Research Projects -
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Grant number：20117011 2008 - 2012
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area) Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
UEHARA Takashi, NISHIYA Tadashi
Grant amount：\71630000 （ Direct expense: \55100000 、 Indirect expense：\16530000 ）
We performed antibody-array screening in conjunction with biotin-switch assays to identify the novel S-nitrosylated proteins. Using this assay system, we found that phosphatase with sequence homology to tensin (PTEN) is selectively S-nitrosylated by low concentrations of NO at a specific cysteine residue. In addition, we demonstrated the mechanism of SPSB-mediated iNOS degradation and the relative contributions of different SPSB proteins to iNOS regulation.
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Grant number：19300135 2007 - 2008
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
NOMURA Yasuyuki, OKUMA Yasunobu, TAKAHASHI Ryosuke, UEHARA Takashi, KANEKO Masayuki, IZUMO Nobuo, ISUZUGAWA Kazuto
Grant amount：\19370000 （ Direct expense: \14900000 、 Indirect expense：\4470000 ）
本研究では,抗脳神経変性疾患薬創製に向けて, 細胞内小器官小胞体への変性タンパク質蓄積抑制機構に関する研究を行った. 小胞体のタンパク質分解系(ERAD)分子の生体での生理的役割, とくに脳変性疾患への関与を明らかにするとともに, ERAD 分子をターゲットとした脳変性疾患抑制薬の基盤研究を行った. また, タンパク質凝集抑制作用を有する化合物を作成し, 神経細胞死抑制作用について検討した.
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The role of nitrosylation of neurotransmitter transporterin pain-induced aversion
Grant number：19390149 2007 - 2008
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
MINAMI Masabumi, UEHARA Takashi, KATAYAMA Takahiro
Grant amount：\19500000 （ Direct expense: \15000000 、 Indirect expense：\4500000 ）
本研究では、痛みによる不安や抑うつ、嫌悪などの不快情動の生成・制御メカニズムを明らかにするため、分界条床核の役割に関して研究を進め、腹側分界条床核におけるノルアドレナリン遊離亢進とβアドレナリン受容体-アデニル酸シクラーゼ-proteinkinase A(PKA)系活性化が痛みによる不快情動生成に重要な役割を果たしていることを明らかにした。一方、ノルアドレナリントランスポーターの酸化的修飾は、その機能に影響を与えなかった。
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神経変性疾患発症における一酸化窒素による小胞体膜存在ユビキチンリガーゼの機能変化
Grant number：19044002 2007 - 2008
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究 特定領域研究
上原 孝
Grant amount：\7000000 （ Direct expense: \7000000 ）
私たちはこれまでにバイオインフォーマティックスによってヒトゲノムライブラリーから新規小胞体膜存在ユビキチンリガーゼを網羅的に単離することに成功してきた. また, 小胞体における蛋白質品質管理系にユビキチンプロテアソームが関わっていること, とくにE3リガーゼであるパーキンが小胞体膜蛋白質を基質としていることが報告されてきた. このパーキンが一酸化窒素によって酸化されることで機能が変化し, 変性基質蛋白質の蓄積をもたらすことでドパミン神経細胞死/パーキンソン病を発症する可能性を明らかにしてきた. そこで本年度は, 神経細胞内で比較的発現量の高い小胞体膜存在E3リガーゼであるHRD1の新たな基質の探索を試みた.
HRD1は酵母から哺乳類まで存在が確認されている分子であり, 小胞体膜に存在していることから小胞体関連蛋白質分解に関わることが指摘されてきた. この生理的基質に関してはAPPなどが示されてきたものの, その結合様式については不明である. そこで, より直接的な結合蛋白質を同定するためにHRD1と共免疫沈降してくる蛋白質をSDS-PAGEで分離し, MALDI-TOFMSを利用して同定を試みた. その結果, 神経変性疾患発症に関わっていることが示唆されている数種の細胞質蛋白質が単離同定された. これまでにこれらの分解機構についての報告は無く, 生理的あるいは病態生理的役割を推察する上で興味がもたれた. 現在, 細胞内局在ならびに分解機構の詳細について解析しているところである. -
Grant number：19590051 2006 - 2008
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
UEHARA Takashi
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
脳虚血時による細胞内Ca^(2+)の上昇は, 一酸化窒素(NO)合成酵素の活性化を介してNOを過剰産生し, 小胞体シャペロンであるカルレチキュリン(CRT)をS-ニトロシル(SNO)化することが示唆された.また, CRT のSNO 化によるシャペロン活性の低下は, 小胞体ストレスに対する細胞死に関連することが示唆された. 以上より, NO と小胞体ストレスの関連性に新たな見解を提示することができた.
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Possible relationship between S-nitrosylated proteins and neurodegenerative disorders
Grant number：17590050 2005 - 2006
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
UEHARA Takashi
Grant amount：\3500000 （ Direct expense: \3500000 ）
Stress proteins located in the cytosol or endoplasmic reticulum (ER) participate in maintenance of cell homeostasis and development of tolerance against severe insults. In neurodegenerative diseases, a number of chaperones can ameliorate accumulation of misfolded proteins triggered by oxidative/nitrosative stress or mutated gene products. Here we show that one such ER chaperone, protein-disulfide isomerase (PDI), is S-nitrosylated in brains manifesting sporadic Parkinson's or Alzheimer's disease. Nitric oxide-induced S-nitrosylation of PDI inhibits its enzymatic activity, leads to accumulation of polyubiquitinated proteins, and activates the unfolded protein response (UPR). S-Nitrosylation also abrogates PDI-mediated attenuation of neuronal cell death triggered by ER stress or proteasome inhibition. Thus, PDI prevents neurotoxicity associated with ER stress and protein misfolding, but nitric oxide blocks this protective effect in neurodegenerative disorders via PDI S-nitrosylation.
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小胞体に蓄積する変性蛋白質の修復/分解系を用いた神経変性疾患防御機構
Grant number：16659016 2004 - 2005
日本学術振興会 科学研究費助成事業 萌芽研究 萌芽研究
野村 靖幸, 大熊 康修, 上原 孝, 金子 雅幸
Grant amount：\3500000 （ Direct expense: \3500000 ）
1.ケミカルシャペロンとして知られている4-フェニル酪酸(4-PBA)の小胞体ストレス抑制作用について明らかにするため,小胞体ストレスに対する4-PBAの作用を検討した。その結果,4-PBAは小胞体ストレスを抑制し,それによる細胞死を抑制、した。さらに4-フェニル酪酸の作用機序を明らかにするため,in vitroにおけるシャペロン活性を検討したところ,4-PBAはin vitroにおいてタンパク質の凝集を抑制することを明らかにした。家族性パーキンソン病(AR-JP)の原因遺伝子Parkin(ユビキチンリガーゼ:E3)の基質タンパク質Pael-Rは,AR-JPにおいて小胞体に蓄積し,小胞体ストレスを引き起こす。Pael受容体に対する4-PBAの作用を検討したところ,4-PBAはPael受容体の正常な発現を促進し,Pael受容体蓄積による小胞体ストレスとそれによる細胞死を抑制した。
2.小胞体のタンパク質の分解系である小胞体関連分解(ER associated degradation:ERAD)に関与し,小胞体ストレス抑制作用を有する遺伝子の同定と機能解析を行った。RING-fingerドメインを有すること,膜蛋白質であること,小胞体に局在することを条件として,バイオインフォマティクス的解析によりERAD関連新規E3の候補を検索したところ,51の遺伝子を選出した。そのうちの8遺伝子が小胞体ストレスによって誘導された。つぎに,絞り込まれたERADに関与すると考えられる遺伝子7個をクローニングした。そのうち3遺伝子が,小胞体に局在してE3活性を有し,小胞体ストレスによる細胞死に対して保護作用を示したことから,ERADに関与する新規のE3であることが示唆された。 -
Studies on the Regulatory Mechanism of Neuronal Death: Isolation of Novel Factors and Title of Preparation of Model of Neurodegenerative Disease.
Grant number：15109002 2003 - 2006
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (S) Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
NOMURA Yasuyuki, TAKAHASHI Ryosuke, OKUMA Yasunobu, UEHARA Takashi, KANEKO Masayuki
Grant amount：\112190000 （ Direct expense: \86300000 、 Indirect expense：\25890000 ）
Protein-disulphide isomerase (PDI), which exists in endoplasmic reticulum (ER), and assists in the maturation and transport of unfolded secretory proteins. PDI has two domains that function as independent active sites with homology to the small, redox-active protein thioredoxin. We demonstrated that PDI was S-nitrosylated, a reaction transferring a nitric oxide (NO) group to a critical cysteine thiol to affect protein function. NO-induced S-nitrosylation of PDI inhibited its enzymatic activity, leads to the accumulation of polyubiquitinated proteins, and activates the unfolded protein response. Furthermore, we showed in brains manifesting sporadic Parkinson's or Alzheimer's disease, that PDI is S-nitrosylated. Thus, PDI prevents neurotoxicity associated with ER stress and protein misfolding, but NO blocks this protective effect in neurodegenerative disorders through the S-nitrosylation of PDI.
Upregulation of Parkin associated endothelin-receptor like receptor (Pael-R) in the ubiquitin-protein ligase Parkin deficient mice leads to death of dopaminergic neurons. The cell death in these animals was protected or aggaravated in upregulated or deficient mice of the ER chaperone ORP150 (150 kDa oxygen-regulated protein), respectively. We interbreed Pael-R-upregulated and Parkin knockout mice. In the mice, we observed ER-stress in the brain, selective cell death of catecholaminergic neurons in the substantia nigra and the locus ceruleus, and deficiency of mitochondria complex I. These data suggest a model in which ER-and dopamine-related stress are major contributors to decreased viability of dopaminergic neurons in a setting relevant to Parkinson's disease. -
小胞体での変性蛋白質分解に関与する分子の単離・同定と神経変性疾患防御機構
Grant number：14657574 2002 - 2003
日本学術振興会 科学研究費助成事業 萌芽研究 萌芽研究
野村 靖幸, 金子 雅幸, 上原 孝
Grant amount：\3200000 （ Direct expense: \3200000 ）
ラットに四血管閉塞/再灌流を行い,一過性前脳虚血モデルを作成して,脳虚血に伴って発現量の変化する遺伝子をディファレンシャル・ディスプレイ法を用いて単離することを試み,減少する遺伝子としてphosphatidylinositol 4-kinase (PI 4-K)の同定に成功した.PI 4-K蛋白質は海馬ニューロンに多く発現していること,また,虚血に伴って細胞死が起こるCA1領域においては,細胞死が観察される前に先んじて減少することがわかった.さらに,PI 4-Kの過剰発現は有意に低酸素による細胞死を抑制すること,PI 4-KはAktの活性化を増強・維持することがわかった.
脳虚血モデルマウスにおいて,HRD1 mRNA発現を検討したところ,HRD1 mRNAが大脳皮質および線条体において増加することが明らかとなった.さらにin vitroの系で低酸素/再酸素化を負荷するとHRD1 mRNAはグリア細胞においては発現が上昇したが,一方神経芽細胞腫Neuro2aにおいては発現に変化は認められなかった.したがって,脳虚血は小胞体機能を障害すること,HRD1は虚血による細胞死に保護的に関与することが示唆された.
小胞体に蓄積した変性タンパク質の分解系である小胞体関連分解(ER associated degradation : ERAD)に関与する遺伝子KF-1をバイオインフォマティクス的解析により,単離・同定した.KF-1は実際に小胞体に局在し,ユビキチンリガーゼ活性を有していることを示した.また,小胞体ストレス誘導されることが判明した.さらに,KF-1を哺乳類細胞に過剰発現させることによって小胞体ストレスによる神経細胞死が抑制されるか解析したところ,小胞体ストレス特異的に細胞死を抑制した. -
脳ニューロン・グリア細胞相関系のストレス応答機構に関する細胞分子生物学的研究
Grant number：13307064 2001 - 2003
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(A) 基盤研究(A)
野村 靖幸, 金子 雅幸, 上原 孝, 大熊 康修
Grant amount：\41340000 （ Direct expense: \31800000 、 Indirect expense：\9540000 ）
ラットに四血管閉塞/再灌流を行い,一過性前脳虚血モデルを作成して,脳虚血に伴って発現量の変化する遺伝子をディファレンシャル・ディスプレイ法を用いて単離することを試み,減少する遺伝子としてphosphatidylinositol 4-kinase(PI 4-K)の同定に成功した.PI 4-K蛋白質は海馬ニューロンに多く発現していること,また,虚血に伴って細胞死が起こるCA1領域においては,細胞死が観察される前に先んじて減少することがわかった.さらに,PI 4-Kの過剰発現は有意に低酸素による細胞死を抑制すること,PI 4-KはAktの活性化を増強・維持することがわかった.
低酸素ストレスや脳虚血によって誘導されるPDI結合蛋白質として小胞体膜蛋白質 ubiquilinを単離し,それがPDIの低酸素ストレスによるニューロン死抑制作用を増強することを明らかにした.さらに,ubiquilinが低酸素ストレスによる小胞体ストレスによって誘導されるアポトーシス促進転写因子CHOPの誘導を抑制したことから,PDIやubiquilin の低酸素ストレス防御作用は小胞体ストレス抑制によるもにであることが,示唆される結果を得た.
哺乳類における小胞体ストレス誘導遺伝子HRD1をバイオインフォマティクス的解析により,単離・同定した.これらの遺伝子の特徴として,小胞体に局在し,小胞体に蓄積した変性タンパク質の分解系である小胞体関連分解(ER associated degradation : ERAD)に関与する遺伝子であることが判明した.また,HRD1を哺乳類細胞に過剰発現させることによって小胞体ストレスによる細胞死が抑制されるか解析したところ,小胞体ストレス特異的に細胞死を抑制することを示した. -
脳虚血によるニューロン死惹起機構に関わる新規因子の探索・同定
Grant number：13771364 2001 - 2002
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B) 若手研究(B)
上原 孝
Grant amount：\2100000 （ Direct expense: \2100000 ）
ラットに四血管閉塞/再灌流を行い,一過性前脳虚血モデルを作成して,脳虚血に伴って発現量の変化する遺伝子をディファレンシャル・ディスプレイ法を用いて単離することを試み,減少する遺伝子としてphosphatidylinositol 4-kinase (PI 4-K)の同定に成功した.PI 4-Kの発現の変化を詳細に検討したところ,PI 4-K蛋白質は海馬ニューロンに多く発現していること,また,虚血に伴って細胞死が起こるCA1領域においては,細胞死が観察される前に先んじて減少することがわかった.さらに,ノーザンブロット解析から,PI 4-K mRNAは脳虚血1日後から有意に減少することが明かとなった.また,細胞死が起こらない海馬CA3ならびに歯状回において,PI 4-Kの変化は認められなかった.また,培養神経芽細胞腫に低酸素ストレスを負荷するとアポトーシス様の細胞死が観察されるが,その際にもPI 4-Kの著明な減少が認められた.さらに,PI 4-Kの過剰発現は有意に低酸素による細胞死を抑制したこと,キナーゼ活性を有しない優性抑制変異型PI 4-Kには細胞死抑制効果はないことから,PI 4-Kの酵素活性が重要であることが示唆された.低酸素ストレスによって細胞は死から免れるために,細胞死抑制シグナルであるAktを活性化させる.PI 4KはAktの活性化を増強・維持することがわかった.したがって,PI 4Kの脳虚血/低酸素による減少は細胞死抑制シグナルを減弱させ,その結果,ニューロン死が惹起する可能性が推定された.
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Preparation of animal model with higher brain dysfunction : studies on evaluation methods of active chemicals
Grant number：12357015 2000 - 2002
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (A) Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
NOMURA Yasuyuki, SYUTO Satoshi, MURAYAMA Toshihiko, OKUMA Yasunobu, SAITO Hiroshi, UEHARA Takashi
Grant amount：\41570000 （ Direct expense: \35600000 、 Indirect expense：\5970000 ）
Senescence-accelerated mouse prone 8 (SAMP8) shows marked impairment of learning and memory, whereas SAMP10 shows brain atrophy and aging-associated depressive behavior. Hippocampal GDNF mRNA expression in 2-month-old SAMP8 and SAMP10 strains was less than in SAMR1 specimens of the same age. The number of surviving neurons in the CA1 region decreased with age in SAMP8 and SAMP10. These findings suggest that low GDNF expression in young SAMP8 and SAMP10 may be involved in hippocampal dysfunctions, such as age-related learning impairment and neuronal death. We investigated genetic characteristic of learning and memory impairment in SAMP8 by cross-mating between SAMP8 and normal mice, JF1. Results of the incidence of learning deficit in backcross generation and quantitative trait Loci analysis (QTL) suggest that at least one major gene may involves in learning impairment of SAMP8. CV-159, dihydropyridine derivative, 1,4-dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-3,5-pryridinedicarboxylic acid methyl 6-(5-phenyl-3- pyrazolyloxyl ester that blocks the L-type calcium channel and inhibits the calmodulin-dependent pathway. We found that CV-159 protects against ischemic brain injury. This might be mediated by both blocking the L-type calcium channel and inhibiting calmodulin-dependent function. We have attempted to isolate the genes whose levels were changed in response to transient cerebral ischemia. We found that hippocampal expression of phosphatididylinositol 4-kinase (PI4-K) was decreaed after the brain ischemia, and demonstrated the protective role of PI4-K on ischemia-induced neuronal death. Application of a brief period of ischemia has been known to produce ischemic tolerance. We found that the phosphorylation of CREB in the penumbra region was more rapidly enhanced in the preconditioned rats. The result suggests that the immediate enhancement in the phosphorylation of CREB in penumbra region prevented the spread of infarction in the preconditioned animal.
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ニューロン・グリアにおける脳虚血ストレス応答の細胞内機構
Grant number：11771418 1999 - 2000
日本学術振興会 科学研究費助成事業 奨励研究(A) 奨励研究(A)
上原 孝
Grant amount：\2100000 （ Direct expense: \2100000 ）
ヒト由来株化ニューロンモデル細胞SH-SY5Yに一酸化窒素(NO)を負荷すると,クロマチンの凝縮,DNA断片化,低DNA含量細胞や細胞膜上へのフォスファチジルセリンの露出を伴うアポトーシス様の死が起こることをこれまでに報告している.そこで,今年度はその詳細なアポトーシス実行過程を明らかにする目的で研究を行い,以下の知見を得た.
NOはミトコンドリアからのチトクロームcの漏出を惹起し,それに続いてカスパーゼ-2,-3,-6,-7,および-9の活性化を引き起こした.また,カスパーゼ-3の基質蛋白質であり,DNA断片化に関与するDNaseであるCADに結合して活性を制御しているinhibitor of CAD(ICAD)の分解もNOによって起こることが分かった.カスパーゼ-3阻害ペプチドを処理すると,カスパーゼ-2,および-7の切断が抑制されたことから,カスパーゼ-3はカスパーゼ-2および-7の上流で働いていることが示唆された.一方,NOは時間依存的にミトコンドリア内膜の膜電位を低下させることが明かとなった.内膜において,透過性を調節する複合体に作用するシクロスポリンAおよびbongkrekic acidはNOによるミトコンドリア膜電位の低下を有意に抑制し,さらにチトクロムCの細胞質への漏出とそれに続くDNAの断片化も抑制した.
以上のことから,NOはミトコンドリアに作用し,その膜電位を低下させることでアポトーシス実行因子であるチトクロムCを細胞質に放出させ,カスパーゼおよびDNaseを活性化して,アポトーシスを惹起している可能性が示唆された. -
Mechanisms of cellular and intracellular functions in brain-immune qnetwork.
Grant number：10307055 1998 - 2000
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (A). Grant-in-Aid for Scientific Research (A).
NOMURA Yasuyuki, MURAYAMA Toshihiko, UEHARA Takashi, OKUMA Yasunobu
Grant amount：\37200000 （ Direct expense: \37200000 ）
We investigated the mechanisms of 1) ischemia-induced neuronal cell death and 2) acquisition of tolerance against ischemic stress in glial cells. Hypoxia, an ischemic stress, induced neuronal apoptosis via cytochrome c release from mitochondria and following caspase activation. On the other hand, this stress up-regulated some stress proteins such as a 70 kDa heat-shock protein (HSP70) and a 78 kDa glucose-regulated protein (GRP78). In addition, we found that HSP70 induction was sensitive to SB203580, suggesting that p38 MAP kinase was positively involved in this expression. We further attempted to identify a stress protein that was enhanced or induced by hypoxia or brain ischemia in glial cells. We isolated protein-disulfide isomerase (PDI) as a candidate protein and this protein certainly induced in glial cells of ischemic brain. Overexpression of PDI in vitro and in vivo resulted in attenuation of the loss of cell viability in neuroblastoma SK-N-MC cells and a reduction in the number of DNA-fragmented cells in the CA1 subfield of the hippocampus in brain ischemic rats, respectively. Thus, up-regulated PDI may play a critical role in resistance to ichemic damage.
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Development of model animals and cells for neuronal disease
Grant number：09357019 1997 - 1999
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (A) Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
NOMURA Yasuyuki, SHUTO Satoshi, MURAYAMA Toshihiko, OKUMA Yasunobu, HATTORI Masao, UEHARA Takashi
Grant amount：\35300000 （ Direct expense: \35300000 ）
The senescence accelerated mouse (SAM) is known as a murine model of aging. SAM consists of senescence accelerated-prone mouse (SAMP) and senescence accelerated-resistant mouse (SAMR). Previously, we reported that SAMP8 and SAMP10 exhibit age-related learning impairments . In this study, we investigated the changes in emotional behavior and in neurotansmitter receptor in SAMP10, and the effect of onion extract on learning ability in Morris's water maze test.
1) SAMP10 at 8 months showed an increases of immobility in a forced swimming test compared with SAMR1. Treatment with desipramine (25 mg/kg, I.p., 3 days) in SAMP10 caused a decrease in immobility.
2) In the cortex from SAMP1O, [ィイD13ィエD1H]quinpirol binding to D2/D3 dopamine receptors increased significantly. In the hippocampus from SAMP10, [ィイD13ィエD1H]hydroxy DPAT binding to 5-HTィイD11AィエD1 receptors increased.
3) In Morris's water maze task, in a control strain of SAMR1 at 8 months, the escape latency and path length decreased with increasing trial days, in contrast, the escape latency and path length did not change in SAMP8. Treatment with onion extract (5 ml/kg, p.o., 2 months) in SAMP8 improved the learning and memory in the task.
4) In the control rats pretreated with the vehicle, transient forebrain ischemia-induced delayed neuronal death in the hippocampal CA 1 region was observed 7 days after reperfusion. Pretreatment with glial cell line-derived neurotrophic factor (1 μg), which was directly microinjected into the right hippocampal CA1 region, gave significant protection against the neuronal death. CV-159 (a dihydropyridine derivative) that blocks the L-type CaィイD12+ィエD1 channel and inhibits the calmodulin-dependent pathway. CV-159 gave protection against delayed neuronal death in the CA1 region after 15-min transient forebrain ischemia. -
脂肪細胞分化を誘導するインスリンの細胞内情報伝達系の解析
Grant number：09771961 1997 - 1998
日本学術振興会 科学研究費助成事業 奨励研究(A) 奨励研究(A)
上原 孝
Grant amount：\1900000 （ Direct expense: \1900000 ）
3T3-L1線維芽細胞はインスリン・デキサメサゾン・IBMXの同時添加によって白色脂肪細胞へと分化することが報告されているものの,細胞分化を誘導する情報伝達系については不明な点が多く残されている.前年度までに私たちはSwissマウス由来3T3-L1細胞の脂肪細胞への分化が,3量体GTP結合蛋白質の機能を消失させる百日咳毒素(PTX)の前処理によって抑制されることを見い出した.さらには,phosphatidylinositol 3-kinase(PI3-キナーゼ)の特異的阻害薬であるwortmanninの前処理によっても本細胞の分化が抑制されることを明らかにした.この事実から,PTXとwortmanninは細胞分化を誘導する情報伝達系を解析する上で,有用なプローブである可能性が示唆された,そこで,脂肪細胞分化へのkey factorであるインスリンの情報伝達系を解析したところ,PTX、wortmanninは共にインスリン刺激によるRasの活性化とそれに続くMAPキナーゼ系のそれを抑制した.この時,インスリンと同様に受容体チロシンキナーゼを活性化させるepidermal growth factor(EGF)刺激に伴うRasおよびMAPキナーゼ系の活性化に対しては無効であった.また,インスリン(あるいはIGF-1)受容体自己チロシンリン酸化反応、基質蛋白質(IRS-1)のチロシンリン酸化とPI3-キナーゼとの結合に対しては影響を及ぼさなかったものの,PTXはインスリン刺激に伴うPI3-キナーゼ活性を50%抑制した.このことから,インスリンのPI3-キナーゼ活性化機構には異なる2つの経路が存在し,1つは受容体キナーゼ→IRS-1→PI3-キナーゼ,他方は受容体→PTX感受性蛋白質,おそらく3量体G蛋白質→PI3-キナーゼを介するものであることが示唆された。したがって、PTXはインスリンによるPI3-キナーゼ活性を抑制することで,その下流に存在するカスケードを抑制する結果,脂肪細胞への分化を抑制していることが推定された.
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マウス3T3-L1細胞の分化におけるインスリンの情報伝達系の解析
Grant number：08772073 1996
日本学術振興会 科学研究費助成事業 奨励研究(A) 奨励研究(A)
上原 孝
Grant amount：\1000000 （ Direct expense: \1000000 ）
3T3-L1線維芽細胞はインスリン・デキサメサゾン・IBMXの同時添加によって白色脂肪細胞へと分化することが報告されているものの、細胞分化を誘導する情報伝達系については不明な点が多く残されている。私たちは3T3-L1細胞の脂肪細胞への分化が3量体GTP結合蛋白質の機能を消失させる百日咳毒素(PTX)の前処理によって抑制されることを見い出した。さらには、インスリンによって活性化されるphosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-キナーゼ)の特異的阻害薬であるwortmanninの前処理によっても脂肪細胞への分化が抑制されることを明らかにしてきた。このことから、PTXとwortmaninは細胞分化を誘導する情報伝達系を解析する上で、有用なプローブであることが予想された。そこで、脂肪細胞分化へのkey factorであるインスリンの情報伝達系を調べた。PTX、wortmanminは共にインスリン刺激に伴うRasの活性化とMAPキナーゼ活性やMAPキナーゼの活性化に必須なチロシン残基のリン酸化を抑制した。この時、インスリンと同様に受容体チロシンキナーゼを活性化させるepidermal growth factor(EGF)刺激に伴うRasおよびMAPキナーゼの活性化に対しては抑制作用を示さなかった。受容体自己チロシンリン酸化反応、基質蛋白質(IRS-1)のチロシンリン酸化とPI 3-キナーゼとの結合に対しては影響を及ぼさなかった。しかしながら、PTXはインスリン刺激に伴うPI 3-キナーゼ活性を50%抑制した。このことから、インスリンのPI 3-キナーゼ活性化機構には異なる2つの経路が存在し、1つは受容体キナーゼ→IRS-1→PI 3-キナーゼ、他方は受容体→PTX感受性蛋白質、おそらく3量体G蛋白質→PI 3-キナーゼを介するものであることが示唆された。したがって、PTXはインスリンによるPI 3-キナーゼ活性を抑制することで、その下流に存在するカスケードを抑制する結果、脂肪細胞への分化を抑制していることが推定された。
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Establishment and estimation of pharmacological bioassay system for therapeutic drugs of aging in central nervous system.
Grant number：07557148 1995 - 1996
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (A) Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
NOMURA Yasuyuki, NAMBA Tsuneo, UEHARA Takashi, MURAYAMA Toshihiko, TOKUMITSU Yukiko, MATSUDA Akira
Grant amount：\14700000 （ Direct expense: \14700000 ）
To clarify the physiological roles of muscarinic acetylcholine (mACh) receptor subtypes, M1 and M2, on learning and memory, we examined the effects of three antagonists, atropine (non-selective), pirenzepine (M1 selective) and 11-[[2[(diethylamino)methyl]-1-piperidinyl]acetyl]-5,11-dihydro-6H-pyrido[2,3-b][1,4]benzodiazepine-6-one, AF-DX 116 (M2 selective), on stpe-through passive avoidance tasks in mice. Pre-training (5min before) administration of atropine (1-40 nmol) and pirenzepine (10 and 40 nmol) shortened the response latency in retention tests at 14 d after acquisition training. Pre-test (5min befor) and post-training (immediately after the acquisition) administration of atropine slightly but not significantly impaired retention scores. The administration of AF-DX 116 did not apparently affect the scores in any of tests. Thus, the M1 receptor subtype coupling systemes seem to be more important in the acquisition-consolidation process rather than in the retrieval process.
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マウス3T3-L1細胞の分化におけるインスリンの情報伝達系の解析
Grant number：07772147 1995
日本学術振興会 科学研究費助成事業 奨励研究(A) 奨励研究(A)
上原 孝
Grant amount：\1000000 （ Direct expense: \1000000 ）
3T3-L1線維芽細胞はインスリン・デキサメサゾン・IBMXの同時添加によって白色脂肪細胞へと分化する。しかしながら、細胞分化を誘導する情報伝達系については不明である、そこで、3T3-L1細胞の分化にはインスリンがkey roleを担っていることから、インスリンの情報伝達系を解析することで、脂肪細胞分化の誘導機構を調べた。インスリンをコンフルエントの3T3-L1線維芽細胞に添加すると、インスリン受容体チロシンキナーゼの自己リン酸化が速やかに起こった。さらに、細胞の増殖や分化に関与していると考えられている低分子量G蛋白質のRasとRasの下流に存在するmitogen-activated protein kinase(MAPキナーゼ)の活性化が起こった。また、インスリンによる糖取り込み作用に関与していることが示唆されているphosphatidylinositol 3-kinase(PI3-キナーゼ)も活性化することが分かった。一方、PI3-キナーゼの特異的阻害薬であるwortmanninは3T3-L1線維芽細胞の脂肪細胞への分化を濃度依存的に抑制することが分かった。さらには、wortmanninはインスリン刺激に伴うRasの活性化とMAPキナーゼ活性やMAPキナーゼの活性化に必須なチロシン残基のリン酸化を抑制した。この時、インスリンと同様に受容体チロシンキナーゼを活性化させるepidermal growth factor(EGF)刺激に伴うRasおよびMAPキナーゼの活性化に対してwortmanninは抑制作用を示さなかった。このことから、3T3-L1細胞においてインスリンとEGFの情報伝達系は異なっており、脂肪細胞分化を引き起こすインスリンの情報伝達系はPI3-キナーゼ→Ras→MAPキナーゼというカスケードを経ていることが推定された。