Research Projects -
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腫瘍間質リモデリングによる新規転移抑制治療の開発
Grant number：24K02644 2024.04 - 2029.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
長塚 仁, 中野 敬介, 河合 穂高, 志茂 剛, 高畠 清文, 伊原木 聰一郎
Grant amount：\18590000 （ Direct expense: \14300000 、 Indirect expense：\4290000 ）
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骨髄由来間葉系幹細胞を起点とした新たな口腔癌転移メカニズムの解明
Grant number：24K13130 2024.04 - 2028.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
河合 穂高, 中野 敬介, 大野 充昭, 長塚 仁, 高畠 清文
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
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Runx2を軸とする細胞競合を用いた口腔癌の進展制御
Grant number：24K13088 2024.04 - 2028.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
中野 敬介, 河合 穂高, 長塚 仁, 高畠 清文, 伊原木 聰一郎
Grant amount：\4810000 （ Direct expense: \3700000 、 Indirect expense：\1110000 ）
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Selective induction of bone and cartilage differentiation and reconstruction of the mandibular condyle using miRNA and TCP hybrid biomaterials
Grant number：23K09080 2023.04 - 2027.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
伏見 滋子, 中野 敬介, 河合 穂高, 助川 信太郎, 長塚 仁, 高畠 清文
Grant amount：\4810000 （ Direct expense: \3700000 、 Indirect expense：\1110000 ）
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Development of a novel treatment for ameloblastoma by modifying tumor stroma based on CCN2
Grant number：23K09332 2023.04 - 2026.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
藤井 昌江, 高畠 清文, 長塚 仁, 中野 敬介, 河合 穂高
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
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癌の骨破壊病変に対するHedgehogシグナルの分子基盤の構築と新たな治療戦略
Grant number：22H03293 2022.04 - 2026.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
志茂 剛, 吉田 祥子, 堀江 尚弘, 奥井 達雄, 建部 廣明, 平木 大地, 谷村 明彦, 長塚 仁, 細矢 明宏, 高畠 清文
Grant amount：\17290000 （ Direct expense: \13300000 、 Indirect expense：\3990000 ）
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口腔癌間質が主導する実質進展制御メカニズム解明と新規治療法開発
Grant number：22K10170 2022.04 - 2025.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
高畠 清文, 長塚 仁, 中野 敬介, 辻極 秀次, 河合 穂高
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
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骨吸収因子に着目したエナメル上皮腫治療の新戦略
Grant number：22K10227 2022.04 - 2025.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
松村 達志, 高畠 清文
Grant amount：\3900000 （ Direct expense: \3000000 、 Indirect expense：\900000 ）
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細胞競合による癌の生物学的性格および癌化の制御
Grant number：21K10043 2021.04 - 2025.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
中野 敬介, 河合 穂高, 志茂 剛, 長塚 仁, 辻極 秀次, 高畠 清文
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
2021年は腫瘍の生物学的な特性と関連因子の発現を確認するために、移植腫瘍を用いた組織学的な検討をおこなった。臨床的に内向型の発育様式を示す口腔扁平上皮癌は上皮下結合組織へ浸潤増殖していくが、口腔扁平上皮癌の亜型の疣贅癌は体表外へ向かって外向性に増殖し、結合組織への浸潤性に乏しい。通常型の口腔扁平上皮癌（高浸潤型癌）、およびその亜型である疣贅癌（低浸潤型癌）について、これら性格の異なる２つの癌の間質細胞を互いに入れ替えてマウスに移植した。その結果、低浸潤型癌の間質細胞は、高浸潤型癌を低浸潤型に変化させ、高浸潤型癌の間質は低浸潤型癌を高浸潤癌に変化させた。移植癌組織を組織学的に検討し、低浸潤型癌組織では、間質細胞にYAP, Notch をはじめとして、細胞競合で勝者に発現する細胞競合勝者因子が強く発現し、高浸潤型癌組織では、癌細胞に細胞競合勝者因子が強く発現していることを確認した。癌の間質は従属的組織として癌の制御下におかれているのではなく、細胞競合の働きによって癌細胞へ働きかけて癌細胞の性格そのものを変化させている可能性示唆する結果を得られた。また癌細胞と間質細胞を共培養し、癌と間質細胞の相互作用を検討できる実験モデルの作製を行った。
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軟骨・骨組織誘導性ハイブリッド生体材料開発による新規関節軟骨再建法の構築
2021 - 2022
国立研究開発法人日本医療研究開発機構 AMED橋渡し研究戦略的推進プログラム
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口腔扁平上皮癌における新規遠隔転移抑制治療の開発
Grant number：20H03888 2020.04 - 2025.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
長塚 仁, 山近 英樹, 中野 敬介, 河合 穂高, 江口 傑徳, 辻極 秀次, 高畠 清文
Grant amount：\17030000 （ Direct expense: \13100000 、 Indirect expense：\3930000 ）
本年度は、リンパ節における転移niche形成の検討を行うために、GFP骨髄移植を行なったマウスにヒト好転移ヒト扁平上皮癌細胞株を頬粘膜に移植して、リンパ節転移モデルの作成を行なった。腫瘍組織は、通報に従い標本を作成し、免疫組織化学染色、蛍光免疫二重染色、蛍光免疫多重染色を行い検討を行なった。
●蛍光免疫多重染色(Opal 7 color manual IHC)による目的細胞の組織内での局在の検討
転移に関与するBMDCのプロファイルがある程度特定されれば、次に蛍光免疫多重染色(Opal 7 color manual IHC)を用いることにより、目的BMDCの組織での局在を明らかとする。Opal 7 color manual IHCは、同一切片内で最大７色までの多重染色を行うことが可能な染色手法で、FACSで得られた情報をそのまま切片内に再現することが可能である。これにより、組織内での目的BMDCの局在や動態の詳細を継時的に観察した。 -
エナメル上皮腫の生物学的性格制御による腫瘍実質ー間質相互作用破綻の誘導
Grant number：20K10094 2020.04 - 2024.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
藤井 昌江, 長塚 仁, 中野 敬介, 高畠 清文, 河合 穂高
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
エナメル上皮腫は若年層に発症し、顎骨切除術を行うと著しくQOLが低下する。現在では顎骨保存外科的療法(開窓術)が適応されることが多い。しかし、開窓術においても、複数回の手術が必要であり、再発率も高いため、全く新しい視点からアプローチする新規治療法の確立が望まれている。申請者らはこれまでに歯原性腫瘍の腫瘍実質と腫瘍間質の相互作用に着目した研究を行ってきた。その結果、腫瘍間質には未分化で骨芽細胞に分化しうる細胞 が存在することを発見している。この未分化な細胞に対して腫瘍実質が産生する因子が分化抑制を行い、細胞浸潤や骨吸収に影響を与える研究成果を得ている。 さらに、開窓術の科学的根拠の検索のために、エナメル上皮腫における開窓術前後の組織学的変化を検討してきた。その結果、開窓術によりエナメル上皮腫が正常口腔粘膜上皮と連続することで、腫瘍実質が抑制的に制御されるとの研究成果を得ている。 そこで本申請課題では、正常粘膜上皮との連続による腫瘍実質の生物学的性格の変化を利用し、腫瘍実質と腫瘍間質の相互作用機構を破綻させ、外科的手法を 用いないエナメル上皮腫の新規治療法の開発に向けた基礎的研究を行う。 2021年度は、樹立したエナメル上皮腫間質細胞とエナメル上皮腫腫瘍細胞（AM-1)の共培養実験を行い、エナメル上皮腫の腫瘍微小環境を再現した。具体的には、エナメル上皮腫間質細胞とAM-1をシャーレ上(2D共培養)とコラーゲンゲル上(3D共培養)で培養し、腫瘍微小環境を再現した。
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miRNAが支配する骨・軟骨分化方向決定メカニズムの解明
Grant number：20K10178 2020.04 - 2023.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
伏見 滋子, 中野 敬介, 河合 穂高, 長塚 仁, 辻極 秀次, 高畠 清文
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
申請者らはすでにウサギ組織内にBMPとハニカムTCPで作成した特殊な環境下において骨組織と軟骨組織をシームレスに連続した状態で誘導することに成功している（シームレス骨・軟骨分化誘導モデル）。令和3年度はマウスを用いたシームレスな骨・軟骨モデルの作製を行い良好な再現性を実現できることを確認している。マウスを使用して、安定的にシームレス骨・軟骨分化誘導モデルを作製することが可能となった。これまでに明らかになっているウサギの実験条件を流用しマウス組織内にも同様な骨・軟骨シームレス組織が形成されることを確認した。ハニカムCTPは孔径の異なる種類を用い、濃度の異なるBMP-2を含侵させ同所性および異所性に結合組織内へ埋入し、骨・軟骨誘導をおこなった。今回の研究で使用しているスカフォールドの形態が細胞分化に影響を及ぼし特定の細胞分化に関連する遺伝子発現を誘導することを見出した。これらの結果は学術誌上で報告した。
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軟骨・骨組織誘導性ハイブリッド生体材料開発による新規関節軟骨再建法の構築
2020 - 2021
国立研究開発法人日本医療研究開発機構 AMED橋渡し研究戦略的推進プログラム
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軟骨・骨組織誘導バイブリッド生体材料による新規関節軟骨再建法開発
2020 - 2021
公益財団法人 ウエスコ学術振興財団
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軟骨・骨組織誘導性ハイブリッド生体材料開発による新規関節軟骨再建法構築と臨床応用
Grant number：19K19159 2019.04 - 2022.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究 若手研究
高畠 清文
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
現在までに申請者らは、骨組織誘導能、生体親和性に優れているリン酸三カルシウム(TCP)に直線的貫通孔をハニカム状に配列させたハニカムTCPを開発し、その直線的貫通孔の孔径を変化させることにより、骨組織と軟骨組織を特異的に誘導することに成功している。そこで本申請課題では、既存関節軟骨相当部に軟骨組織、骨組織相当部に骨組織を同時に、かつシームレスに組織が連続した状態で誘導可能な新規生体材料を開発することを目的とし、基礎的研究を行なっている。
2019年度は、ウサギ膝関節において骨形成、軟骨形成を誘導する最適なハニカムTCPの孔径と成長因子(BMP-2)の最適濃度の選定を行った。その結果、ウサギ膝関節に孔径300μmのハニカムTCPにBMP-2 80μg/mlを含浸させた試料において旺盛な骨形成を認めた。しかし、軟骨組織誘導についてはウサギ膝関節においてごくわずかに誘導されるのみの結果を得ている。 -
口腔癌分泌エクソソームを用いた分子標的抗癌剤感受性試験の開発
Grant number：19K10288 2019.04 - 2022.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
村上 純, 長塚 仁, 河合 穂高, 高畠 清文
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
近年、癌細胞が分泌するエクソソーム顆粒が、癌の転移に重要な役割を果たすことが報告 された。癌細胞から分泌されたエクソソームは、様々な癌関連マイクロRNA等を内包し、細 胞間の情報伝達に関与する。また、エクソソームは血液等の体液にも含まれ、低侵襲な体液 診断の切り札として、大きな注目を浴びつつある。2018年、申請者らは口腔癌においてエク ソソームが分子標的抗癌剤動態へ関与する可能性を報告している。
当該研究の目的は、口腔癌が分泌するエクソソームによるセツキシマブ動態への影響を明ら かにし、エクソソームを利用した簡便かつ低侵襲性の体液診断型分子標的抗癌剤セツキシマブ感受性予測法を開発することである。
本年は、ヒト口腔扁平上皮癌細胞株(HSC4、3、2、SAS、Hep2、Ca9-22株)培養上清からPureExo® エクソソーム単離キット(コスモ・バイオ株式会社)にてエクソソームを回収する。マイクロRNA回収にはExoMirTMエキソソームRNA抽出キット(コスモ・バイオ株式会社)を用い、 DNA Chip法(3D-Gene®、東レ株式会社)を用いて口腔癌細胞株特異的マイクロRNAの存在 を網羅的に検討した。 -
軟骨・骨組織誘導性ハイブリッド生体材料開発による新規関節軟骨再建法の構築
2019
公益財団法人 山陽放送学術文化財団
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Analysis of mechanism of regulation of CTGF/CCN2 by RUNX2 in tooth formation
Grant number：18K09743 2018.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
MORITANI NORIFUMI
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
Analysis of teeth extract from subjects with cleidocranial dysplasia and normal subjects revealed changes in protein localization of RUNX family transcription factor 2 (RUNX2) and connective tissue growth factor (CTGF/CCN2). Positive correlations were evident between RUNX2 and CTGF/CCN2 gene expression promotion and suppression in Saos-2 cells. Several RUNX2 protein candidate regions were identified that altered CTGF/CCN2 expression in Cos-7 cells. The findings indicate that the structure of RUNX2 protein changes depending on the mutation site of the RUNX2 gene, and that the CTGF/CCN2 expression changes accordingly. These changes result in an altered phenotype of cleidocranial dysplasia involved in tooth eruption.
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The study of the regulatory mechanisms of cancer bone destruction metabolism and immunity in Hedgehog signaling
Grant number：18H02999 2018.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
SHIMO Tsuyoshi
Grant amount：\17160000 （ Direct expense: \13200000 、 Indirect expense：\3960000 ）
Hedgehog downstream signaling molecules deployed from a comprehensive pathway analysis in the cancer bone destruction microenvironment (Shimo et al. PlosOne 2016) are associated with prognosis in gingival cancer patients with Stage IV jaw bone invasion (Yoshida, Shimo et al. Diagnostics (Basel) 2021).
In addition, tumor vascular endothelial cells in patients with Stage II introverted tongue cancer showed significantly enhanced expression of Hedgehog signaling and a positive correlation with tumor-associated macrophage (TAM) accumulation (Takabatake, Shimo et al. Int J Mol Sci 2019). We also analyzed the histological and genetical effect of Gli-1 and Gli-2 dual inhibitor on the in vitro study and in vivo cancer bone destruction mouse model.