線でも照射線量の増加とともに対数的に減少したが,同一線量ではLET上昇とともに低下した。また,EM9細胞(XRCC1-)とAA8C細胞(野生株)のCイオンに対する生存率を比較し,EM9細胞の感受性が高いことを見出した。DNA二重鎖切断発生量は,プラグからリリースされたDNAバンドの強度を指標とした。二重鎖切断発生量はLET増加とともに減少し,細胞生存率のLET依存性とは逆の関係を示すことが分かった。in vitroにおけるDNA照射でもクラスター損傷生成効率とLETの問には逆相関認められた。以上のin vivoおよびin vitroの結果は,放射線によるクラスター損傷の生成量と生物効果の重篤度が単純な相関関係にはないことを示す。さらに,放射線の生物効果の重篤度には,クラスター損傷の構造と細胞内プロセシングが関わっている可能性を示唆する。今後,細胞レベルでより詳細なクラスター損傷の解析を行い,クラスター損傷の実態と生物効果の関連を明らかにしていく。 -
Identification and characterization of base excision repair enzymes involved in the repair of oxidative DNA damage
Grant number：15310038 2003 - 2005
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
IDE Hiroshi, TERATO Hiroaki, KUBO Kihei
Grant amount：\15300000 （ Direct expense: \15300000 ）
In this study, we have performed identification and characterization of mammalian DNA glycosylases to elucidate the repair mechanism of oxidative DNA damage in mammalian cells. The findings of this research are summarized as follows.
(1) DNA damage recognition proteins were isolated from HeLa cell extracts by mechanism-based trapping assays using oxanine-containing oligonucleotides as probes. About 14 proteins (28-69 kDa) were identified as trapped products in SDS-PAGE analysis. Mass fingerprinting analysis of trapped products indicates, together with histone, several proteins that might be involved in DNA repair. Detailed analysis of their function is ongoing.
(2) DNA glycosylase activity for 5-formyluracil (fU) was isolated from rat liver and identified as SMUG1. Human SMUG1 recognized uracil and its derivatives bearing an oxidized group at the ring C5 position, i.e., fU, 5-hydroxymethyluracil, and 5-hydroxyuracil. SMUG1 accounted for dominant activities for these lesions in HeLa cells. Thus, SMUG1 is a new member of DNA glycosylases involved in the repair of oxidative damage.
(3) The damage specificities of human glycosylases (hNTH1, hNEIL1, and hNEIL2) have been characterized and compared to those of E.coli counterparts. Despite being homologues, human and E.coli homologues (Endo III vs.hNTH1, Endo VIII vs.hNEIL1) exhibit significantly different damage preferences, particularly, for thymine glycol stereoisomers and formamidopymidine, hNEIL2 exhibits only very weak N-glycosylase activity.
(4) Analysis of repair activity of E.coli Endo IV and yeast APN1 suggests that they initiate nucleotide incision repair (NIR) for free radical-induced DNA lesions. NIR may constitute an alternative or backup repair pathway for the base excision repair (BER) pathway in cells. -
Mutagenesis and repair mechanism of DNA base lesions induced by nitrogen oxides
Grant number：15510054 2003 - 2004
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
TERATO Hiroaki
Grant amount：\3200000 （ Direct expense: \3200000 ）
(1)Mutagenesis of deamination products derived from guanine induced by nitrogen oxide
I investigated activities of Escherichia coli DNA polymerase I Klenow fragmen (Pol I Kf)for xanthin (Xan), oxanin (Oxa) and its crosslink-product(Oxa-Sp with spermine for their mutagenesis abilities. The relative activities of translesional elongation of Pol I Kf were for G(1)>Oxa (0.19)>Xan (0.12)>AP site (0.088)>Oxa-Sp(0.035). For insertion abilities of Pol I Kf, Xan in template preferred TM (16% and dGM (14% than other nucleotides, and Oxa in template preferred TMP(49%)than other nucleotides. On the other hand, Oxa-Sp highly inhibited DNA polymerization of the enzyme. These results indicate that their lesions show severe mutagenic properties with respective manner.
(2)Repair activities for Oxa and its crosslink-lesion
I investigated repair activities for Oxa and its crosslink-lesion using purified enzymes and defined oligonucleotide substrates containing these lesions. Firstly, I investigated any DNA glycosylases for these lesions. However, all enzymes I tried showed poor activities to remove these lesions from DNA. The result indicates that base excision repair(BER)is not effective to these lesions. Then, I tied UvrABC complex derived from Bacillus cardotenax for these lesions. The enzyme of nucleotide excision repair(NER)showed nicking activity for DNA substrate containing Oxa-Sp. The nuclear extracts of HeLa cells also showed simlar NER activity for the substrate. These results indicate that Oxa easily converts secondary crosslink lesions such as Oxa-Sp in vivo, and the crosslink lesions can be removed by NER process. -
生物の遺伝情報維持機構に関する研究
2003
Grant type：Competitive
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Molecular mechanism of genetic integrity in biological systems
2003
Grant type：Competitive
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NOにより形成されるDNA-タンパク質クロスリンクの遺伝的影響と修復
Grant number：14026033 2002
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究
井出 博, 寺東 宏明
Grant amount：\4300000 （ Direct expense: \4300000 ）
細菌やウィルスの感染に伴う炎症は発癌リスク因子であることから,炎症と発癌の関係を過剰産生されたNOとの関連から検討する必要がある。NOとグアニンの反応で生じるオキザニンは,生体ポリアミンやDNA結合タンパクとクロスリンクを形成する。
本研究では,細胞内におけるオキザニンのクロスリンク標的分子を探索するとともに,クロスリンク生成物のDNA複製に対する影響と修復機構を検討した。その結果,HeLa細胞内の主要クロスリンク標的分子として,41kDaおよび69kDaのタンパクの存在が確認された。前者の候補としては8-oxoguanine-DNA glycosylase (hOGG1)が考えられたが,hOGG1抗体を用いたクロスリンク阻害実験から,同タンパクはhOGG1ではないことが明らかとなった。DNA複製については,オキザニン-スペルミンクロスリンク生成物の影響を調べた。同クロスリンク損傷は強いDNA複製阻害効果を示したが,損傷乗り越え合成(translesion synthesis)も起こることが明らかとなった。オキザニン-スペルミンクロスリンク生成物では,塩基対形成に必要な水素結合部位が修飾を受けていることから,損傷乗り越え合成では,本来取り込まれるべきdCMP以外のヌクレオチドの取込が予想される。クロスリンク生成物の修復については,UvrABC酵素のオキザニン-スペルミンクロスリンク生成物に対する反応を検討した。UvrABCは損傷特異的なDNA切断活性を示したことから,クロスリンク生成物修復に対するヌクレオチド除去修復の関与が明らかとなった。真核生物においても同様な結果が予想されることから,ヒトのヌクレオチド除去修復再構成系を用いて同修復機構の関与を確認するとともに修復効率の定量的な解析を行う必要がある。 -
NOにより形成されるDNA-タンパク質クロスリンクの遺伝的影響と修復
Grant number：13214071 2001
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究(C)
井出 博, 寺東 宏明
Grant amount：\4400000 （ Direct expense: \4400000 ）
異物進入に対するマクロファージの活性化により生体内で発生するNO及びこれに由来する窒素酸化物の遺伝子レベルでの直接的な毒性や発がんへの関与については未知の部分が多い。これまでの研究から,生物学的に意味のある低濃度のNOの暴露では,DNA損傷としてオキザニンが生成することが示された。オキザニンの構造を考慮すると,核内に存在する低分子アミンやDNA結合タンパク質と損傷がクロスリンクし,二次的に形成されたDNA損傷が細胞致死や突然変異を誘発する可能性がある。そこで,オキザニンを特異的に含むDNA基質を用いて生体ポリアミンとの反応を検討した結果,実際にクロスリンク生成物が生じることが明らかとなった。さらに,オキザニンを含むDNAと核内に存在するDNA結合タンパク質の間でクロスリンクが形成されるか検討した。その結果,オキザニンは,ヒストン,HMGタンパク質,プリン塩基損傷修復酵素(hOGG1等)とクロスリンクを形成すること,さらに,クロスリンク形成速度は,ヒストン・HMGタンパク質に比べDNA修復酵素の方が圧倒的に速いことが明らかとなった。DNA修復酵素で反応が起こったことは,オキザニンがDNA-タンパク質クロスリンクの前駆体としてだけでなく,修復酵素の自殺基質としても重要であることを示している。HeLa細胞の核抽出物を用いた実験でも,抽出物中にオキザニンとクロスリンクする複数のタンパク質が存在することが示された。クロスリンク反応に関与するタンパク質中のアミノ酸を推定するために,個々のアミノ酸の反応性を検討した結果,アルギニン及びリジン側鎖が反応に関与することが示された。クロスリンク修復に対するヌクレオチド除去修復機構の関与を調べるために,DNA-タンパク質クロスリンクを含む長鎖DNA基質を調製した。
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Development of a novel method for gene-specific DNA damage detection
Grant number：12558060 2000 - 2002
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
IDE Hiroshi, KUBO Kihei, TERATO Hiroaki, OHYAMA Yoshihiko, SASAMOTO Kazumi
Grant amount：\13500000 （ Direct expense: \13500000 ）
The generation and repair of DNA damage are not uniform over the genome, but are affected by the dynamic state of nuclei such as transcription and replication. In this study, we have developed basic methods to monitor DNA damage generated in individual genes of chromosomal DNA by combining the aldehyde reactive probe (ARP) method, damage-specific DNA glycosylase, and conventional DNA arrays. For highly sensitive detection of ARP-labeled DNA, the chemiluminescence detection reagents were used as peroxidase substrates in place of conventional chromogenic substrates. The detection limit of the ARP assay was 1-2 abasic sites per 10^6 nucleotides when chemiluminescence detection was employed. For detection of base lesions by the ARP method, they need to be quantitatively converted to abasic sites or 3'-nicked abasic sites by DNA glycosylases. For this purpose, DNA was oxidized by the Fenton reaction and treated with varying amounts of Endo III or hOGG1 that remove oxidized pyrimidine and purine lesions, respectively, from DNA. The resulting 3'-nicked abasic sites were quantitated by the ARP assay. On the basis of the data, the amount of Endo III or hOGG 1 required for quantitative conversion was determined. The stability of ARP-labeled DNA during probe hybridization was also examined under various conditions. Finally c-myc DNA containing abasic sites were labeled with ARP and hybridized to model DNA arrays on a membrane under optimized conditions. The membrane was washed, incubated with avidin-biotin-horseradish peroxidase complexes, then with the chemiluminescence detection reagents. A strong chemiluminescence signal was observed for the c-myc gene but not for other genes in the arrays. Thus, these data combined together show that DNA damage in individual genes of chromosomal DNA can be detected by combining the aldehyde reactive probe (ARP) method, damage-specific DNA glycosylase, and conventional DNA arrays.
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NOにより形成されるDNA-タンパク質クロスリンクの遺伝的影響と修復
Grant number：12213091 2000
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究(C)
井出 博, 寺東 宏明, 大山 義彦
Grant amount：\3100000 （ Direct expense: \3100000 ）
NOおよびこれに由来する窒素酸化物の遺伝子レベルでの毒性や発がんへの関与については未知の部分が多い.生物学的に意味のある低濃度のNOの暴露では,オキザニンとシトシンジアゾエートが主にDNA損傷として生成することを明らかにされている.両損傷の構造と反応性を考慮すると,DNAの近傍に存在する低分子アミン類やDNA結合タンパク質と損傷がクロスリンクし,二次的に形成されたDNA損傷が細胞致死や突然変異を誘発する可能性が高い.本研究では,NOおよび窒素酸化物により生成するDNA損傷とアミン類・DNA結合タンパク質の間でクロスリンクが形成されるか検討した.
アミノ酸との反応ではデオキシオキザノシンの7位,デオキシシチジンジアゾエートの4位にアミノ酸のαアミノ基が付加した生成物が生じた.リジンでは側鎖のεアミノ基が付加した生成物も確認された.オキザニン・シトシンジアゾエートを部位特異的に導入したオリゴヌクレオチドを用いて,同様な反応が進行するか検討した.生成物をHPLCならびに電気泳動により分析した結果,DNA中のオキザニン・シトシンジアゾエートもアミノ酸,スペルミン,スペルミジンとクロスリンク形成することが明らかとなった.オキザニン・シトシンジアゾエートを含むDNAを用い,これらの損傷に対する種々の塩基除去修復酵素の修復活性を調べたが,明確な活性を示す酵素はなかった.したがって,DNAに生じたオキザニンやシトシンジアゾエートは修復されることなく細胞内分子(アミン類,DNA結合タンパク質)とクロスリンクを形成すると考えられ,今後,バルキーなDNA損傷を認識するヌクレオチド除去修復機構によるクロスリンク生成物の修復を検討する必要があると考えられる. -
酸化的ピリミジン塩基損傷を修復する新規酵素の探索
Grant number：10780331 1998 - 1999
日本学術振興会 科学研究費助成事業 奨励研究(A)
寺東 宏明
Grant amount：\2300000 （ Direct expense: \2300000 ）
放射線の生物影響は、主として放射線が細胞内の水を励起して発生させる各種活性酸素種によるものとされている。よって放射線によるDNA損傷は主として酸化的損傷であるが、活性酸素種は呼吸等の酸素を利用する代謝過程においても副産物として発生する。よって生物はそれらの酸化的DNA損傷を修復する経路を発展させ進化してきた。
本研究では、大腸菌においてピリミジンの酸化損傷であるチミングリコールの修復酵素としてEndoIIIおよびEndoVIII以外の新規修復酵素の単離を目的に、酸化的DNA損傷に対する新しい修復活性の検出を試みた。実験はまず、基質DNAとしてオリゴヌクレオチドの特定の部位に特定の損傷塩基を導入したものを作製した。EndoIIIおよびEndoVIIIはいずれも単一欠損では表現型がでず、またEndoVIIIの活性はEndoIIIの活性に隠れてしまうことから、新規修復酵素活性は更に検出が困難であると考えられた。そこで水素化ホウ素ナトリウムによる反応中間体のトラップ実験により微量な活性を検出することとした。その予備実験として、岡山大の関らがクローニングしたマウスのEndoIIIホモログにおいてEndoIIIと同様に反応中間体のトラップができるかどうかを検討した。EndoIIIについてはこれまでシッフ塩基反応中間体が水素化ホウ素ナトリウムの還元作用により共有結合化され安定な反応中間体を形成することが確認されている。実験の結果、マウスホモログも同様に安定な反応中間体を形成することがわかり、機能的にもEndoIIIのホモログであることが証明された。また実験条件検討の結果、この検出法が従来法と比較して高感度であること、また粗精製サンプル中において、ピークフラクションの特定が容易であることから最終目的であるチミングリコールに対する新規な修復酵素の検出法が確立された。 -
DNA repair enzymes for eukaryotic genetic integrity
Grant number：10044087 1998 - 1999
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B).
IDE Hiroshi, KUBO Kihei, TERATO Hiroaki, OHYAMA Yoshihiko
Grant amount：\3900000 （ Direct expense: \3900000 ）
Endonuclease III (Endo III) of Escherichia coli is known to be a DNA repair enzyme with a relatively broad specificity for oxidative pyrimidine lesions. The cDNA of a mouse Endo 111 homologue (mNTH1/mNTHL1) was cloned from a mouse T-cell cDNA library. The cDNA was 1025 nucleotide long and encoded a protein consisting 300 amino acids with a predicted molecular mass of 33.6 kDa. The recombinant mNTH1 protein with a HisィイD26ィエD2 tag was over expressed in a nth nei double mutant of Escherichia coli and purified to apparent homogeneity. The expressed mNTH1 protein released tritium labeled-thymine glycol from DNA, showing an N-glycosylase activity. mNTH1 also recognized thymine glycol, urea residues, and abasic sites specifically introduced into oligonucleotide substrates, generating P-elimination products. Thus, mNTH1 is a bifunctional repair enzyme with N-glycosylase and β-lyase activities.
7, 8-Dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG) and 2, 6-diamino-4-hydroxyformamido-pyrimidine (Fapy) are major DNA lesions formed by reactive oxygen species and involved in mutagenic and/or lethal events in cells. Both lesions are repaired by hOGG1 and Fpg in human and Escherichia coli cells, respectively. The repair activities of hOGG1 and Fpg were compared using defined oligonucleotides containing 8-oxoG and a methylated analog of Fapy (me-Fapy) at the same site. The kィイD2catィエD2/KィイD2mィエD2 values of hOGG1 for 8-oxoG and me-Fapy were comparable and this was also the case for Fpg. However the kィイD2catィエD2/KィイD2mィエD2 values of hOGG1 for both lesions were approximately 80-fold lower than those of Fpg. hOGG1 and Fpg showed distinct preferences of the base opposite 8-oxoG, with the activity differences being 19.8 (hOGG1) and 12 (Fpg)-fold between the most and least preferred bases. Such preferences were almost abolished and less than 2-fold for both enzymes when me-Fapy was a substrate, suggesting that, unlike 8-oxoG, me-Fapy is not subjected to paired base-dependent repair.