研究者詳細 - 鵜殿　平一郎

共同研究・競争的資金等の研究 - 鵜殿　平一郎

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メトホルミンとファスティング併用による腫瘍微小環境改変に関する研究

研究課題/領域番号：21K19409 2021年07月 - 2024年03月

日本学術振興会科学研究費助成事業挑戦的研究(萌芽) 挑戦的研究(萌芽)

鵜殿平一郎

配分額：6500000円（直接経費：5000000円、間接経費：1500000円）

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心血管メカノセンサーTRPV2の低酸素誘発性肺高血圧症への関与解明と治療法開発

研究課題/領域番号：21K08108 2021年04月 - 2024年03月

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C) 基盤研究(C)

中村一文, 鵜殿平一郎, 片野坂友紀, 赤木達

配分額：4030000円（直接経費：3100000円、間接経費：930000円）

持続的な低酸素症は肺血管収縮を引き起こし、肺血管リモデリングや肺高血圧症（PH）の原因となる。しかし、血管収縮が血管リモデリングにつながる正確なメカニズムはまだ解明されていない。TRPV2は、Ca2+透過性カチオンチャネルであり、血管平滑筋の膜伸張に応答するメカノセンサーである。本研究の目的は、低酸素誘発性PHの発症における血管平滑筋のTRPV2の役割を明らかにすることである。血管平滑筋特異的 TRPV2 欠損マウス（smTRPV2-/-）を作製したところ、定量的PCRにより、smTRPV2-/-マウスから分離した肺動脈平滑筋細胞においてTRPV2が欠損していることが明らかとなった。フロックスコントロール（smTRPV2flox/flox）マウスとsmTRPV2-/-マウスを低酸素および正常酸素に5週間曝露したところ、低酸素によるPHはsmTRPV2-/-マウスではsmTRPV2flox/floxマウスと比較して有意に改善された。低酸素による肺動脈の完全筋肉化の割合は、smTRPV2-/-マウスはsmTRPV2flox/floxマウスに比べ有意に低かった。MTTアッセイにより、低酸素はsmTRPV2flox/floxマウスおよびsmTRPV2-/-マウスの両方の培養肺動脈平滑筋細胞の増殖を促進することが明らかになった。しかし、smTRPV2-/-PASMCsの低酸素による増殖率は、smTRPV2 flox/flox -肺動脈平滑筋細胞のそれよりも有意に小さかった。上記よりTRPV2は、肺動脈平滑筋細胞の不適切な増加とともに、低酸素によるPHの発症に重要な役割を担っていることがわかった（本結果を2021年、2022年日本循環器学術集会において発表した）。

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腫瘍と免疫細胞の対峙を代謝で読み解く腫瘍微小環境研究

研究課題/領域番号：18H04033 2018年04月 - 2023年03月

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(A) 基盤研究(A)

鵜殿平一郎, 城口克之, 菱木貴子, 久保亜紀子

配分額：43810000円（直接経費：33700000円、間接経費：10110000円）

腫瘍が退縮する際のCD8TILsとがん細胞の代謝バランス変動と、シグナル分子変動をさらに解析するために以下のように実験を行った。
A)メトホルミンあるいは抗PD-1抗体との併用における腫瘍免疫応答に際し、Nrf2 コンデイショナルKOマウス及びp62コンデイショナルKOマウスにおけるCD8TILsのmTORC1活性化の有無、オートファジーとの関係、解糖系（Glut-1発現）との関係につき、明らかにした。上記２種類の遺伝子改変マウスでは、CD8TILsにおいてmTORC1活性化の消失（pS6リン低下）、オートファジー機能の消失（LC3B発現低下）、細胞増殖の消失（Ki67発現低下）が認められた。また、Glut-1の発現は、p62KOのCD8TILsにおいてのみ観察された。
B）腫瘍とそれを取り巻く細胞の代謝・レドックスバランスの解析。In situ 代謝解析を用いた腫瘍微小環境のレドックスおよび代謝状態の解析で本番の実験を行う。マウス腫瘍片、リンパ節、脾臓、肝臓の試料は岡山大学で作成しスライド切片にした後に、研究分担者の久保と菱木（慶應義塾大学）に送付して質量分析解析とイメージングを行った。各種代謝産物（解糖系、TCAサイクル、酸化的リン酸化）およびメトホルミン濃度を測定することができた。
C）RNAseqによる遺伝子発現解析とそれを基にしたトランスクリプトーム解析を行った。未治療、メトホルミン単独、抗PD-1抗体単独、両者の併用の４群でそれぞれCD8TILsおよび腫瘍細胞をFACSソート回収しそれらの遺伝子発現を RNAseq 法を用いて解析した。その結果、メトホルミンと抗PD-1抗体の併用により生まれる相乗効果のメカニズムについて明らかにすることができた。

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メトホルミンによる酸化ストレス応答と新免疫監視研究

研究課題/領域番号：17K19598 2017年06月 - 2020年03月

日本学術振興会科学研究費助成事業挑戦的研究(萌芽) 挑戦的研究(萌芽)

鵜殿平一郎

配分額：6500000円（直接経費：5000000円、間接経費：1500000円）

２型糖尿病治療薬メトホルミン（Met）と抗PD-1抗体の併用効果のメカニズムについて解析を行った。Met投与によりCD8TILsはROS依存性に解糖系が亢進し、さらにNrf2依存性にmTORC1が活性化されて細胞増殖を起こすことを明らかにした。抗PD-1抗体はさらに解糖系を亢進させ、Nrf2とmTORC1をさらに上昇させて細胞増殖を促し、抗腫瘍免疫応答を底上げする。Nrf2コンディショナルKOマウスではMetおよびMetと抗PD-1抗体の併用効果は消失する。一方、IFNg等のサイトカイン産生は、解糖系のみに依存し、Nrf2とmTORC1の阻害剤ではキャンセルされないことがわかった。

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２型糖尿病薬メトホルミンによる腫瘍内制御性T細胞の機能調節と抗腫瘍効果の解析

研究課題/領域番号：17K15025 2017年04月 - 2019年03月

日本学術振興会科学研究費助成事業若手研究(B) 若手研究(B)

國定勇希, 鵜殿平一郎, 榮川慎吾

配分額：4420000円（直接経費：3400000円、間接経費：1020000円）

２型糖尿病薬メトホルミンが免疫細胞を介した抗腫瘍作用を有することを先行研究で明らかとしていた。本研究により、腫瘍の増大に寄与するといわれている免疫抑制能を持つ制御性T細胞（Regulatory T cell: Treg）への作用を解析した。
マウス腫瘍移植モデルにおいてメトホルミン投与群では腫瘍局所のみのTregの細胞死を誘導し、Tregの機能抑制を生じていることを明らかとした。また、non Treg細胞からTregへの分化・誘導時に、本来であれば脂質代謝優位といわれているTregの代謝を解糖代謝優位に変化させていることを明らかとした。

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代謝調節薬によるγδT細胞依存的抗マラリア免疫亢進の機構解析

研究課題/領域番号：16K08762 2016年04月 - 2019年03月

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C) 基盤研究(C)

都田真奈, 由井克之, 鵜殿平一郎

配分額：4810000円（直接経費：3700000円、間接経費：1110000円）

世界三大感染症の一つあるマラリア感染症では免疫が減弱され、免疫記憶ができにくいことが知られている。今のところ、抗マラリア免疫を増強する手段は明らかではない。本研究では、経口糖尿病治療薬メトホルミンの新たな効能として抗寄生虫防御免疫増強作用を発見し、その機序を解析した。マウスモデルを用いた研究により、メトホルミンはγδT細胞の糖代謝に影響を及ぼさないが、S6蛋白質のリン酸化を維持し、その増殖を促すことを明らかにした。これにより、メトホルミンの免疫細胞に対する新規の作用機序を示すことができた。

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骨軟部肉腫における新規免疫機能解析システムと新規免疫治療の開発

研究課題/領域番号：16K15666 2016年04月 - 2019年03月

日本学術振興会科学研究費助成事業挑戦的萌芽研究挑戦的萌芽研究

尾崎敏文, 榮川伸吾, 長谷井嬢, 上原健敬, 鵜殿平一郎, 藤原智洋

配分額：3380000円（直接経費：2600000円、間接経費：780000円）

本研究ではマウス骨肉腫モデルにおいて，CD11b陽性の免疫細胞主体の抗腫瘍免疫機構の存在が明らかとなった．また，CD8TILs, Tregと同様に骨髄球系細胞においてもメトホルミンが細胞内代謝を制御することで抗腫瘍効果を惹起することが示され，それは細胞内における嫌気的解糖の促進によるものであった．先行研究と合わせると腫瘍微小環境においてメトホルミンがT cells, CD11b陽性細胞の双方で同様に嫌気的解糖を促進しており，腫瘍微小環境におけるglucoseの代謝制御が抗腫瘍免疫と密接に関連していることが示唆された．

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レジオネラ肺炎の感染ステージ別にみたIL-17Fの分子動態解析

研究課題/領域番号：26860618 2014年04月 - 2018年03月

日本学術振興会科学研究費助成事業若手研究(B) 若手研究(B)

梶原千晶, 鵜殿平一郎

配分額：3770000円（直接経費：2900000円、間接経費：870000円）

野生型マウス、IL-17A欠損マウス、IL-17F欠損マウス、IL-17AF欠損マウスでレジオネラ感染における生存率を比較したところ、野生型マウス群に比べてIL-17AF欠損マウス群で有意に生存率が低下した。
この時IL-17A欠損マウスにおいて、感染後IL-17Fが過剰産生されることから、IL-17Aと同様にIL-17Fもレジオネラ感染防御に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、IL-17Fは感染急性期において、自然リンパ球であるガンマデルタ（γδ）T細胞から主に産生されることがわかった。

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メトホルミンによる免疫疲弊解除研究

研究課題/領域番号：26290056 2014年04月 - 2017年03月

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(B) 基盤研究(B)

鵜殿平一郎, 榮川伸吾

配分額：16640000円（直接経費：12800000円、間接経費：3840000円）

2型糖尿病薬メトホルミンの服用により、発癌率・癌死亡率が低下するという報告があるが、そのメカニズムは不明であった。本研究では、メトホルミンの抗腫瘍効果が免疫、特にCD8T細胞（キラーT細胞）を介して行われることを明らかにした。通常、腫瘍内のキラーT細胞は疲弊し、その機能は消失している。メトホルミンはキラーT細胞の代謝、特に解糖系を高めて癌細胞を殺傷する機能を復活させることにより抗癌作用を付与していた。

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腫瘍局所の免疫疲弊解除研究

研究課題/領域番号：26670237 2014年04月 - 2016年03月

日本学術振興会科学研究費助成事業挑戦的萌芽研究挑戦的萌芽研究

鵜殿平一郎

配分額：3770000円（直接経費：2900000円、間接経費：870000円）

CD8TILの解糖系の亢進が判明した。また、ナイーヴCD8T細胞のin vitro刺激誘導系において、メトホルミン処理により解糖系及び酸化的リン酸化の双方が亢進した。一方で腸内フローラはメトホルミン服用で大きく変動しなかった。腫瘍浸潤Tregの数の優位な減少を認めた。ナイーヴCD4T細胞のin vitro 刺激によるiTreg誘導実験でメトホルミン処理により誘導効率が低下した。さらに、腫瘍浸潤MDSCの数の優位な減少、とりわけG-タイプMDSCの減少が顕著であった。また、マクロファージではM1/M2比の上昇が認められた。以上、メトホルミンによる腫瘍微小環境の改変が明確になった。

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クロスプレゼンテーションにおけるHsp90α研究

研究課題/領域番号：22501027 2010年 - 2012年

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C) 基盤研究(C)

鵜殿平一郎, 今井孝

配分額：4420000円（直接経費：3400000円、間接経費：1020000円）

クロスプレゼンテーションにおける Hsp90α研究がん抗原やウイルス抗原をキラーT 細胞が認識するためには、樹状細胞がウイルス感染細胞などの抗原を貪食し、エンドソーム内の抗原が細胞質へ引き出され、プロテアソームで分解されて抗原ペプチドになることが重要である。しかし、抗原が細胞質へ移動する機構は不明である。我々は、Hsp90α欠損マウスを作製し、熱ショックタンパク質 Hsp90がエンドソーム中の抗原を細胞質へ移動させるのに必須であることを明らかにした。

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シヤペロンによる再構築されたプロテアソームの構造機能解析

研究課題/領域番号：17659143 2005年 - 2006年

日本学術振興会科学研究費助成事業萌芽研究萌芽研究

鵜殿平一郎

配分額：3300000円（直接経費：3300000円）

分子シャペロンhsp90αを用いて、任意の細胞抽出液より26Sプロテアソームをin vitro構築することが可能である事を明らかにし、その構造及び機能の解析を行った。その結果以下の事が明らかになった。
1、ヒスチジンタグ-hsp90αをATP存在下の細胞抽出液に加えイミダゾールで回収する事により、26Sプロテアソーム及びハイブリッドプロテアソームが得られた。これらのプロテアソームは特異的基質であるsuc-LLVY-amcを加水分解した。またこの分子複合体は、hsp90の特異的阻害剤であるゲルダナマイシン処理により構造が破壊された。即ち、これらのプロテアソームの構築とその維持にhsp90αが重要な役割を果たしていることが推察された。
2、ヒスチジンタグ-hsp90αをATP非存在下の細胞抽出液に加える事により、hsp90α-20Sプロテアソームを構築する事ができた。このプロテアソーム複合体は、特異的基質であるsuc-LLVY-amcに対する加水分解活性を示さないが、MHCクラスIペプチドをフランキングを含む合成ペプチドから切り出す事ができた。また、この分子複合体の中には、hsc70,hsp40,p23,CHIPなどのシャペロン或はコシャペロン分子が会合していた。この分子複合体をさらにATP処理するとhsp40,p23,CHIPは遊離し最後にhsp90α/hsc70/20Sのみからなる複合体が得られた。hsp90α/hsc70/20Sは同様に合成ペプチドを切断する事ができた。一方、シャペロンの会合しない20Sのみの構造ではMHCクラスIペプチドを切り出す事は出来なかった。この結果は新規のプロテアソームの存在を示唆するが、生理学的にそのような構造のプロテアソームが細胞内に存在するか否かについてはさらなる検討が必要と考えられた。

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ヒト癌組織における抗原ペプチド産生能に関する基礎的研究

研究課題/領域番号：17016081 2005年

日本学術振興会科学研究費助成事業特定領域研究特定領域研究

鵜殿平一郎

配分額：7800000円（直接経費：7800000円）

微量のヒト癌組織からオーダーメイドにプロテアソームを分離精製する事を可能にした。
1,リコンビナント-ヒトhsp90α、の発現・精製を行った。
2,2例のヒト癌組織からのライセートの調整およびプロテアソームのin vitroアッセンブリ;大腸癌及び周囲の正常組織約0.1〜0.6cm^3から細胞ライセートを作製し、hsp90αを加えて、プロテアソームのアッセンブリを行った。
3,アッセンブリされたプロテアソームの精製系の確立;1、におけるリコンビナント蛋白は全て6xヒスチジンタグをそのN末側にもつ。Ni^<2+>アガロースでpull downし、これをnative-PAGEで分離しsuc-LLVY-amc及びboc-LRR-amcの加水分解活性を指標に活性を検出した(In-Gel hydrolysis assay)。
4,native-PAGEゲルをニトロセルロース膜に転写し、特異的抗体を用いてプロテアソームの構造解析を行った。
結果)0.1cm^3ほどのヒト癌組織又はその周囲の正常組織より酵素活性を有したプロテアソームを再構成し、分離精製できた。得られたプロテアソームはハイブリッド型とホモPA28型が主体であり、キモトリプシン様活性を有していた。しかし、トリプシン様活性は正常組織より回収したホモPA28型プロテアソームで極めて高いのに対し、癌からの活性は微弱であった。また、品質管理E3ユビキチンリガーゼと呼ばれるCHIPが両方の組織のホモPA28型プロテアソームに会合していた。20Sコアについては、正常組織ではXタイプ優位のスタンダード型が、癌組織では免疫プロテアソームのタイプが優位であった。以上より極微量(〜0.1cm^3)の凍結癌組織からhsp90αを用いてプロテアソーム再構成を促し、精製分離できることが明らかにされた。これらのプロテアソームを用いて癌ペプチド前駆体の切断実験が可能と判断された。

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ストレス蛋白によるエピトープ型癌ワクチンの増強効果

研究課題/領域番号：16591263 2004年 - 2005年

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C) 基盤研究(C)

永田康浩, 鵜殿平一郎, 兼松隆之, 松尾光敏

配分額：3400000円（直接経費：3400000円）

ストレス蛋白は、内在性ペプチドを効率よく抗原提示細胞のHLAクラスI上に提示することで抗腫瘍効果を示すと考えられている。本研究では、癌抗原ペプチドがストレス蛋白によって効率良く樹状細胞のHLAクラスI上に提示されるメカニズムを明らかにし,さらに特異的T細胞を誘導することで新たな癌ワクチンの開発基盤を築く。
1.NY-ESO-1抗原決定基とhsc70の融合蛋白の作製
健常人末梢血からtotal RNAを抽出した。RNAからRT-PCRによりhsc70のcDNAを得た。5'末端および3'末端のどちらか一方にNY-ESO-1の抗原決定基を含むプライマーを用いてcDNAを増幅し、NY-ESO-1とhsc70の融合遺伝子を作成した。融合遺伝子を発現ベクター(pQE31)に組み込み、さらに大腸菌に導入しNY-ESO-1とhsc70の融合蛋白を発現させた。融合蛋白は菌体を破砕して抽出した後、さらに核酸・エンドトキシン除去剤を用いて精製を行った。
2.抗原提示細胞(樹状細胞)の誘導
樹状細胞は、健常人末梢血単核球から単球を分離し、IL-4、GM-CSF存在下で5日間培養して誘導した。誘導された樹状細胞はフローサイトメトリーにより未成熟であることを確認した。
3.抗原提示能の確認
NY-ESO-1とhsc70の融合蛋白を用いて樹状細胞を感作した。さらに、感作された樹状細胞をNY-ESO-1抗原特異的細胞傷害性T細胞(CTL)と培養し、CTLからのIFNγ産生をELISPOT assayにより確認した。
4.樹状細胞の性状についての検討
各健常人末梢血単核球から分離・培養された樹状細胞をNY-ESO-1とhsc70の融合蛋白で刺激し、産生されるサイトカイン(IL-10,12)濃度をELISA法にて測定した。この結果、免疫治療においてどのような樹状細胞が抗原提示細胞に適しているかを検討した。

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癌免疫におけるプロテアソーム活性化分子群の研究

研究課題/領域番号：16023250 2004年

日本学術振興会科学研究費助成事業特定領域研究特定領域研究

鵜殿平一郎

配分額：5900000円（直接経費：5900000円）

MHCクラスI抗原プロセシングにおける、PA28,hsp90,hsp70の機能を解析した。まず、PA28 hsp90,hsp70とプロテアソームがどのような関係にあるのかを構造解析を通して検討した。Hsp90,hsp70はプロテアソームと複合体を形成しうるが、その際のATP濃度がどちらのシャペロンが結合するかを決定しているらしい事実を見つけた。また、PA28はATP濃度が低いときにはフットボール型プロテアソーム或はhsp70結合型ハイブリッドプロテアソームとして存在するが、ATP濃度が高いときにはhsp90結合型ハイブリッドプロテアソームとして存在しうるらしい事を明らかにした。即ちプロテアソーム複合体の存在様式は同一細胞内であっても非常に動的である。また、リコンビナントhsp90及びPA28αによりプロテアソーム複合体を細胞ライセートからプルダウンすることに成功した。ATP存在下でHsp90によりプルダウンされるプロテアソームは26Sタイプとハイブリッドプロテアソームであり、一方、PA28αによるプロテアソームではATP非存在下ではフットボール型が主であり、ATP存在下ではハイブリッドプロテアソームが得られる。これらの複合体のSuc-LLVY-amc加水分解活性を確認後、合成ペプチドTRP2180-193(TRP2180-188がエピトープ),CSP277-294(CSP281-289がエピトープ)とインキュベーションし、ペプチドの切断実験を行った。その結果、TRP2180-188産生にはPA28が必須であり、CSP281-289の産生にはhsp90が必須であった。これは、我々が以前にin vivoの実験で明らかにしてきた現象の分子機構を説明したものと解釈できる。

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パーフォリン遺伝子の細胞系列特異的発現機構の解析

研究課題/領域番号：15591013 2003年 - 2004年

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C) 基盤研究(C)

宮崎泰司, 鵜殿平一郎

配分額：2300000円（直接経費：2300000円）

MEFは、ETSファミリーに属する転写因子で、遺伝子破壊マウスの実験よりNK細胞におけるパーフォリン遺伝子発現に必須であるが、T細胞ではMEFを欠いていてもパーフォリン遺伝子が発現することがわかっている。これを解明するためにMEFと結合する蛋白質を同定すべくTandem Affinity Purification (TAP)法に引き続いて質量分析法を実施した。293T細胞にTAPベクターに組み込んだMEFを導入し、角蛋白質を抽出した後、アフィニティーカラムを用いて2段階の精製を行った。繰り返しの実験でSDS-PAGE上、同じパターンの蛋白質が得られ、還元・アルキル化の条件の下でそれらを質量分析によって解析した。その結果以下の蛋白質がMEF結合蛋白質として同定された。すなわち、(1)Myb binding protein1,(2)nucleolin,(3)MEF,(4)RNA helicase,(5)vimentin, (6)nucleophosminである。この中で(1)は転写制御蛋白との相互作用が報告されており、また(2)、(6)はいずれも核-細胞質間の蛋白輸送に関与すると報告され、幾つかの転写因子の活性を制御することが知られている。又、(6)は白血病での異常が報告され、化学療法感受性とも関連も指摘された。さらに、MEF結合蛋白質の対象としてMEF自身が同定されていることより、二量体としてのMEFの転写活性作用も予想される。現在、これらのcDNAをPCR法を用いてクローニングし、個々の蛋白質についてMEFとの相互作用を検討中である。

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MHC多様性と抗原提示における分子シャペロンの機能解析に基づく癌免疫治療研究

研究課題/領域番号：15025259 2003年

日本学術振興会科学研究費助成事業特定領域研究特定領域研究

鵜殿平一郎

配分額：5900000円（直接経費：5900000円）

細胞内シャペロン分子、とりわけストレス蛋白Hsp90、hsp70、hsp40の内在性抗原プロセッシングにおける機能について解析を行った。また、プロテアソーム活性化分子PA28α分子の機能もそのドミナントーネガテイブ分子を用いて解析を行った。同研究は現在も進行中であるが、期問内に明らかになった事項を下に列記する。
1、Hsp90はPA28分子と同様、MHCクラスI抗原ペプチドのCOOH末flanking部位を、20Sプロテアソームを活性化することにより促進している。
2、Hsp70はhsp40の存在下に20Sプロテアソームを活性化し、hsp90と同様にMHCクラスII抗原ペプチドのプロセッシングに関与することが明らかになった。
3、PA28分子は、多くの場合MHCクラスI抗原ペプチドのプロセッシングを促進するが、マウスではK^d, D^d結合性ペプチドの産生にはむしろネガテイブに作用することが明らかになった。これはヒト、特に日本人に多いHLA-A2結合性ペプチドにも当てはまると考えられる。この理由は、これらのMHCクラスI分子結合ペプチドのアンカーアミノ酸の存在により、ペプチドが20Sプロテアソームによりエピトープ内で切断されやすくなるためと推測された。一方hsp90による抗原ペプチドのプロセッシングはMHCアレルとの相関関係は認められなかった。
4、Hsp90,hsp70/hsp40が20Sプロテアソームを直接活性化できるのかどうかが今後in vitroの実験系で確認しなければならない事項と考えられる。

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抗原プロセッシングにおけるhsp90、PA28の機能解析

研究課題/領域番号：14657058 2002年 - 2003年

日本学術振興会科学研究費助成事業萌芽研究萌芽研究

鵜殿平一郎, 由井克之

配分額：3300000円（直接経費：3300000円）

細胞内シャペロン分子、とりわけストレス蛋白Hsp90、hsp70、hsp40の内在性抗原プロセッシングにおける機能について解析を行った。また、プロテアソーム活性化分子PA28α分子の機能もそのドミナントーネガテイブ分子を用いて解析を行った。同研究は現在も進行中であるが、期間内に明らかになった事項を下に列記する。
1、Hsp90はPA28分子と同様、MHCクラスI抗原ペプチドのC00H末flanking部位を、20Sプロテアソームを活性化することにより促進している。
2、Hsp70はhsp40の存在下に20Sプロテアソームを活性化し、hsp90と同様にMHCクラスI抗原ペプチドのプロセッシングに関与することが明らかになった。また、Hsp40ドミナントーネガテイブ分子は内在性抗原プロセッシングを抑制する。
3、PA28分子は、多くの場合MHCクラスI抗原ペプチドのプロセッシングを促進するが、マウスではK^d,D^d結合性ペプチドの産生にはむしろネガテイブに作用することが明らかになった。これはヒト、特に日本人に多いHLA-A2結合性ペプチドにも当てはまると考えられる。一方hsp90による抗原ペプチドのプロセッシングはMHCアレルとの相関関係は認められなかった。
4、Hsp90,hsp70/hsp40が20Sプロテアソームを直接活性化できるのかどうかが今後in vitroの実験系で確認しなければならない事項と考えられる。

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ストレス蛋白-ヒト癌抗原ペプチド融合蛋白を用いた癌ワクチンの開発

研究課題/領域番号：14571146 2002年 - 2003年

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C) 基盤研究(C)

永田康浩, 兼松隆之, 鵜殿平一郎

配分額：3500000円（直接経費：3500000円）

ストレス蛋白hsc70の抗腫瘍効果についてはこれまで須藤,鵜殿,Srivastavaらにより動物モデル(マウス)において示されてきた.近年,hsc70特異的受容体が同定され,hsc70に関わる抗原提示のメカニズムが明らかにされつつある.それにともないhsc70を用いた癌ワクチンの臨床応用に対する期待が高まっている.しかしこれまでの研究の多くがマウスにおけるものであり,ヒトの癌抗原システムにおける詳細な解析は行われていない.今回,我々はヒト癌抗原として同定されたNY-ESO-1抗原決定基とhsc70の融合蛋白で抗原提示細胞(樹状細胞)を感作し、NY-ESO-1抗原決定基が樹状細胞のMHC class I上へ提示されることをNY-ESO-1特異的細胞傷害性T細胞によって証明した.
1.癌抗原とhsc70の融合蛋白の作製
健常人末梢血からtotal RNAを抽出した.RNAからRT-PCRによりhsc70のcDNAを得た.5'末端および3'末端のどちらか一方にNY-ESO-1の抗原決定基を含むプライマーを用いてcDNAを増幅し,NY-ESO-1とhsc70の融合遺伝子を作製した.融合遺伝子を発現ベクター(pQE31)に組み込み.さらに大腸菌(M15株)に導入しNY-ESO-1とhsc70の融合蛋白を発現させた.融合蛋白は菌体を破砕して抽出した後,さらに核酸・エンドトキシン除去(Kurimover)も併用して精製を行った.
2.抗原提示細胞(樹状細胞)の誘導
樹状細胞は,健常人末梢血単核球から単球を分離し,IL-4,GM-CSF存在下(各々1000U/ml)で5日間培養して誘導した.誘導された樹状細胞の細胞表面マーカーはFlow cytometryにより確認した.
3.融合蛋白由来抗原エピトープの提示
NY-ESO-1とhsc70の融合蛋白を用いて抗原提示細胞(樹状細胞)を感作した.さらに,感作された樹状細胞をNY-ESO-1抗原特異的細胞傷害性T細胞(Clone5)と共培養し,Clone5からのIFN-γ産生をELISPOT assayにより確認した.
今後は,樹状細胞上のhsc70特異的受容体の同定を含めた抗原提示経路の解明が必要である.

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ストレス蛋白hsp90,PA28の分子生物学的特性に基づく癌免疫治療研究

研究課題/領域番号：14030067 2002年

日本学術振興会科学研究費助成事業特定領域研究特定領域研究

鵜殿平一郎, 由井克之

配分額：5500000円（直接経費：5500000円）

プロテアソーム調節分子PA28は20Sプロテアソームのペプチド分解活性を促進し、癌抗原を初めとする多くの抗原ペプチドのプロセシングを促進すると考えられている。一方、相当数の抗原ペプチドのプロセシングはPA28により促進されないことも報告されている。我々の研究結果はさらに踏み込み、MHCクラスI結合ペプチドのアンカーモチーフ構造がPA28依存性のプロセシングに影響を与える可能性を示唆した。さらには、hsp90がPA28に類似の機能を有することを明らかにし、MHCクラスI抗原のプロセシングがPA28とhsp90のそれぞれ異なる経路に支配されていることが明らかになった。即ち、抗原ペプチドはPA28-、hsp90-、或いはこの両者によってプロセシングされるものに分類され、その大原則にペプチドのアンカーモチーフが関与している。
またPA28α鎖のドミナント-ネガティブ分子(PA28αΔC5)を発見した。PA28αΔC5を含むハイブリッドプロテアソームの酵素活性は完全に消失する。本来PA28-プロテアソーム分子は蛋白分解の酵素であり、抗原提示専門の酵素ではないため、非常にバラエティに富む働きを行っていると考えるのが当然であり、事実、細胞周期及びアポトーシスの制御に関与があることがPA28αΔC5を用いた実験で初めて明らかになった。これらの原因は即ちPA28-プロテアソーム分子により、ある程度選択的に細胞周期関連分子の分解が行われているためであり、その結果アポトーシス制御にも影響を及ぼすということである。
以上の結果は、抗原提示のみならず、癌細胞の増殖、死滅においてもPA28分子が非常に重要な機能を果たす可能性を示唆しており、今後PA28の機能をうまくコントロールすることにより癌治療に大いに貢献できる可能性があると考えられる。

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原虫抗原/hsp70融合蛋白を用いたマラリアワクチン防御免疫の分子機構

研究課題/領域番号：13670248 2001年 - 2002年

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C) 基盤研究(C)

本間季里, 鵜殿平一郎, 由井克之

配分額：3600000円（直接経費：3600000円）

hsp70にマラリア原虫CS蛋白のCTLエピトープを結合させた融合蛋白をマウスに免疫することにより、CS特異的CTLの誘導と部分的防御免疫得られることを我々はこれまで明らかにしてきたが、本研究の目的は抗原特異的CTLの誘導機序を明らかにすることである。
1.バキュロウイルスによるリコンビナント蛋白の作製
上記で用いた融合蛋白は大腸菌で発現させた融合蛋白であるため、大腸菌由来のLPSなどの僅かな混入により樹状細胞の抗原提示能が影響される可能性がある。そこで、大腸菌由来物質の混入を回避するため、バキュロウイルスによるリコンビナント蛋白の作製を行なった。
2.抗原特異的CTLの誘導機序を明らかにするためのモデルシステムの確立
H2-K^b拘束性に卵白アルブミンペブチドOVA_<257-264>を認識するCD8^+T細胞のT細胞レセプターのトランスジェニックマウス(OT-1)のリンパ節より精製したCD8^+T細胞と、モデル抗原としてのOVA_<257-264>を結合させたマウスhsc70(hsc70-OVA)の融合蛋白をパルスした抗原提示細胞(APC)を培養する。APCがhsp70-OVAを取り込みOVA_<257-264>の提示を行なったか否かは、OT-1由来CD8^+T細胞からのIFN-γ産生を指標に行なった。その結果、樹状細胞はhsc70-OVAを取り込み、OVA_<257-264>をOT-1T細胞に提示出来ることが明らかとなった。
3.抗原特異的CTLの誘導機序の解析
樹状細胞をブレフェルデインA、クロロキンなどの抗原提示経路の阻害剤で前処置することにより、抗原特異的CTLの誘導機序を解析した。その結果、外来性抗原として取り込まれたhsc70-OVAの提示には樹状細胞内のTAP分子は必ずしも必要ないこと、エンドソームでCTLエピトープとMHCクラスI分子が会合する経路が存在することを明らかにした。

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ストレス蛋白の分子生物学的特性に基づく癌免疫治療研究

研究課題/領域番号：13218102 2001年

日本学術振興会科学研究費助成事業特定領域研究(C) 特定領域研究(C)

鵜殿平一郎, 由井克之

配分額：5200000円（直接経費：5200000円）

リコンビナントhsc70-癌抗原ペプチド融合分子により活性の高いCTLを誘導できることを我々は明らかにした。一方CTL認識ペプチドをIFAと混合して免疫する際に同じMHCハプロタイプ(クラスII)拘束性のヘルパーペプチドと同時投与してやるとCTLの感作が強く行われる。そこで、hsc70分子のN末にモデル抗原OVA(ovalubumin)のI-A^b拘束性ペプチドOVA_<265-280>を融合し、同時にC末にCTLエピトープOVA_<257-264>を融合させたリコンビナント分子を作製した。この分子でマウスを免疫し脾臓細胞をin vitroで6日間ペプチド刺激し、得られたエフェクター細胞(CD8^+T細胞)の細胞傷害活性とELISPOTアッセイ法によるIFNγ産生細胞数を解析した。その結果細胞傷害活性はCTLエピトープ単独融合分子とヘルパー及びCTLエピトープ両方融合分子では差が認められなかった。しかし、IFNγ産生細胞数はヘルパーエピトープ付加により、2〜4倍に増加した。即ち、ヘルパーエピトープはhsc70に融合した場合、CD8^+T細胞の感作活性を増強させることが判明した。OVA_<265-280>の代わりにI-A^d拘束性のPlasmosium yoelii circumsporozoite蛋白由来のヘルパーエピトープを融合させた場合にはOVA_<257-264>に対する反応性の亢進は認められないことよりMHC拘束性が確認された。さらにOVA_<265-280>とマウスメラノーマ抗原TRP2_<180-188>の両方をhsc70に融合し、同様に解析した結果、TRP2_<180-188>に対してIFNγ産生細胞数はTRP2_<180-188>単独融合分子の場合よりもやはり2〜4倍増加していた。即ち、ヘテロのヘルパーエピトープであってもMHC拘束性が一致していれば感作されるCD8^+T細胞数が増加することが判明した。

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MSP1/hsp70融合蛋白ワクチンによるマラリア防御免疫機構の基礎研究

研究課題/領域番号：12670234 2000年 - 2001年

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C) 基盤研究(C)

由井克之, 鵜殿平一郎

配分額：3900000円（直接経費：3900000円）

我々は、マラリア原虫Plasmodium yoeliiのMSP1抗原とマウス熱ショック蛋白70(hsp70)との組換え融合蛋白を大腸菌に発現させて精製しマウスに免疫することにより、スポロゾイト感染に対して肝細胞期と赤血球期両者における防御免疫が誘導されることを明らかにしてきた。この免疫方法では、MSP1抗原特異的抗体産生とT細胞のIFN-γ産生などの細胞性免疫の両者が誘導される。今回、免疫マウスの肝細胞期における感染防御機構について解析を行った。肝細胞期の防御効果は赤血球期においては原虫血症の消失或いは出現遅延として観察される。肝細胞期において防御されていることを証明するため、スポロゾイト感染後の肝内原虫数を原虫rRNAのreal time RT-PCR法により解析した。MSP1/hsc70免疫群で特異的に原虫数が低下することから、MSP1特異的免疫応答により肝内の防御免疫が成立することが示された。防御免疫機構を解析するため、免疫マウスから肝内リンパ球を調整してC57BL/6マウスに養子移入を行い、スポロゾイトの攻撃感染を行った。肝内での防御免疫は、リンパ球を移入したマウスでは成立したが、抗体を移入したマウスでは成立せず、細胞性免疫により担われていることが示された。さらに、リンパ球サブセットに特異的な抗体を免疫マウスに投与することによりT細胞分画を除去する方法を用い、防御免疫を担うT細胞分画の解析を行った。抗体によりCD4とCD8陽性細胞の両者を除去しても肝細胞期における防御効果は失われず、CD4-CD8細胞が防御免疫を担っている可能性が示唆されてた。この肝細胞期防御免疫は、S57BL/6マウスばかりでなくBALB/c、C3H及びAKRマウスでも観察されており、MHCの多様性を越えて防御効果を誘導できる可能性が示された。

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ストレス蛋白-癌抗原融合分子による抗腫瘍効果

研究課題/領域番号：12217113 2000年

日本学術振興会科学研究費助成事業特定領域研究(C) 特定領域研究(C)

鵜殿平一郎, 新原直樹, 由井克之

配分額：5100000円（直接経費：5100000円）

我々はCTL認識抗原ペプチドを遺伝子工学的にストレス蛋白分子hsc70と融合させた融合分子がワクチンとして確実な効果があることを証明し、その細胞性免疫誘導機構及びストレス蛋白分子のどのような性状にそれが依拠するのかを明らかにした。腫瘍抗原ペプチドpRL1a(マウス白血病細胞RL♂1のLd拘束性ペプチド)、TRP2(マウスメラノーマB16のKb拘束性ペプチド)、さらにモデル抗原としてOVA257-264をそれぞれhsc70のC末に融合してその免疫効果を検討した。これら3つのペプチドに対して強力なCTLが誘導された。これらのCTLはオリジナルの腫瘍に対しても高い傷害活性を示した。CTLエピトープの融合部位はhsc70のN末、C末どちらでもよかった。in vivoへの投与経路は皮下、皮内ではなく静脈内投与が最も効果的であった。このことはhsc70のターゲットとする抗原提示細胞は皮下ランゲルハンス細胞ではないことを意味している。むしろ、脾臓内未熟樹状細胞、或いはマクロファージの可能性が高い。hsc70融合分子によるCTL誘導にはCD4^+T細胞は必須ではなかった。また、免疫の際にカラゲナンを投与するとhsc70融合分子によるCTL誘導は全く消失するためカラゲナン感受性の抗原提示細胞がhsc70融合分子のプロセッシングにあたると推測された。
次にhsc70のどの領域がCTL誘導に必須であるかを検討するためにhsc70のdeletion mutantsとCTIエピトープの融合分子を作製した。その結果hsc70280-385の間に必須領域があると判断した。
hsc70はある細胞表面受容体をもつ特定の抗原提示細胞に特異的に取り込まれると考えられている。この受容体の特定と同時にhsc70280-385と受容体の結合を介して細胞内に取り込まれる可能性を今後検討する。

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ストレス蛋白-マラリアCS抗原融合分子によるワクチン効果の分子機構

研究課題/領域番号：11670245 1999年 - 2000年

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C) 基盤研究(C)

鵜殿平一郎, 由井克之

配分額：3500000円（直接経費：3500000円）

我々はPlasmodium yoelii circumsporozoite(CS)蛋白由来のK^d拘束性epitope(PYE)をコードするmini-genesをマウスhsc70遺伝子と融合しこれで免疫することによりCTLの誘導を検討した。即ちPYEをhsc70のN又はC末に融合させた分子を作製し大腸菌にて発現させた(hsc70-PYE,PYE-hsc70)。この2種類の融合分子を皮下、皮内、静脈内に各週2回免疫した。脾臓細胞を調整後PYEペプチドで6日間in vitro刺激を行い、P815(H-2d)に同ペプチドをパルスしたものを標的細胞としてクロム51遊離試験にてCTL活性を検査したところ静脈内投与が最も有効であった。脾臓細胞をペプチドで48時間刺激して得られたELISPOT assayでも同様の結果であった。また、hsc70によるCTL誘導にはCD4^+T細胞は必須ではかった。しかし免疫の際にカラゲナンを投与するとCTL誘導は全く消失してしまうことからカラゲナン感受性の抗原提示細胞がhsc70融合分子のプロセッシングにあたると推測された。以上のことはhsc70は皮下ランゲルハンス細胞よりもむしろある細胞表面受容体をもつ特定の脾臓内抗原提示細胞に特異的にターゲッテイングされると考えられる。
次にhsc70のどの領域がCTL誘導に必須であるかを検討するためにhsc70のdeletion mutantsを作製し、これとPYEの融合蛋白を作製しCTL誘導能を検討した。その結果、hsc70_<280-385>の間に必須流域があると判明した。
今後hsc70の受容体の特定が必須の課題であると考えられる。さらにhsc70_<280-385>が細胞表面受容体を介して細胞内に取り込まれる可能性を今後検討しなければならない。

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不活化スポロゾイトの免疫による赤内型マラリア原虫に対する防御免疫誘導機構

研究課題/領域番号：11147226 1999年

日本学術振興会科学研究費助成事業特定領域研究(A) 特定領域研究(A)

由井克之, 鵜殿平一郎

配分額：1700000円（直接経費：1700000円）

X線照射により不活化したPlasmodium yoelii(P.yoelii)スポロゾイトで繰り返しマウスを免疫することにより、抗マラリア原虫抗血清を作成した。この抗血清を用い、Western blot法で赤内型原虫抗原を解析することにより、複数の抗原を同定した。主要なものは、P.yoelii HSP70、MSP1抗原及び未同定の抗原であった。これらの抗原は、肝細胞期と赤血球期原虫の両者に発現されると考えられる。赤内型P.yoelii のcDNAライブラリーを作成し、P.falciparum HSP70のプローブでスクリーニングすることにより、P.yoelii HSP70のcDNAをクローニングした。また抗血清で同ライブラリーをスクリーニングすることにより、新たなマラリア原虫抗原cDNAをクローニングした。この新抗原cDNAの全塩基配列はまだ決定されていないが、従来同定されていない新しい原虫抗原であることが明らかになっている。
MSP1が赤内型と肝細胞期両者に発現されることから、MSP1抗原C末端のEGF様ドメインを含む15kDaペプチド断片とマウスHSP70との組換え融合分子を作成した。他のアジュバントなしでこの融合蛋白で免疫することにより、肝細胞期と赤血球期両者に有効な防御免疫を誘導することに成功した。C57BL/6マウスではスポロゾイト感染後赤内型原虫が全く出現せず、肝細胞期における感染阻止が示された。この防御免疫能は、血中抗MSP1抗体価とは直接の相関がなかった。一方、免疫マウスは赤内型原虫の感染に対しても抵抗性を示した。このことから、MSP1/HSP70融合蛋白ワクチンの免疫により肝細胞型と赤内型両者に有効な防御免疫が誘導されると考えられた。

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ストレス蛋白・癌抗原融合蛋白分子による抗腫瘍効果

研究課題/領域番号：11140257 1999年

日本学術振興会科学研究費助成事業特定領域研究(A) 特定領域研究(A)

鵜殿平一郎, 由井克之

配分額：2700000円（直接経費：2700000円）

マウスのhsc70遺伝子を鋳型として3'側のプライマーに癌抗原ペプチドpRL1a(RL♂1)、TRP2(B16)、又はマラリアCS抗原、OVA抗原(E.G7)、HY抗原をコードするmini-geneをそれぞれ入れ、PCR法で遺伝子増幅する。これを発現ベクターに組み込み大腸菌にて大量に発現された。それぞれの蛋白分子1mgで隔週2回免疫し、脾臓細胞を取り出し同ペプチドでin vitro刺激を行いELISPOT法とクロム51遊離試験で効果を比較した。いずれの抗原ペプチドでも特異的な細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導が可能であることが判明した。即ち、抗原ペプチドの種類に制限はないと考えられた。さらにRL♂1、B16、E.G7を皮内に注射しvivoで腫瘍増殖の抑制効果を判定する試みを現在も続けているが、完全抑制とまではいかないようである。しかし、マラリア抗原MSP-1のほぼ全長とhscp70の融合分子はスポロゾイト攻撃感染を肝臓期に完全に抑制するという実験結果も我々は得ており、このことから単一のCTLエピトープだけではなくヘルパーエピトープも含めた複数のエピトープがより強力なワクチン効果を発揮する上で重要であると推察された。
通常、リコンビナントhsc70分子にはほとんどATPase活性が認められないのが現実であるが、我々の特種なrefolding操作によりnative分子と同様のATPase活性を持ったhsc70蛋白分子の精製を可能にした。このATPase活性の強さとCTL感作の強さに相互関係があることがわかった。また、hsc70のN末側アミノ酸280番から300番目の間にCTL感作に大きく影響を及ぼす領域があることが変異hsc70分子を用いた実験で明らかになった。

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熱ショック蛋白と免疫応答

1998年

資金種別：競争的資金

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フリプトコックス感染症の発症機序におけるストレス蛋白の関与-ワクチン療法への応用

研究課題/領域番号：08670667 1996年 - 1998年

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C) 基盤研究(C)

河野茂, 鵜殿平一郎

配分額：2200000円（直接経費：2200000円）

Cryptococcus感染症は、AIDSの日和見感染症の一つとして重要な疾患であるばかりでなく、健常人にも発症する疾患である。近年、細菌や寄生虫などの感染症における主たる抗原がこれらの病原体のストレス蛋白(Heat shock protein:HSP)であり、HSPが宿主の免疫応答を引き起こす認識抗原となっていることが明らかになった。しかし、Cryptococcus neoformansに関する報告は未だみられない。今回、我々は肺感染マウスモデルを用い、Western blotting法にて、感染マウス血清中のHSPに対する抗体の存在の有無について検討を行った。その結果、感染血清中には菌体の蛋白に対する数種類の抗体の出現が認められた。その中で77kDaの蛋白は、immunodominantで、抗HSP70抗体を用いた実験などでHSP familyであることが証明された。これらの結果より、Cryptococcus感染症においても他の感染症と同様に微生物自身のHSPが免疫応答を引き起こしているものと思われた。本研究は、Cryptococcus感染症における免疫機構の一部を解明できたと思われる。

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熱ショック蛋白結合性腫瘍抗原ペプチドの解析

研究課題/領域番号：07274244 1995年

日本学術振興会科学研究費助成事業重点領域研究重点領域研究

鵜殿平一郎

配分額：3100000円（直接経費：3100000円）

Meth A腫瘍由来のHSPの分離、精製を一部改良し非常に高純度のHSPを精製し結合している内因性ペプチドの同定、解析を改めて行った。Meth A腫瘍の10万gの上清を硫安沈殿法にて0-50%、50-80%の分画に分けた。50-80%の画分にはgp96が存在しておりこれをさらにCon A sepharose及びMono Qカラムを用いたFPLCにて高純度(98%以上)のgp96を精製し。また、Con A sepharoseに結合しない分子及び硫安沈殿法にて0-50%の画分蛋白を混合しMono Qカラムを用いてcrudeのhsp70を精製しさらにADPアガロースカラムを用いて98%以上の純度でhsp70を精製することに成功した。このhsp70にはMeth Aに対する抗腫瘍効果が認められた。同hsp70をATP処理し、遊離してきた低分子をC18逆相カラムにてHPLC解析を行いペプチドの存在を確認した。これらペプチドのプールシークエンスを行った結果は作年我々が指摘したものと同じようにN末1番目のアミノ酸はIIe,Leu,Valの分岐鎖アミノ酸、及びAla,Pheの頻度が高く合計すると全体の70%くらいを占める。2番目にはこれらのアミノ酸残基に加えAsn,Asp,Glu,Gln,Lys,Ser,Thrなどの親水性のアミノ酸が位置していた。Gly,Proは3番目から7番目くらいに高頻度に認められた。Gp96からTFA処理にて得られたペプチドのプールシークエンスも同様の結果であった。さらに現在gp96及びhsp70から遊離してきた一部のペプチドピークをエドマン分解法にてそのアミノ酸配列を決定している。

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熱ショック蛋白70-マラリア抗原ペプチド複合体によるワクチン効果の検討

研究課題/領域番号：06670259 1994年 - 1995年

日本学術振興会科学研究費助成事業一般研究(C) 一般研究(C)

鵜殿平一郎, 小野俊郎

配分額：2000000円（直接経費：2000000円）

マウスマラリアPlasmodium bergheiに対する赤外型ワクチンモデルの作成のためにPlasmodium berghei CS蛋白に対する細胞性免疫応答の誘導を試みた。宿主にはBALB/cマウスを使用した。15EA02:1、Plasmodium bergheiのCS蛋白に対してキラーT細胞を誘導するためにH-2K^d拘束性のキラーT細胞エピトープとして知られるNDDSYIPSAEKIを合成し、同ペプチドと熱ショック蛋白70(hsp70)を混合し37℃で1時間インキュベートすることにより結合させた。この結合はATPに感受性があるためATP、Mg^<2+>の存在下で結合したペプチドはhsp70から解離する。
2、このhsp70-ペプチド複合体10μgでマウスを隔週2回免疫しその脾細胞をin vitroで同様のペプチドで刺激し、得られたキラーT細胞の活性は同じペプチドをp815(H-2^d)腫瘍にパルスした細胞を標的細胞としクロム51遊離法で検出した。
3、in vitroにおけるペプチド刺激の際、どれくらいのペプチド濃度の時に最も強いキラー活性が得られるかを調べるために1x10^4,1x10^5,1x10^6,1x10^7,1x10^8M濃度のペプチドで刺激を行ったところ1x10^6及び1x10^7Mで低いながらも一番強い活性が認められた。
4、さらに初期培養の際にIL2を添加することによりキラー活性が増強するかを検討したが、いずれのペプチド濃度で刺激した際にも活性は逆に低下することがわかった。
5、初期培養で得られた弱い活性をもつ細胞をさらに同様のペプチドで再刺激を行いこれを繰り返すことにより、さらなる活性の増強が認められたため、現在T細胞培養株の確立を進めている。

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熱ショック蛋白結合性腫瘍抗原ペプチドの解析

研究課題/領域番号：06282241 1994年

日本学術振興会科学研究費助成事業重点領域研究重点領域研究

鵜殿平一郎

配分額：3300000円（直接経費：3300000円）

Hsp70からATP依存性に遊離してきたペプチドのプールシークエンスの結果はN末1番目のアミノ酸はIle,Leu,Valの分岐鎖アミノ酸、及びAla,Pheの頻度も高くこれらのアミノ酸の量を合計すると全体の80%くらいを占める。2番目にはAsn,Asp,Glu,Gln,Lys,Ser,Thrなどの親水性のアミノ酸が位置する。Gly、Proは2ないし3番目から7番目くらいに高頻度に認められた。この結果は4回おこなったいいずれの実験でも同様であった。ER内にあるgp96からTFA処理にて得られたペプチドのプールシークエンスからもほぼ同様の結果が得られた。このことはhsp70及びgp96のペプチド結合部位の構造が類似である可能性を示唆する。
さらにhsp70から遊離してきたペプチドをC18逆相カラムにより分離し一部のペプチドピークをエドマン分解法にてそのアミノ酸配列を決定した。これまでにRas蛋白、hsp84、Annexin、Laminin、などに由来する約15本のペプチドのアミノ酸配列が決まったがそのほとんどは内因性由来の蛋白分子からきている。またタンデム質量分析器を用いてペプチドの分子量をみたところ約800から2000の範囲に多くのペプチドが観察された。Hsp70については従来からクラスIIの抗原提示に関与していることが言われてきたが、これらペプチドの解析の結果からクラスI及びクラスII両方の経路に関与している可能性が考えられる。さらに小胞体にあるgp96,Bipの結合ペプチドの構造決定が必要である。これらの結果をもとに、ストレス蛋白に結合している腫瘍抗原ペプチドの検出を行なうことも検討中である。

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分子シャペロンと抗原のプロセッシング

資金種別：競争的資金

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ストレス蛋白を用いたワクチン開発

資金種別：競争的資金

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プロテアソームin vitro再構築

資金種別：競争的資金

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プロテオーム解析特にLC/MS

資金種別：競争的資金

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生物活性の高いリコンビナント蛋白のrefolding 法の確立

資金種別：競争的資金

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癌の遺伝子治療及び免疫治療

資金種別：競争的資金

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HLA 提示ペプチドの予測技術の確立

資金種別：競争的資金

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細胞傷害性T 細胞の誘導法

資金種別：競争的資金

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ストレス蛋白の精製・調整法

資金種別：競争的資金

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免疫研究に用いられる一般的研究手法

資金種別：競争的資金

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MethodsIn for vitro reconstitution of 26S proteasome

資金種別：競争的資金

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分子シャペロンHsp90, hsp70,hsp40, gp96、さらにプロテアソームとその活性化分子PA28 を対象に研究を推進している。これらの分子群を介した細胞内抗原プロセシング、蛋白分解の詳細を明らかにする。即ち、20S プロテアソームに結合する上記cap 分子の違いにより、産生される抗原ペプチドのレパトリーにどのような差異が生じるのか、そのことが疾患感受性にどうつながるのかを解析

資金種別：競争的資金

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分子シャペロン及びPA28 の性質を応用し、癌・感染症に対するワクチン開発を行う。技術的にはこれら分子の細胞からの精製・調整と免疫学的及び生化学的解析を行っている

資金種別：競争的資金

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MS を用いたプロテオーム解析とマイクロアレイ解析を併用し、蛋白分解とRNA 恒常性に及ぼす分子シャペロン及びPA28 の影響を網羅的に解析

資金種別：競争的資金

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Refolding method for recombinant proteins that keep high physiological activity

資金種別：競争的資金

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Gene therapy and immunotherapy for cancer