Research Projects -
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光合成ベシクルを用いた光エネルギー変換の統合的理解
2024.10
JST 創発研究
Authorship：Principal investigator
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Structural dynamics of anoxyogenic photosynthetic reaction centre - light-harvesting antenna protein supercomplexes
Grant number：24K21948 2024.06 - 2026.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
菅 倫寛
Grant amount：\6500000 （ Direct expense: \5000000 、 Indirect expense：\1500000 ）
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Molecular basis and substrate selectivity of toxic metalloid channels and transporters
Grant number：23H02450 2023.04 - 2026.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
菅 倫寛, 三谷 奈見季
Grant amount：\18720000 （ Direct expense: \14400000 、 Indirect expense：\4320000 ）
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Grant number：22H04916 2022.04 - 2027.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Specially Promoted Research Grant-in-Aid for Specially Promoted Research
沈 建仁, 庄司 光男, 秋田 総理, 菅 倫寛, 山口 兆
Grant amount：\627640000 （ Direct expense: \482800000 、 Indirect expense：\144840000 ）
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Ultrafast structural dynamics of light-harvesting complex I and the photosynthetic reaction center supercomplex
Grant number：22H04754 2022.04 - 2024.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area) Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
菅 倫寛
Grant amount：\11180000 （ Direct expense: \8600000 、 Indirect expense：\2580000 ）
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Grant number：21H05034 2021.07 - 2026.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
馬 建鋒
Authorship：Coinvestigator(s)
Grant amount：\189280000 （ Direct expense: \145600000 、 Indirect expense：\43680000 ）
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Structural analysis of the oxygen evolving center of photosystem II to gain insights into the water splitting reaction
Grant number：20H03226 2020.04 - 2023.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
菅 倫寛, 中島 芳樹
Grant amount：\17810000 （ Direct expense: \13700000 、 Indirect expense：\4110000 ）
光合成での水分解・酸素発生反応は光化学系II（PSII）内部のMn4CaO5クラスターが酸化状態を5段階（S0状態からS4状態へ）に順次変化させて触媒する。このうち，中間体S2状態は電磁性共鳴法により区別されるスピン状態の異なる2つの平衡状態があることが知られているが，構造解析されたのはスピン状態がS=1/2のもののみであり，スピン状態がS=5/2のものは解析されていない。そこで本研究ではPSIIのS=5/2のS2状態を調製して構造解析することを目指している。令和3年度は中間体状態が得ることを目的として，溶液のpHをアルカリ状態にしたものを調製して固定ターゲット法を用いて回折実験を行い，構造解析を進めた。光をあててS状態遷移させたもの、光を当てる前の状態のものなど複数の状態について調製してデータを収集した。解析の結果，溶液状態がアルカリ状態に変化したことに伴う立体構造の変化を確認することができた。また，時間分解シリアルフェムト秒構造解析を行ってS=1/2のものを室温で構造解析した。解析の結果，これまで凍結状態で確認されていたS=1/2状態での構造変化を確認したほか、新たに基質の水分子を取り込むためのチャネルと思われている水素結合のネットワークに変化が見られた。これは構造変化したところが水チャネルであることを示す証拠となるものである。この内容は論文にまとめIUCrJに発表した。
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Ultrafast structural dynamics of light-harvesting complex I and the photosynthetic reaction center supercomplex
Grant number：20H05446 2020.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area) Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
菅 倫寛
Grant amount：\10400000 （ Direct expense: \8000000 、 Indirect expense：\2400000 ）
光合成細菌の光合成反応中心（RC）は集光アンテナ複合体I（LH1）と超複合体をとっており、光エネルギーを高い効率で吸収して、電子伝達鎖を駆動し酸素非発生型の光合成の初発の反応を開始する。本研究ではLH1-RC超複合体を対象としX線自由電子レーザーを用いて時間分解シリアルフェムト秒結晶構造解析して励起後の構造解析を明らかにすることを目指し、LH1-RC超複合体の良質な微小結晶を作成することを第一の目標としている。
2020年度は時間分解シリアルフェムト秒結晶構造解析に向けた、LH1-RC超複合体の良質な微小結晶を作成する条件を探索した。これまでの研究で1.9-A分解能の大型結晶が得らえているので、この条件の再現性の向上と結晶の小型化を進めた。結晶の品質の再現性は学内のX線源装置と放射光を用いてスクリーニングした。回折分解能は凍結条件の影響を受けやすいことがわかっていたので、沈殿剤の種類と濃度、溶液を交換する方法を検討した。その結果、2-A分解能で回折する結晶を2割程度の頻度で得ることができた。得られた結晶は空間群C2、結晶格子はa=145-A, b=144-A, c=208-A, beta=90.82 deg でこれまでに1.9-A分解能で解析した結晶と同じ空間群であるが、結晶格子は僅かに短くなっていた。シリアルフェムト秒結晶構造解析に向け、結晶のサイズを小さくするために研究代表者らの研究室で取り扱っている光化学系IIの微小結晶作成と同様の方法を試したが、均一なサイズの結晶は得られなかった。 -
量子ビームが拓く光合成膜タンパク質のマルチモーダル構造解析
2018.10 - 2022.03
JST さきがけ研究
菅倫寛
Authorship：Principal investigator
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光合成膜タンパク質のフェムト秒時間分解能での構造ダイナミクス
Grant number：17H05884 2017.04 - 2019.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area) Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
菅 倫寛
Grant amount：\13000000 （ Direct expense: \10000000 、 Indirect expense：\3000000 ）
光化学系IIは光駆動の水分子の分解反応とそれに伴う分子状酸素の発生を行う，分子量70万にもおよぶ巨大な膜タンパク質複合体である。本研究では光化学系IIを中心とする巨大な光合成膜タンパク質複合体を対象として、光による励起後の構造変化をフェムト秒時間分解能で明らかにすることを目指している。研究代表者らはとくに光化学系IIの水分解・酸素発生の反応機構における原子基盤を明らかにすることを目的としてX線自由電子レーザーを用いた構造解析を行ってきた。これまでに反応開始状態に相当するS1状態および反応中間体に相当するS3状態を構造解析することに成功したので、この研究基盤を用いて光励起後の時間経過に伴う構造変化を捉えることを試みている。H30年度は結晶サンプルの調製方法を改良し大型化することで比較的簡便に結晶サンプルを供給する方法を確立することをめざした。なお、結晶化されたサンプルの観察およびその品質を迅速に評価する方法が必要であることを実感したので、新たに結晶観察装置などを購入した。最終的に，4点の多点測定が可能な量の結晶サンプルが供給できるようになったが，この方法で調製した結晶サンプルは分解能および同型性ともに従来の方法と比べて良くないことが判明している。従って，サンプルの供給方法は継続して改善する必要がある。研究課題は最終年度ではあるが，これからも根気強く精製スケールの大型化と回折データの改善を行って詳細な構造解析を完結させ、反応機構の詳細を明らかにして論文発表したい。さらに本研究課題で開発された構造解析手法を今後は他の光合成膜タンパク質にもこの手法を適用して構造解析を行うことを予定している。本年度は他の光合成膜タンパク質の一つであるFCPタンパク質の精製，結晶化，構造解析に成功したのでこれを論文発表した。
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Integrated analysis of mineral transport system in crops
Grant number：16H06296 2016.04 - 2021.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Specially Promoted Research Grant-in-Aid for Specially Promoted Research
Ma Jian Feng
Grant amount：\536250000 （ Direct expense: \412500000 、 Indirect expense：\123750000 ）
We have identified more than 30 transporter genes related to uptake, translocation and distribution of mineral elements including essential, beneficial and toxic elements mainly in rice and buckwheat. We further revealed the mechanisms for response of these transporters to environmental changes, regulation of transporters and their roles in plant growth and productivity by using different approaches. For the first time, we succeeded to crystalize the silicon transporter Lsi1 and revealed its crystal structure. We also constructed a mathematical model for mineral element transport at whole plant scales. These achievements have been published in many international top journals including Nature.
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Structural analysis for photosystem II in the intermediate Si-state by using X-ray free electron laser pulses
Grant number：16H06162 2016.04 - 2019.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Young Scientists (A) Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
Suga Michihiro, Shen Jian-Ren
Grant amount：\24570000 （ Direct expense: \18900000 、 Indirect expense：\5670000 ）
Photosystem II (PSII) catalyzes photo-oxidation of water into dioxygen through an S-state cycle of the oxygen evolving complex (OEC). The structure of PSII has been analyzed at resolutions higher than 2.0A by using X-ray as well as XFEL. The mechanism of O=O bond formation, however, remains obscure owing to the lack of intermediate-state structures determined at atomic resolution. We prepared PSII in the S3 state by providing two-flash illumination into micro-sized crystals at room temperature and determined the structure at 2.35A resolution by using an XFEL. An isomorphous difference Fourier map between the two-flash-illuminated and dark-adapted states revealed apparent structural changes. Among them, the insertion of a new oxygen atom O6 close to the putative substrate oxo-bridge O5 was observed. We proposed the mechanism of O=O bond formation between O5 and O6. The findings provide a structural basis for the mechanism of oxygen evolution.
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時分割シリアルフェムト秒構造解析法の開発と光化学系II複合体への適用
Grant number：15H01642 2015.04 - 2017.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area) Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
菅 倫寛
Grant amount：\5980000 （ Direct expense: \4600000 、 Indirect expense：\1380000 ）
光化学系IIは光駆動の水分子の酸化と酸素分子の発生を担う、分子量70万の巨大な膜タンパク質複合体である。この水分解・酸素発生の反応機構における原子基盤を明らかにすることは、生物の基本現象を明らかにするのみでなく、エネルギー問題や環境問題を解決する可能性があり、人工光合成研究にも大きく貢献することが期待される。
初年度より光化学系IIの水分解の反応の解明をめざし、反応中間体状態を解析可能なX線自由電子レーザーをもちいたシリアルフェムト秒結晶学の開発と光化学系IIのサンプルの条件検討を行ってきた。本年度はサンプルかの回折分解能を大幅に改善する事に成功した。その結果、X線自由電子レーザー施設SACLAを用いて、サイズが100um程度の非凍結の小さな結晶に対し室温にて閃光を二発照射してS3状態へと励起させた回折データを収集して、2.35A分解能で構造解析した。構造解析の結果、S1状態からS3状態への遷移にともない、Mn原子の動きと周辺の配位子の構造変化がみられた。さらにMnクラスターからの水分子を含む水素結合ネットワークが分断されるとともに、酸素発生する触媒部分に新たな水分子に相当する電子密度の挿入が確認された。これにより酸素が発生する直前の構造を明らかにし、この新たな水分子が基質となる反応機構を提唱した。またMnクラスターだけでなく、電子授与体側においても構造変化を確認した。これらの成果は論文発表した。 -
Radiation damage free structure of photosystem II revealed by X-ray free electron laser.
Grant number：26840023 2014.04 - 2016.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Young Scientists (B) Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Suga Michi
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
The initial reaction of photosynthesis takes place in photosystem II (PSII), a 700 kDa membrane protein complex that catalyzes water-splitting reaction through an S-state cycle of the oxygen evolving complex (OEC). The structure of PSII has been solved by XRD at 1.9 A resolution, which revealed that the OEC is a Mn4CaO5 cluster. However, the manganese atoms in the OEC are easily reduced by X-ray irradiation.
Recently, it was demonstrated that radiation damage free structure can be obtainable using X-ray free electron lasers (XFEL). We determined a radiation damage free structure of PSII in the S1 state at a resolution of 1.95 A using XFEL pulses. Compared with the structure from XRD, the OEC in the XFEL structure has Mn-Mn distances that are shorter by 0.1-0.2A. Based on the XFEL structure, the valences of each manganese atom were assigned as Mn1(+3), Mn2(+4), Mn3(+4) and Mn4(+3) in the S1 state. These findings provide a structural basis for the mechanism of oxygen evolution. -
Elucidation of the mechanism of water-splitting in photosystem II
Grant number：24000018 2012 - 2017
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Specially Promoted Research
SHEN Jian-Ren, NOGUCHI Takumi, YAMAGUCHI Kizashi, SHOJI Mitsuo, SUGA Michihiro, AKITA Fusamichi, MINO Hiroyuki, KATO Yuki, ISOBE Hiroshi
Grant amount：\519350000 （ Direct expense: \399500000 、 Indirect expense：\119850000 ）
In order to elucidate the reaction mechanism of water-splitting performed by photosystem II (PSII) in photosynthesis, we used femtosecond X-ray free electron laser (XFEL) to analyze the radiation damage-free, high-resolution crystal structure of PSII, which revealed the Mn_4CaO_5-cluster structure in its native state. We further used XFEL to analyze the structure of one of the intermediate state, S_3-state, which identified the site of O=O bond formation. Based on these structures, theoretical calculations were performed, which identified possible reaction pathways for the water-splitting. Furthermore, spectroscopic analysis, especially Fourier-transformed infrared spectroscopic analysis, was performed, which elucidated the structural changes of amino acid residues surrounding the Mn_4CaO_5-cluster and identified hydrogen-bond pathways that may participate in the proton exit from the water-splitting reaction site.
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生体超分子チトクロム酸化酵素のプロトンポンプ機構と酸化還元機構の解明
Grant number：08J06358 2008 - 2009
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for JSPS Fellows Grant-in-Aid for JSPS Fellows
菅 倫寛
Grant amount：\1200000 （ Direct expense: \1200000 ）
チトクロム酸化酵素活性中心には完全酸化型状態において電子密度が存在することがわかっており、この電子密度をめぐっては20年以上も論争が続いている。この電子密度の決定は酸化還元機構を議論する上でも特に重要である。研究代表者らは昨年度にこの電子密度がハーオキサイドであることを発表したが、それに対し多くの反響と反論を得た。そこで本年度、研究代表者らは新たに回折実験を計画した。この実験はX線による異常分散効果を利用して、パーオキサイドに対する反論の矛盾点を指摘するものであった。実験には精度良い回折実験が必要であったが、これを様々な工夫により克服した。得られた結果はパーオキサイド説に対する反論を完全に否定するものであった。また研究代表者は前年度に得た1.4A分解能のX線回折データを用いて高分解能の構造解析を進めた。前年度から実施してきた、精度の高いFcを求めることを目的とした構造精密化を導入することで、原子モデルの結晶学的freeRを0.20から0.15に改善させた。この結晶系ではチトクロム酸化酵素は単量体の状態でパッキングしていたため、これまで得られていた二量体の構造と比較を行った。この比較から脂質がチトクロム酸化酵素の単量体と二量体の構造変化を制御していて、脂質分子が膜蛋白質の機能において特別な役割を果たすという、新しいモデルを提案することができた。さらに研究代表者は構造精密化後の座標中のカルボン酸の炭素原子-酸素原子間の距離からプロトン化状態を判別する方法を検討した。実験誤差をまったく含まないテストデータを用意し、このデータに対して構造精密化を行ってプロトン化状態の再現性を調べた。その結果、freeRが0.10を切る精度の高いFcのもとでは1.7A分解能でもプロトン化状態の判別が可能であることを示した。