共同研究・競争的資金等の研究 - 畑生 俊光
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古代マヤ文明の基層形成と発展におけるヒトの移動に関するバイオアーキオロジーの研究
研究課題/領域番号：24H00102 2024年04月 - 2028年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(A)
鈴木 真太郎, 山下 勝行, 畑生 俊光, 飯塚 義之
配分額：46540000円 （ 直接経費：35800000円 、 間接経費：10740000円 ）
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消化管共生ネットワークを基盤とする草食性希少野生鳥類の新規保全モダリティの構築
研究課題/領域番号：23K26932 2023年04月 - 2026年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
松林 誠, 牛田 一成, 土田 さやか, 倉持 幸司, 畑生 俊光, 芝原 友幸, 笹井 和美
配分額：17030000円 （ 直接経費：13100000円 、 間接経費：3930000円 ）
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5-ALA産生乳酸菌の作製とその家畜用ワクチンプラットホームとしての可能性
研究課題/領域番号：23K23763 2022年04月 - 2026年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
畑生 俊光, 荒川 健佑
配分額：17550000円 （ 直接経費：13500000円 、 間接経費：4050000円 ）
本研究年度は、①有用乳酸菌株の選択および②5-ALA産生乳酸菌の作製を目標に研究を行った。このうち、①について約20日齢の白色レグホーン種幼雛および約500日齢のロードアイランドレッド種成鶏雌腸管より乳酸菌の分離を試みた。腸管内容物は滅菌生理食塩水で段階希釈後、シクロヘキシミドを添加した各種寒天培地にて塗抹培養した。培養は嫌気的に40℃で48時間行った。幼雛腸管内の生菌数は6.23-9.36 log CFU/gで、大腸を除いて下部にいくほど菌数が多かった（十二指腸＜空腸＜大腸＜回腸＜盲腸だった）。一方、成鶏腸管の生菌数は部位ごとの差は幼雛ほど大きくなく、8.23-9.24 log CFU/gであった。分離培地ごとの生菌数の差はそれほど見られず、明確な傾向はなかった。次に、なるべく形態の異なるコロニーを釣菌・継代培養したところ、実験①からは培養可能な幼雛および成鶏腸管由来の233および418菌株がそれぞれ得られた。そして、培養液pH < 5.0となった230および389菌株を乳酸菌の候補として選抜した。②については、プラスミド選択および遺伝子導入用乳酸菌の検討にとどまった。
一方、免疫賦活効果の高いアシドフィルス乳酸菌と5-ALAの同時給与による抗コクシジウム効果の検討を行った。その結果、アシドフィルス乳酸菌単独投与時で対照群と比較して約60％のオーシスト排出抑制効果がみられたが、5-ALAをアシドフィルス菌と同時給与することにより約80％のオーシスト排出抑制効果が認められた。 -
トリパノソーマ感染宿主細胞におけるオートファジーとアポトーシス制御解析
研究課題/領域番号：24590502 2012年04月 - 2016年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
嶋田 淳子, 畑生 俊光
配分額：5460000円 （ 直接経費：4200000円 、 間接経費：1260000円 ）
細胞内寄生原虫Trypanosoma cruziは宿主のオートファジー機構で排除されない。原虫感染により、オートファジーの初期過程が活性化され、LC3の局在変化、隔離膜形成が起こることが明らかとなった。しかし、オートリソソーム形成はみられず、成熟したオートファゴソームが形成されないと考えられた。LC3-Atg3までは進行するが、LC3の脂質化のステップが阻害されていることが示唆された。
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重症マラリア病態形成機構に関わる因子の同定と宿主-寄生体相互作用の解析
研究課題/領域番号：23790457 2011年 - 2012年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B)
畑生 俊光, 嶋田 淳子, 雨宮 健司, 宮本 裕斗, 宮下 大地
配分額：4420000円 （ 直接経費：3400000円 、 間接経費：1020000円 ）
1)データベース検索から 4 種類の SR リガンド候補蛋白質を同定し、組み換え蛋白質の作製を試みた結果、2 種類を除いて組み換え蛋白質の作製に成功し、現在生理活性等の確認中である。2)ネズミマラリア感染による遺伝子発現解析の結果、脾臓辺縁帯マクロファージ(Mo)や肝臓血管内皮細胞で MARCO の発現上昇が認められた。また、感染致死群ではM2a Moの誘導が推察されたが、感染回復群では、M2c-like Moに変化していることが推察された。
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トリパノソーマ感染宿主細胞における酸化ストレス応答とアポトーシス制御解析
研究課題/領域番号：21590461 2009年 - 2011年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
嶋田 淳子, 畑生 俊光
配分額：4680000円 （ 直接経費：3600000円 、 間接経費：1080000円 ）
Trypanosoma cruzi感染宿主細胞では活性酸素種の産生が起こり、中でも活性窒素(NO)産生および活性窒素合成酵素(iNOS)の発現上昇が明らかとなった。活性酸素種阻害剤を添加すると、原虫感染細胞におけるアポトーシス抑制が解除されたことから、本アポトーシス抑制にNOなどの活性酸素種が関与していることが明らかになった。また、感染により宿主アポトーシス抑制因子c-FLIPにニトロソ化反応が起きることがわかった。
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マラリア原虫による宿主免疫修飾機構の解析
研究課題/領域番号：21022009 2009年 - 2010年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究
畑生 俊光
配分額：7600000円 （ 直接経費：7600000円 ）
重症熱帯熱マラリアの病態形成機構は、マラリア原虫感染赤血球(pRBC)の宿主細胞への細胞接着が重要な現象と考えられ、未知因子の存在が推測されている。我々は、生体における老化赤血球などの排除機構に着目し、その排除に関わるスカベンジャーレセプター(SR)に着目した。SRsの重症マラリア病態形成機構への関与を検討する目的で、SRs強制発現細胞株を作製しpRBCとの接着を観察した。また、Plasmodium berghei ANKA(PbANKA)感染マウスモデルを用い、PbANKA感染前後の脳、肺、肝臓、脾臓、心臓における9種類のSRs(SR-A、NARCO、SRCL、CD36、CD68、SREC-I、SR-PSOX、FEEL-I、CD163)のmRNA発現について検討した。pRBCとSRsの接着を検討するために、SR-A、MARCO、SR-PSOX、CD68、SRCL、SREC-Iそれぞれについて強制発現細胞株を作製した。細胞接着試験の結果、SR-A、MARCO、SR-PSOX、SRCLおよびSREC-IについてはpRBCとの接着が観察されたが、CD68は観察されなかった。PbANKA感染マウスモデルの観察結果から、CD36、CD163、SR-PSOX、SREC-1、について感染前後の発現臓器毎の違いは認められなかったが、MARCOは、感染7日後に肝臓、脾臓、肺でmRNA発現増強が観察された。SR-Aは、感染前の肝臓で強く発現が観察されたが、感染7日後には全臓器で発現が増強した。FEEL-Iは感染前の発現は認められなかったが、感染3日後より全臓器での発現が観察された。本研究の結果から、貪食細胞表面に発現が報告されているSR-AおよびMARCOは、これらの臓器においてマラリア原虫感染により発現誘導されるpRBCの接着・貪食因子である可能性が推測された。一方、CD36やSR-PSOXは、血管内皮細胞やマクロファージに発現することが報告されているが、pRBC感染前後で発現臓器等に差が認められなかったことから、血管内皮細胞ではpRBC接着因子として、貪食細胞ではpRBC貪食因子として機能し、発現部位で機能が異なる可能性が推測された。
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研究課題/領域番号：20790322 2008年 - 2009年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B)
畑生 俊光
配分額：4420000円 （ 直接経費：3400000円 、 間接経費：1020000円 ）
重症マラリアの合併症として重要な貧血に関わると推察される宿主因子であるスカベンジャーレセプターについて、class Aに属する3種類を標的に強制発現細胞の作成を行った。本研究年度についてはScavenger receptor-AおよびMARCOについて強制発現細胞の作製ならびに分子内変異株の作製を行った。その結果、MARCOもSR-A同様熱帯熱マラリア原虫感染赤血球との接着を認めた。また、分子内変異株の作製とそれに対するマラリア原虫感染赤血球との接着試験結果より、SR-AとMARCOでは類似の分子構造にもかかわらず分子内の接着部位が異なることが明らかとなった。以上のことから、class Aスカベンジャーレセプターは、マラリア原虫感染赤血球に対する宿主側の受容体として機能することが推察でき、重ねて重症マラリアにおける貧血との関連が強く推察できた。
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アジア諸国を起源として分布する薬剤耐性マラリアの遺伝疫学研究
研究課題/領域番号：19406013 2007年 - 2009年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
狩野 繁之, 三田村 俊秀, 畑生 俊光, 石上 盛敏, 田邉 和裄, 河津 信一郎, 中澤 秀介, トンゴル-リベラ ピラリタ, ルーアリスワン ソンチャイ, クルドゥスッドゥ スリヴィッチャ, 高 元圭, ソチェット ドゥオン, 三田村 俊秀
配分額：17030000円 （ 直接経費：13100000円 、 間接経費：3930000円 ）
熱帯熱マラリア原虫の集団遺伝学解析では、フィリピンの流行度と遺伝的多様度の間に正の相関が観察された。ベトナムのクロロキン耐性株の起源は、タイ-ミャンマー国境付近の同耐性株の拡散によらず、ベトナム原虫集団からの耐性変異株の発生と推察された。三日熱マラリア原虫のmtDNA配列による分子系統解析では、韓国の原虫集団の起源は中国南部の2つの原虫集団にあった。集団遺伝学的解析は、マラリア疫学の有用なツールである。
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宿主アポトーシス抑制因子を利用したトリパノソーマの生き残り戦略の分子機構
研究課題/領域番号：18590398 2006年 - 2007年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
嶋田 淳子, 畑生 俊光
配分額：3990000円 （ 直接経費：3600000円 、 間接経費：390000円 ）
Trypanosoma cruzi感染細胞ではFasを介するアポトーシスが抑制され、宿主抑制因子c-FLIPの発現が上昇することを明らかにしてきた。c-FLIPタンパク質はユビキチン-プロテアソーム系により分解されることが知られているが、がん細胞などでは分子内のシステイン残基がニトロソ化されることによりユビキチン化が起こらず、細胞内に蓄積されることが報告されている。そこで、原虫感染細胞においてc-FLIPのニトロソ化が起きるかどうか調べた。ヒト由来培養細胞にT. cruziを感染させ2〜4日培養し、ライセートを調整した。抗c-FLIP抗体により免疫沈降し、上清および沈殿画分について抗ニトロソシステイン抗体でイムノブロットを行った。非感染細胞では沈殿画分にc-FLIPが検出されたがニトロソ化されているものはほとんど認められなかった。一方、感染細胞では沈殿および上清画分にc-FLIPが認められ、上清画分では抗ニトロソシステイン抗体に反応するバンドが検出された。以上より、感染細胞のc-FLIPはニトロソ化が起こっている可能性が示唆された。感染細胞におけるプロテアソーム活性を測定したところ、非感染細胞のKm値は56μM、 Vmax値は0.22 RFU min-1 μg-1に対し、感染細胞ではKm値は50μM、 Vmax値は1.67 RFU min-1 μg-1であり、Vmax値が感染細胞で高いことが示された。この理由の1つとしては、原虫のプロテアソーム活性も同時に測定されたためと考えられた。以上より、感染細胞でもc-FLIPのユビキチン化は起こり、プロテアソーム活性は非感染細胞よりもむしろ高く、おそらく正常に働いていることが示唆された。c-FLIPがニトロソ化されたことから、原虫感染により活性酸素種の生成が起きている可能性が示された。
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マラリア重症化における膜結合型ケモカインの機能的役割に関する研究
研究課題/領域番号：18790290 2006年 - 2007年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B)
畑生 俊光
配分額：3400000円 （ 直接経費：3400000円 ）
(1)研究計画より、次年度以降に検討するスカベンジャーレセプター(SR)をピックアップした。具体的には9 classに分類されるSRのうちclass Aに類されるもの3種類およびclass Fに類されるもの1種類をターゲットとする。これら4種類のうち研究計画を前倒ししてSR-AIについて発現細胞を作成し、マラリア原虫感染赤血球との接着を検討した。その結果、SR-AI発現細胞に対してマラリア原虫感染赤血球の接着が確認され、この接着は抗SR-AI抗体によって阻害されることが判明した。一方でアネキシンVでは阻害されなかった。その他については、現在蛋白発現細胞を作成している。
(2)ヤウスモデルを使用した感染実験を計画していた。遺伝子一過性発現マウスの作成は行わなかった。一方、感染モデルでは感染経過と赤血球表面への感染経過に伴うホスファチジルセリン発現動態の検討を行った。その結果、原虫寄生率の上昇に平行してホスファチジルセリン陽性赤血球率も上昇した。しかしながら、ホスファチジルセリン陽性赤血球率は最高値約20%(寄生率最高値約40%)であった。その後寄生率の減少及び感染の終息に伴いホスファチジルセリン陽性赤血球率も漸減した。すなわち感染の推移とホスファチジルセリン陽性赤血球率の動態はほぼ一致した。
SR-PSOXについては遺伝子破壊マウスの国内作成が確認されたことから、当該マウスの導入と感染実験を今後予定している。 -
アジア諸国に拡散する薬剤耐性マラリアのゲノム疫学研究
研究課題/領域番号：16406012 2004年 - 2006年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
狩野 繁之, 河津 信一郎, 畑生 俊光
配分額：13300000円 （ 直接経費：13300000円 ）
1.リアルタイムPCR法を用いたマラリア原虫ゲノム解析システムの構築
(1)熱帯熱マラリア原虫(Pf)のクロロキン(CQ)耐性関連遺伝子pfcrt上の単塩基置換の定量的検出を試みた結果、サンプル中に混在する感受性型(FCR-3株)と耐性型(K1株)遺伝子の混合比に一致した定量値を、リアルタイムPCRの測定値から推定することができた。しかし、FCR-3株:K1株を8:2の比率で混合した場合では、in vitroではCQ感受性を示し、fcrt遺伝子のDirect SequenceではK1型が検出された。
(2)FCR-3株とK1株を混合して低CQ濃度(〜80nM)下で培養すると、混合時のK1株の比率が低くても、やがてK1株が優勢になった。
本成果は、定量リアルタイムPCR法の有用性を示し、薬剤耐性原虫の選択のメカニズムをin vitroの系で再現したといえる。
2.海外調査研究で得られた分子疫学的知見
(1)フィリピン・パラワン島のPf13検体の内6検体で、pfcrt耐性型と感受性型の両型の遺伝子が検出された。感受性型:耐性型の遺伝子量の比率(%)は8.7:91.3から44.5:55.5であった。患者血液中には、複数の原虫クローンが混合寄生していることが証明できた。また、タイ・ミャンマー国境での39分離株は、すべてK76Tの耐性型変異を有す一方、ベトナム南部の株では、CQ感受性型(K76)の頻度が69%と多く、CQ耐性型(K76T)の頻度が26%と少ない点が特徴的であった。
(2)ベトナム株のPfCRTの72-76番目のアミノ酸配列を調べると、CVMNK(感受性型)が最も多かった。一方CQ耐性型では、CVIET、CVIDT、CVMDTの3種類が観察された。CVIETはタイK1株と同じであった。
(3)ところが、pfcrt遺伝子近傍のマイクロサテライト(MS)DNAマーカー-3座位の解析を行ったところ、CVIETを示すベトナム株のMS DNAパターンは、タイK1株のそれとは異なっていた。本研究結果は、アジアの耐性株の起源はタイをその発祥として拡散していったという定説を一部覆すもので、原虫genotypeの疫学研究成果として新しい知見である。今後その証拠を固める新たな研究が必要である。 -
マラリア重症化に係わる新規病原因子の探求
研究課題/領域番号：16790242 2004年 - 2005年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B)
畑生 俊光
配分額：3600000円 （ 直接経費：3600000円 ）
本研究年度は、膜結合型ケモカインの一つフラクタルカイン(FKN)に対して熱帯熱マラリア原虫感染赤血球が接着する際に利用する、新規熱帯熱マラリア原虫感染赤血球表面発現蛋白質の同定を試みた。研究方法は、(1)FKN接着熱帯熱マラリア原虫株を確立し、当該原虫株よりcDNAライブラリーを作製し、浮遊細胞株Jurkat株へ遺伝子導入する。その後、作製したcDNA導入細胞株と培養プレート表面にコーティングした組み換えFKN蛋白質(rFKN)との直接接着を観察することで、目的蛋白質をクローニングする。(2)yeast two-hybrid(Y2H)法を利用した蛋白質スクリーニングを行う、の2通りで行った。(1)について、FKN接着株を確立した後、当該原虫株よりcDNAライブラリーを作製した。作製したcDNAライブラリーを2種類の哺乳動物細胞発現ベクターに組み込んだマラリア原虫cDNAライブラリー強制発現ベクターを確立した。これらベクターをFKN受容体の発現がないことを確認した浮遊細胞株Jurkatにリポフェクション法およびエレクトロポレーション法にて遺伝子導入した。当該発現ベクターにはC末端側にGFP遺伝子を組み込んでおり、導入遺伝子産物はGFPとの融合蛋白質として発現される。そこで、導入遺伝子産物の発現はFACScanにて確認した。薬剤選抜後、rFKNとの接着を確認したが、当該細胞株とrFKNとの接着は確認できなかった。現在もスクリーニング継続中である。(2)について、Y2Hにてマラリア原虫cDNAライブラリー産物およびFKNとの相互作用を検討した結果、5個の候補蛋白質が同定された。これらの内、2個の蛋白質は接着関連蛋白質のホモローグであり、3個は未知の蛋白質であることがデータベースとの照合の結果明らかとなった。
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細胞内寄生性原虫の病態形成・重症化機構の解析
1999年
Grants and Funding
資金種別：競争的資金
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細胞内寄生性原虫の病態形成・重症化機構の解析
1999年
補助金
資金種別：競争的資金