共同研究・競争的資金等の研究 - 須藤 雄気
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全反射型赤外分光法による過渡的複合体の解析
研究課題/領域番号：22121508 2010年 - 2011年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型) 新学術領域研究(研究領域提案型)
須藤 雄気
配分額：11440000円 （ 直接経費：8800000円 、 間接経費：2640000円 ）
細胞内外の情報や物質のやり取りを行う"膜タンパク質"は、生命活動に重要である。我々は、光受容体・ロドプシンと伝達膜タンパク質の"膜分子複合体の過渡的変化"を様々な手法により解析している。このうち、赤外分光(FTIR)法やラマン分光法に代表される振動分光法は、分子振動を鋭敏に捉える手法で、側鎖,主鎖,低分子(イオンや水など)の微細構造変化を捉えることができ、X線結晶構造解析やNMR解析では得ることが難しい情報を取得することができる。本研究では以下の4点について研究を行い、成果を得た。本研究を通じて、膜蛋白質解析のボトルネックである、試料調製法や解析手法を確立できたと考えている。
1)FTIR解析に適した試料調製[Sudo et al.2011a,J.Biol.Chem.,Sudo et al.2011,Biophysics]
2)低温/時間分解赤外分光法によるロドプシンタンパク質の構造変化解析[Sudo et al.2011b,J.Biol.Chem.,Irieda et al.2011,Biochemistry]
3)ラマン分光法など他の分光測定[Mizuno et al.,2011,Biochemistry,Inoue et al.,2011,J.Phys.Chem.B]
4)全反射型FTIR(ATR-FTIR)におけるイオンと膜タンパク質の相互作用解析を行い、解析の難しい膜タンパク質の微細構造変化を明らかにした[投稿準備中]。 -
2段階励起過渡回折格子法の開発と情報伝達タンパク質の光反応機構の解明と制御
研究課題/領域番号：21770165 2009年 - 2010年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B) 若手研究(B)
井上 圭一, 須藤 雄気
配分額：4420000円 （ 直接経費：3400000円 、 間接経費：1020000円 ）
過渡回折格子法を用い、真正細菌Salinibacter ruber由来の細胞の走光性を引き起こすための光受容タンパク質、Sensory Rhodopsin Iの光反応ダイナミクスを調べた。その結果これまで知られていなかった中間体の存在を明らかにした。そしてさらにそれぞれの中間体のエンタルピーを決定することにも成功し、それらが塩化物イオンの結合によって大きく影響を受けることを突き止めた。
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べん毛モーター固定子複合体の相互作用・イオン透過・構造変化の解析
研究課題/領域番号：21770166 2009年 - 2010年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B) 若手研究(B)
須藤 雄気
配分額：4550000円 （ 直接経費：3500000円 、 間接経費：1050000円 ）
細菌は環境を認識するレセプターと運動器官(べん毛モーター)により過酷な環境を生き抜く。本研究では、全反射型赤外分光法により、これまで謎とされてきた固定子複合体(PomAB)とNa^+の結合にAsp24が直接関与すること(Sudo et al.2009b,Biochemistry)、その親和性と他に2つのカルボン酸が結合に関与することを明らかにした。変異体解析からCys31-PomBがイオン透過を制御すること(Sudo et al.2009,Biophysics)、サルモネラ菌の固定子・MotBのC末端の構造を明らかにした(Kojima et al.2009,Mol.Microbiol.)。さらに本研究の一部として、新規受容体を単離し物理化学的性質を明らかにした(Suzuki et al.2009,J.Mol.Biol.,Sudo et al.2009a,Biochemistry,Yagasaki et al.2010,Biochemistry,Sudo et al.2011,J.Biol.Chem.)。
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2008年 - 2011年
科学技術振興機構 戦略的な研究開発の推進 戦略的創造研究推進事業 さきがけ
須藤 雄気
担当区分：研究代表者
光による物質操作は、高い空間分解能と時間分解能を実現できます。本研究は、光受容蛋白質で細胞機能を操作することを目的とし、生命反応が「いつ・どこで・どのように・どれぐらい」起こっているかを明らかにします。特にキナーゼ活性化・不活性化、及び転写調節は生命科学分野で極めて重要な研究課題であり、本研究では、これを人為的に制御し、他の手法ではわからない新しい情報を得ます。
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膜蛋白質の機能変換から観る機能-構造変化の連関性と分子論的理解
研究課題/領域番号：20050012 2008年 - 2010年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究 特定領域研究
須藤 雄気
配分額：3400000円 （ 直接経費：3400000円 ）
2-1. 忌避応答光センサー蛋白質、SRIIの機能発現分子メカニズム
現在阪大/水谷グループと共同で、機能・構造変化に必須のアミノ酸残基(Tyr174)の変化を検出するため、時間分解紫外共鳴ラマン測定を行っている。
2-2. デュアル光センサー蛋白質、SRIの機能発現メカニズム
(1)新しいSRI分子、SrSRIのCl^-依存的光反応変化を見出した[J.Mol.Biol. 2009](A01:藤井グループとの共同研究)。(2)新しいSRI分子、HvSRIの発現・精製と分光解析[Biochemistry 2010](A01:藤井グループとの共同研究)。(3)SrSRIと伝達タンパク質、SrHtrIの複合体の機能発現系構築に成功し、その分光学的解析を行った[Biochemistry 2009a](A01:藤井グループとの共同研究)。
2-3. SRI-HtrIが制御するべん毛蛋白質の解析
SRI-HtrIが受けた光情報は、最終的にべん毛モーターの回転方向の制御として出力される。ここでは、べん毛固定子タンパク質MotBの部分結晶構造と[Mol.Microbiol. 2009]、赤外分光法によるNa^+透過経路の検討を行った[Biochemistry 2009b]
このように光センサータンパク質の機能発現機構について、分子科学的に迫ることが出来た。 -
分子生理学的解析から探る膜蛋白質複合体の機能発現機構
研究課題/領域番号：19870010 2007年 - 2008年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(スタートアップ) 若手研究(スタートアップ)
須藤 雄気
配分額：3125000円 （ 直接経費：2720000円 、 間接経費：405000円 ）
1)SRII-HtrII膜蛋白質複合体を介した光情報伝達(忌避応答)
代表者らは、これまでSRII-HtrIIを介した細菌の光忌避行動について、生化学的・生理学的検討を行ってきた。今年度は、固体NMRを用いたSRII-HtrIIの相互作用解析(雑誌論文7)、溶液NMRを用いたHtrIIの部分構造の決定(雑誌論文6)、安定な活性型中間体の発見(雑誌論文2)、赤外分光法(FTIR)を用いた構造変化の解析(雑誌論文5)を行った。さらに得られた結果を基に、様々な変異体での比較解析から構造変化と忌避応答性に相関があることを見出した(雑誌論文1)。この結果は、Biochemistry誌の注目論文(Hot Article)として掲載される予定である。
2)SRI-HtrI膜蛋白質複合体を介した光情報伝達(誘因応答)
上記SRII-HtrIIを介した忌避応答機構に比べ、SRI-HtrIを介した光誘因応答に関する解析は著しく遅れている。今年度は、構造変化解析に優れたFTIR分光法を用いて、SRI-HtrI複合体の構造変化解析を行った(雑誌論文4)。また、これまで用いてきたSRIが極めて不安定であることから、古細菌、真正細菌で新たなSRI遺伝子を探索し、発現を試みたところ、真正細菌であるSalinibacter ruberから極めて安定なSRIを単離することに成功した(論文投稿中)。このように、誘因応答メカニズムについてもその分子機構を理解できる目処がたってきた。
3その他光受容体解析
イオンポンプであるバクテリオロドプシン(BR)をSRII型へ機能転換した論文(2006年Sudo and Spudich, PNAS)が注目され、機能変換を通じた機能「創出」から蛋白質由来の人工光素子構築を目指している。今年度は、クロライドポンプであるハロロドプシン(HR)からSRIIへの機能変換を試みた(雑誌論文3)。上述の通り誘因レセプターも研究対象と出来る目処がつき、これまで知られているレセプター間での機能改変を行っている。