Research Projects -
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新規細胞分裂必須分子を標的とする革新的抗マラリア薬の開発
2025.04 - 2026.03
国立研究開発法人 日本医療研究開発機構 「橋渡し研究戦略的推進プログラム」シーズA
山田浩司、高島英造、内橋貴之、澤田隆介
Authorship：Principal investigator
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熱帯熱マラリア原虫の細胞分裂を司る膜狭窄・分裂機構の解明と新規創薬ターゲットの創生
2025.01 - 2027.12
シオノギ感染症研究振興財団 基礎基盤研究助成金
山田浩司、高島英造、内橋貴之、澤田隆介
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\30000000 （ Direct expense: \30000000 ）
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慢性腎臓病克服をめざす糸球体ポドサイトのマルチスケール解析
2024.06
岡山県 電源所在県科学技術振興事業
山田浩司, 竹居孝二, 田邊克幸, 米澤朋子
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\7498150 （ Direct expense: \6816500 、 Indirect expense：\681650 ）
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腎臓糸球体ポドサイトの血液濾過機能におけるダイナミン関連タンパクによるアクチン制御の役割
2024
愛媛大学プロテオサイエンスセンター 共同利用・共同研究拠点「プロテオインタラクトーム解析共同研究拠点(PRiME)」
山田浩司、高島英造
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\250000 （ Direct expense: \250000 ）
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ダイナミン超複合体による新規の細胞骨格リアレンジメント機構
Grant number：23H02477 2023.04 - 2026.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
竹居孝二、山田浩司
Authorship：Coinvestigator(s) Grant type：Competitive
Grant amount：\3000000 （ Direct expense: \3000000 ）
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マラリア原虫細胞分裂機構をターゲットとする新規創薬基盤の創生
2023
国立研究開発法人 日本医療研究開発機構 新興･再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業
山田浩司、高島英造、内橋貴之、成田哲博、高野光則
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\39000000 （ Direct expense: \30000000 、 Indirect expense：\9000000 ）
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In vitro解析からひもとくダイナミンによる細胞骨格制御機構とその破綻による病態生理の解析
2023
愛媛大学プロテオインターラクトーム解析共同研究拠点共同研究
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\250000 （ Direct expense: \250000 ）
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The role of dynamin in actin dynamics in cancer cell migration and metastasis
Grant number：22K06580 2022.04 - 2025.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
Tadashi Abe, Hiroshi Yamada
Authorship：Coinvestigator(s) Grant type：Competitive
Grant amount：\800000 （ Direct expense: \800000 ）
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細胞骨格ダイナミクスに基づく分子輸送制御システムの解明と革新的癌創薬への新展開
Grant number：19H01064 2022.04 - 2024.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(A)
渡部 昌実, 黄 鵬, 那須 保友, 定平 卓也, 竹田 哲也, 竹居 孝二, 野口 洋文, 山田 浩司, 落合 和彦
Grant type：Competitive
Grant amount：\1400000 （ Direct expense: \1400000 ）
各種癌細胞を入手すると同時に、より普遍性の高い研究を遂行する為、独自のマウス間葉系幹細胞を樹立した。各種癌細胞において、細胞骨格因子が関わる細胞内分子輸送システムに重要と考えられるタンパク質群の発現を網羅的に解析した。特に、REIC/Dkk-3、SGTA、Tctex-1、Dyneinモーター、Dynaminおよびその他の細胞骨格（制御）因子に着目して、それら関連分子を含め発現を解析した。一部のタンパク質においてはその発現を認めず、免疫組織学的な解析を行うべく準備を進めた。これまでの男性ホルモンレセプターの核内移行に基づく実験系に加え、糖質コルチコイドレセプターの核内移行に基づく表現型解析系を立ち上げた。また癌創薬の観点から複数のDynamin阻害薬に関する検討を行い、in vivo投与での作用機序解明に係る動物実験での解析系の立ち上げを行った。
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細胞骨格及び接着安定化分子を標的とする糸球体ポドサイト保護剤の開発
2022.04 - 2024.03
国立研究開発法人 日本医療研究開発機構 「橋渡し研究戦略的推進プログラム」シーズA
山田浩司, 竹居孝二
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\5000000 （ Direct expense: \5000000 ）
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細胞骨格及び接着安定化分子を標的とする糸球体ポドサイト保護剤の開発
2022
国立研究開発法人 日本医療研究開発機構 「橋渡し研究戦略的推進プログラム」シーズA
山田浩司, 竹居孝二
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\2000000 （ Direct expense: \2000000 ）
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In vitro解析からひもとくダイナミンによる細胞骨格制御機構とその破綻による病態生理の解析
2022
愛媛大学プロテオインターラクトーム解析共同研究拠点共同研究
山田 浩司、高島 英造
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\250000 （ Direct expense: \250000 ）
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細胞膜とアクチン細胞骨格を繋ぐダイナミンの生理機能の解明
2021.04 - 2022.03
愛媛大学 愛媛大学プロテオサイエンスセンター共同研究
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
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ポドサイトが形成する血液濾過装置を支える新規アクチンリモデリング機構の解明
Grant number：20K08591 2020.04 - 2023.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
山田 浩司, 竹居 孝二, 淺沼 克彦
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
腎臓糸球体ポドサイトに発現しているダイナミン1及びダイナミン2の細胞内機能を調べることを目的とした。本年度は、ダイナミン２のアクチン制御機構について、in vitro解析を中心に行なった。ダイナミン２はCharcot-Marie-Tooth病(CMT)の原因遺伝子の一つであることが知られている。ヒトでは9つの変異が知られている。その一つであるK562Eが細胞内のストレスファイバーとアクチン線維束形成を異常にすることを見出している(Yamada et al., Neurosci. lett., 2016)。この現象を、in vitroで解析するために、ダイナミン２野生型とK562Eをコムギ無細胞タンパク合成系を用いて調製した。最初に、ダイナミン２K562Eの性状を調べた。変異体は、膜との結合と、膜結合に依存するGTPase活性が顕著に低下していた。低イオン強度緩衝液中での自己重合性のGTPase活性は、野生型のそれに比較して、30%低下していた。また、アクチン線維とダイナミン野生型またはK562Eを混合し、その形態を電子顕微鏡にて観察した。変異体は、野生型同様にアクチン線維を束化した。このアクチン線維を精査した。高速原子間力顕微鏡観察から、ダイナミンが螺旋状に重合しているリムの部分にアクチン線維が結合していることがわかった。ダイナミンにより形成されたアクチン線維束と細胞膜を模倣したリポソームとの結合を調べた。ダイナミン変異体により形成されたアクチン線維束はリポソームにほとんど結合しなかった。従って、変異体は、細胞内でアクチン線維を束化するものの細胞膜と結合できないために、ストレスファイバー形成不全がおこると考えられる。本研究は、Frontiers in Cell and Developmental Biologyに2022年5月10日に掲載された。
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ダイナミンをターゲットとする抗グリオーマ分子標的薬の開発
2020.04 - 2022.03
国立研究開発法人 日本医療研究開発機構 「橋渡し研究戦略的推進プログラム」シーズA
竹居孝二、山田浩司、道上宏之、佐藤あやの
Authorship：Coinvestigator(s)
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ダイナミンによる細胞骨格制御機構とその破綻に関わる病態解明
2020.04 - 2021.03
愛媛大学 愛媛大学プロテオサイエンスセンター共同研究
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
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エンドサイトーシス関連分子のアクチン細胞骨格と膜制御の機能連関
2020.04 - 2021.03
神戸大学 神戸大学バイオシグナル総合研究センター共同利用研究
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
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エンドサイトーシス関連分子のアクチン細胞骨格と膜制御の機能連関
2019.07 - 2020.03
神戸大学 神戸大学バイオシグナル総合研究センター共同利用研究
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
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Elucidation of the function of novel actin-binding factors in neutrophil phagocytosis and extracellular trap formation
Grant number：19K07084 2019.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
ABE TADASHI
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
Neutrophils play an essential role in the destruction of bacteria in innate immune system. In the process of killing pathogens, neutrophils drastically change their cell shape with accompanying the rearrangement of actin cytoskeleton. We found that expressing dynamin 2 K562E mutant, one of the pathogenic mutations in Charcot-Marie-Tooth disease in cells leads to aberrant actin clusters and stress fibers. The effect of this mutant on actin fibers was analyzed in vitro. Recombinant dynamin 2 K562E showed lower self-assembly ability and membrane binding ability than that of dynamin 2 wildtype. Although dynamin K562E directly bundled actin filaments, the formed bundles showed much less ability to bind to the lipid membranes as compared to dynamin 2 wildtype. In conclusion, dynamin 2-mediated interactions between actin and membranes are critical for actin bundle formation in neutrophil functions.
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Cooperative regulation of cytoskeleton and membrane dynamics by novel mechanism of dynamin
Grant number：19H03225 2019.04 - 2022.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Takei Kohji
Grant amount：\17290000 （ Direct expense: \13300000 、 Indirect expense：\3990000 ）
We found that Charcot-Marie-Tooth disease-associated mutations of dynamin 2 cause aberrant stress fibers, showing that dynamin is required for the formation and stabilization of stress fibers. And we reconstituted in vitro the actin bundle formation by dynamin. We also found that dynamin 1 bundles microtubules, and showed that this bundling is necessary for the primary processes formation and stabilization of cell morphology of renal glomerular podocytes. The microtubule-binding site of dynamin 1 was identified. Furthermore, regarding the regulation of membrane dynamics, we demonstrated that dynamin 2 and BIN1, a BAR protein, cooperatively function in T-tubule formation and stabilization of skeletal muscle cells.
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ダイナミンによる細胞骨格制御機構とその破綻に関わる病態解明
2019.04 - 2020.03
愛媛大学 愛媛大学プロテオサイエンスセンター共同研究
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
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Genome-wide expression of P. falciparum membrane proteins
Grant number：18K19455 2018.06 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory) Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Takashima Eizo
Grant amount：\6240000 （ Direct expense: \4800000 、 Indirect expense：\1440000 ）
Membrane associated plasmodial proteins are usually difficult to predict using the present algorithms, and are not well expressed by under conventional wheat germ cell-free protein expression system (WGCFS) conditions. In this study, we aimed at expressing P. falciparum genes using WGCFS-liposome method for membrane protein production. As a result, we succeeded to express P. falciparum proteins which are not well expressed by usual conditions of WGCFS. Moreover, liposome encapsulated WGCFS successfully expressed some membrane proteins and the recombinant proteins were localized to the liposomal membrane. Based on these results, we conclude that WGCFS-liposome is a useful tool for the expression of membrane proteins and will facilitate production and functional analyses of P. falciparum membrane proteins.
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ダイナミンによる細胞骨格制御機構とその破綻に関わる病態解明
2018.04 - 2019.03
愛媛大学 愛媛大学プロテオサイエンスセンター共同研究
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
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熱帯熱マラリア原虫ダイナミンホモログによる膜制御機構
2018.04 - 2019.03
神戸大学 神戸大学バイオシグナル総合研究センター共同利用研究
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
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Analysis of membrane deforming proteins in Malaria parasite
Grant number：17K08808 2017.04 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Yamada Hiroshi
Grant amount：\4810000 （ Direct expense: \3700000 、 Indirect expense：\1110000 ）
Malaria parasite live with erythrocyte and form parasitophorous vacuole (PV) around the parasite. And the parasite develops membrane trafficking system to get nutrients and transport many proteins. In this study, we tried to examine whether or not malarial proteins could participate in these membrane remodeling. We found that the candidate protein directly bound to liposomes and deformed them. The activity of membrane deformation by the protein was altered in the presence of GTP. We are now investigating the detailed mechanism of membrane deformation by the protein using electron microscopy and high speed atomic force microscopy.
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熱帯熱マラリア原虫ダイナミンホモログによる膜制御機構
2017.04 - 2018.03
神戸大学 神戸大学バイオシグナル総合研究センター共同利用研究
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
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熱帯熱マラリア原虫ダイナミンホモログによる膜制御機構
2016.07 - 2017.03
神戸大学 神戸大学バイオシグナル総合研究センター共同利用研究
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
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Grant number：16K10756 2016.04 - 2019.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
ABE TADASHI
Grant amount：\4810000 （ Direct expense: \3700000 、 Indirect expense：\1110000 ）
For treatment of malignant glioma, highly invasive glioma cells become obstacle to surgical removal of primary tumor. To suppress the high invasive activity of glioma cells, we identified the novel anti-invasive drug, a fluvoxamine, by drug repositioning of anti-depressant. Screening for more potent anti-invasive drugs using fluvoxamine as a lead compound are currently in progress. Furthermore, we found that actin-bundling by dynamin-cortactin complex is required for glioma cell invation. Cortactin is phosphorylated by cyclin dependent kinase 5 (CDK5), and its phosphorylation negatively regulates glioma cell invasion.
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Development of antimalarial drugs targeting the membrane trafficking
Grant number：26670201 2014.04 - 2017.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
YAMADA Hiroshi, TAKEI Kohji
Grant amount：\3640000 （ Direct expense: \2800000 、 Indirect expense：\840000 ）
Malaria parasites live in erythrocyte by forming parasitophorous vacuole (PV) around the parasite, and by developing membrane trafficking system. In this study, we tried to examine whether or not malarial proteins could participate in these membrane remodeling. By microscopy, the candidate protein self-assembled under the low ionic strength conditions. Furthermore, the candidate protein deformed liposomes. The activity of membrane deformation by the protein was altered in the presence of GTP but not GTP gamma S, a non-hydrolyzable GTP analogue. We are now investigating the detail mechanism of membrane deformation by the protein using electron microscopy.
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The role of endocytosis in oateoarhthritis
Grant number：26670665 2014.04 - 2016.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
HIROHATA Satoshi, YAMADA Hiroshi, OHTSUKI Takashi
Grant amount：\3640000 （ Direct expense: \2800000 、 Indirect expense：\840000 ）
The regulation of ADAMTS5 is crucial for osteoarthritis. However, little is known for its mechanism. We hypothesized that endocytosis may be involved in ADAMTS5 regulation. First, we found that endocytosis occurred in OUMS-27. We next examined endocytosis-related molecule, LRP-1 and RAP. The mRNA level of receptor-associated protein (RAP), antagonist of LRP-1, was not changed by IL-1 beta stimulation. It is interesting that the small-sized bands were found by Western blotting using anti-LRP-1 antibody after IL-1 beta stimulation. This is considered to be a short LRP-1 and the shedding of LRP-1 may be occurred by IL-1 beta stimulation.
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Multi-functionality of dynamin family and mechanism of integrated control
Grant number：23370089 2011.04 - 2014.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
TAKEI Kohji, YAMADA Hiroshi, TANEBE Kenji
Grant amount：\18980000 （ Direct expense: \14600000 、 Indirect expense：\4380000 ）
We have clarified a novel regulatory mechanism of actin dynamics by dynamin/cortactin complex. The complex is ring-shaped and it changed the conformation upon dynamin GTP hydrolysis, from open ring to close ring. By the open-cloze motion, the complex bundled F-actins and stabilized the actin bundles. Furthermore, we identified N'-[4-(dipropylamino)benzylidene]-2-hydroxybenzohydrazide(DBHA)as a dynamin inhibitor that suppress dynamin-dependent actin regulation. DBHA inhibited recruitment of dynamin to the leading edge of migrating cancer cell line and ruffle formation. It also showed inhibitory effect in cell migration, invasion, and proliferation.
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Development of antimalarial drug targeting plasmodium falciparum dynamin
Grant number：23659213 2011 - 2013
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
TAKEI Kohji, YAMADA Hiroshi
Grant amount：\3770000 （ Direct expense: \2900000 、 Indirect expense：\870000 ）
By in vitro actin polymerization assay, we identified N'-(4-(diethylamino) benzylidene)-4-methoxybenzohydrazide (DBHA) as a dynamin inhibitor. Effects of DBHA on ruffle formation and cell migration were also examined, and the results on DBHA were published in a journal article.
Dynamin isoforms present in plasmodium falciparum, pfDyn1 and pfDyn2, were expressed in insect cells, and they were purified. Using these recombinant proteins, we demonstrated that both pfDyn1 and pfDyn2 have GTPase activity. It was also shown that pfDyn1 and pfDyn2 have an ability to deform lipid membranes. Furthermore, pfDyn2 inhibitor candidate molecules were determined by GTPase activity assay-based drug screening. -
Grant number：22240056 2010 - 2012
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (A) Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
NARUSE Keiji, MOHRI Satoshi, NAKAMURA Kazufumi, TAKEI Kohji, YAMADA Hiroshi, IRIBE Gentaro, KATANOSAKA Yuki
Grant amount：\50570000 （ Direct expense: \38900000 、 Indirect expense：\11670000 ）
Physical and mechanical stimuli such as gravity, extension, and shearing stress are generated throughout a living body. It has been gradually revealed that these stimuli, which are transmitted via the mechanotransduction mechanisms of cells, are not simply detrimental stresses for living organisms, but rather are biological information essential to developmental processes and functional adaptation of organs. In this project, on the basis of the development of original loading systems for mechanical stress to cells and tissues, the cellular adaptive responses to the mechanical stimuli and their transduction mechanisms in a variety of mechanosensitive tissues are to be examined. Thus, the project aims toelucidate the molecular mechanisms and roles of mechanotransduction system, which is utilized as a basis of many physiological events. It can also contribute to develop therapeutic approach to cancer invasion, cardiac hypertrophy, and regeneration of neuronal circuit.
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The role of dynamin in actin dynamics: Development of anticancer drugs inhibiting dynamin function
Grant number：22501013 2010 - 2012
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
ABE Tadashi, YAMADA Hiroshi, WATANABE Masami, ASAI Akira
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
In search of more effective inhibitor for dynamin than dynasore, one hundred eighty one dynasore analogues were screened by in vitro actin polymerization assay. N'-(4-(diethylamino)benzylidene)-4-methoxybenzohydrazide (DBHA) was identified as a potent dynamin inhibitor. DBHA strongly inhibited the serum-stimulated ruffle formation, cell migration and invasion. Under these conditions, DBHA showed little toxicity for cultured cancer cell line. Furthermore, we clarified the function of dynamin/cortactin complex in the regulation of actin dynamics. The dynamin/cortactin complexes bundled several actin filaments and the bundling stabilized actin filaments. The actin bundling by dynamin/cortactin complex was necessary for formation of growth cone filopodia and cell migration. These findings might be crucial for developping anti cancer drugs.
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Grant number：22616004 2010 - 2012
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
YAMADA Hiroshi
Grant amount：\4550000 （ Direct expense: \3500000 、 Indirect expense：\1050000 ）
The function of stretch-activated cation channel on actin dynamics was investigated. Calcium ion concentration in the ruffle membrane was increased during cell migration. Knockdown of the channel in cancer cell line resulted in marked reduction ofboth calcium influx via the channel and serum-stimulated ruffle formation, which were required for cell migration. These results suggest that stretch-activated cation channel in cancer cell is involved in cell migration possibly by regulating actin dynamics. Furthermore, we identified the function of dynamin/cortactin complex in the regulation of actin dynamics. The dynamin/cortactin complexes bundled several actin filaments and the bundling stabilized actin filaments. The actin bundling by dynamin/cortactin complex was necessary for formation of growth cone filopodia and cell migration. These findings might be crucial for the study for neuronal regeneration and cancer cell migration.
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Molecular mechanism of endocytosis that regulates membrane dynamics
Grant number：17370071 2005 - 2007
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
TAKEI Kohji, YAMADA Hiroshi, LI Shun-ai, TANAE Kenji
Grant amount：\15280000 （ Direct expense: \14800000 、 Indirect expense：\480000 ）
In order to elucidate the role of endocytic proteins in membrane dynamics, localization and intracellular dynamics of dynamin and amphiphysin during phagocytosis were examined. For this purpose, testicular Sertoli cell phagocytosis was stimulated by phosphatidylserine containing liposomes, and intracellular localization and dynamics of the endocytic proteins were examined. By immunofluorescence and by live cell imaging, both dynamin2 and amphiphysin were concentrated at the leading edge of lamellipodia and ruffles. Ruffle formation, actin formation, and phagocytosis were markedly inhibited in Amphiphysin siRNA treated cells indicating that amphiphysin is essential for these processes. Furthermore, these effects in the amphiphysin 1-knocked down cells were rescued by co-overexpression of constitutive active Rac 1, suggesting that Rac 1 is involved in the process at the downstream of amphiphysin.
Next, effect of amphiphysin 1 on actin polymerization activity was examined in vitro. For this purpose, mouse testis cytosol supplemented with pyrene-conjugated actin, were subjected to quantitative actin in vitro polymerization assay. Actin polymerization was also observed under fluorescent microscopy using cytosol supplemented with rhodamine-conjugated actin. Actin assembly activity was considerably reduced in cytosol from amphiphysin 1 knock out mice, which can be recovered by adding back recombinant proteins.
Thus, amphiphysin 1, an endocytic protein, play a role in the regulation of actin dynamics, by which it stimulate in membrane dynamics and phagocytosis. -
エンドサイトーシスの分子機構:分子構造から細胞機能まで
Grant number：15079206 2003 - 2007
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究
竹居 孝二, 山田 浩司, 李 順愛, 田邊 賢司, 絹田 正裕
Grant amount：\106400000 （ Direct expense: \106400000 ）
1)ダイナミンによる微小管動態制御
エンドサイトーシスの機能タンパクであるダイナミンは、細胞骨格の一つである微小管に結合する遺伝子として同定されたが、その生理的意義は不明であった。そこで我々はRNAiによりダイナミン2の発現を抑制した細胞の微小管を形態的に観察した。その結果、ダイナミン2のノックダウンにより動的な微小管が減少し、微小管に沿った膜輸送の障害によりゴルジ体の分散が起こる事を見いだした。さらに、変性性末梢神経障害であるシャルコー・マリー・トゥース病の原因遺伝子として報告されたダイナミン変異体を発現させた細胞でも、同様の結果が観察され微小管の異常な蓄積が観察された。以上の結果からダイナミンが微小管のダイナミクスを制御している可能性が示唆された。
2)チューブ状エンドソームの切断と成熟機構
分子選別に機能する初期エンドソームでは、初期エンドソームからリサイクルに向かうチューブ状エンドうソームが形成切断され、リサイクルエンドソームに向かう。一方、残存したエンドソームは、分解に向かう物質を含んだ後期エンドソームへの成熟が行われる。この二つのプロセスがどのように連携しているのかは判っていなかった。我々は、阻害剤を用いてチュニブ状エンドソームの切断、後期エンドソームへの成熟を阻害し、これらのプロセスについて解析した。その結果、チュブ状エンドソームの切断にダイナミンが関与しており、チューブ切断がエンドソームの酸性化と移動などの成熟過程に必要である事を見出した。 -
エンドサイト-シス小胞形成のリアルタイム観察
Grant number：15657028 2003 - 2005
日本学術振興会 科学研究費助成事業 萌芽研究
竹居 孝二, 山田 浩司, 李 順愛, 絹田 正裕
Grant amount：\2900000 （ Direct expense: \2900000 ）
ファゴサイトーシスの分子機構解明のために、セルトリ細胞を用いてファゴサイトーシスのリアルタイム観察を行った。まず、セルトリ細胞株SerW3にフォスファチジルセリン(PS)を認識する受容体(SR-B1)が発現していることをウエスタンブロットにより確認し、細胞膜における局在のパターンを蛍光免疫染色により明らかにした。次に、SerW3細胞によるPS含有大型リポゾーム取込みを経時的、定量的に調べることにより、セルトリ細胞のファゴサイトーシスが、SR-B1を介してPS依存性に起こることを明らかにした。SerW3細胞に、PS含有リポゾームあるいはPSで被覆したスチレンビーズを貪食させ、その様子を超高速共焦点レーザー顕微鏡下でリアルタイム観察したところ、ファゴサイトーシスにおけるpseudo pod形成に先立って糸状突起やラッフルの形成など、F-アクチンの再編成による細胞膜の形態変化が著明に認められた。PS刺激からアクチン重合、ラッフル形成にいたる経路には、フォスファチジルイノシトール3リン酸キナーゼ、Rac、cdc42が関与することが阻害剤を用いた実験により示された。GFP-アンフィファイジン1を発現させたSerW3細胞をライブイメージングにより観察すると、ラッフル形成に伴ってアンフィファイジン1がラッフルに集積する様子が認められた。SerW3細胞のアンフィファイジン1をRNAiによりノックダウンするとラッフル形成が抑制されたことから、アンフィファイジン1がファゴサイトーシス初期におけるアクチンフィラメントの再編成に関与することが示唆された。
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Molecular mechanism of L-glutamate and GABA-mediated regulation of secretion of glucagon and insulin in islets of Langerhans
Grant number：15390026 2003 - 2005
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
MORIYAMA Yoshinori, OTUSKA Masato, YAMADA Hiroshi
Grant amount：\13500000 （ Direct expense: \13500000 ）
Vesicular glutamate transporter (VGLUT) and vesicular GABA transporter (VGAT) play essential roles in the glutamatergic and GABAergic chemical transduction, respectively. VGLUT and VGAT are present not only in the neuronal synaptic vesicles but also in the glucagon-containing secretory granules of A cells of islets of Langerhans, and are responsible for vesicular storage of glutamate and GABA, respectively. This research aimed to reveal the molecular mechanism of the glutamate- and GABA-mediated regulation of secretion of glucagon and insulin in the islets. During three years, we have obtained the following important results.
(1)We have revealed topology of VGLUT2.
(2)We have established an in vitro assay system for VGLUT, and identified some essential amino acid residues for transport of glutamate as well as targeting.
(3)We have established an in vitro assay system for VGAT.
(4)We have observed decreased glutamatergic signaling in VGLUT1 KO mice.
(5)We have identified and characterized glutamate signaling pathway in intestinal L cells.
(6)We have identified and characterized a series of receptors for regulation of secretion of insulin and glucagon. -
A Study on Regulatory Mechanisms of Endocytosis
Grant number：14380336 2002 - 2004
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
TAKEI Kohji, YAMADA Hiroshi
Grant amount：\11100000 （ Direct expense: \11100000 ）
Regarding to regulatory mechanisms of endocytosis, the followings were revealed.
1.Regulation of endocytosis by Amphiphysin 1
Dynamin-dependent endocytosis can be reconstituted in vitro by incubating large unilammelar liposomes with brain cytosol or dynamin in presence of GTP. Using amphipshyin knockout brain cytosol in this experimental system, it was clarified that amphiphysin 1 stimulates dynamin GTPase activity and thereby enhances dynamin-dependent vesicle formation. This effect required both BAR domain and SH3 domain of amphiphysin 1. Low membrane curvature of large liposomes was also requisite for the stimulatory effect of amphiphysin 1.
2.Regulation of endocytosis cdk5-dependent phosphorylation
Both dynamin 1 and amphiphysin 1 are phosphorylated by cyclin dependent kinase 5 (cdk5). Incubation of liposomes with phosphorylated dynain and phosphorylated amphiphysin 1 in presence of GTP resulted in few vesicle formation, whereas dephophorylated proteins massively generated vesicles. Thus, endocytosis is likely to be regulated by cdk5-dependent phosphorylation.
3.Localization of dynamin 2 and dynamin3
Distinct localization of dynamin 2 and dynamin3 in Sertoli cells was revealed suggesting different functions of these isoforms. -
膵島におけるグルタミン酸によるインスリン分泌制御機構の解析
Grant number：14770600 2002 - 2004
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B)
山田 浩司
Grant amount：\3800000 （ Direct expense: \3800000 ）
株化細胞であるMIN6細胞に、AMPA型グルタミン酸受容体のイソフォームであるGluR2が発現していることを免疫化学的手法を用いて見いだした。グルタミン酸受容体のエンドサイトーシスを生化学的に検出する手法を構築し、GluR2が、AMPA刺激により細胞内にエンドサイトーシスされることを見いだした。このエンドサイトーシスは、細胞外グルコースが低濃度の場合に顕著に起こり、AMPA型グルタミン酸受容体のアンタゴニストであるGYKI52466により阻害されることが判明した。さらに、このリガンド依存性エンドサイトーシスは、細胞外のNaイオン、Caイオンを除くことにより阻害された。さらに、人工的に細胞膜の脱分極を高濃度のKClを加えることにより、誘導するとGluR2のエンドサイトーシスが起こった。従って、GluR2のエンドサイトーシスは、グルタミン酸の受容体への結合と細胞膜の脱分極が必要であることが示唆された。さらに、蛍光ラベルしたGluR2(GFP-GluR2)をMIN6細胞に強制発現させ、AMPA刺激で、GluR2のエンドサイトーシスを反映していると考えられる蛍光スポットの移動が観察できた。
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シナプスにおけるエンドサイトーシス機能タンパク-膜リン脂質相互作用の解析
Grant number：14380306 2002 - 2004
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
絹田 正裕, 竹居 孝二, 山田 浩司
Grant amount：\10700000 （ Direct expense: \10700000 ）
Amphiphysin 1によるDynamin GTPase活性の上昇
Dynamin 1GTPアーゼ活性に対するAmphiphysin 1と膜脂質の影響を調べ、Amphiphysin 1が、大型リポゾームの存在下にDynamin 1のGTPアーゼ活性を上昇することを明らかにした。リポゾームにフォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール2リン酸などの酸性リン脂質を含まれる場合、特にGTPアーゼ活性の増強効果が高かった。ミュータントAmphiphysin 1を用いた解析により、Dynamin 1GTPアーゼ活性の増強には膜脂質への結合を担うBARドメインと、dynaminとの結合ドメインであるSH3ドメインが必要でであることを明らかにした。また、クラスリン結合部位、AP2結合部位を含む中間部は、Dynamin 1GTPアーゼ活性に対して抑制的に働くことが示唆された。
Amphiphysin 1によるDynamin 1と膜脂質の結合の増加
リポゾームを用いた結合実験により、Amphiphysin 1がDynamin 1と膜脂質の結合を増加させることを明らかにした。この結合増加の一因は、Amphiphysin 1のBARドメインとSH3ドメインを介した間接的結合によるものであることを、ミュータントAmphiphysin 1を用いた解析により明らかにした。
Amphiphysin 1とDynamin 1と脂質膜の結合増加
ミュータントAmphiphysin 1を用いた解析により,Amphiphysin 1とDynamin 1のリング形成にはBARドメインとSH3ドメインが必要であることを明らかにした。また、リング形成とDynamin 1 GTPアーゼ活性の上昇が、Dynamin 1と膜結合性にある程度相関することを示唆した。
以上の成果を論文にまとめ発表した。 -
神経シナプスにおけるエンドサイトーシスの変化を指標とした神経変性疾患の解析
Grant number：13035032 2001 - 2002
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究
竹居 孝二, 山田 浩司, 絹田 正裕
Grant amount：\4600000 （ Direct expense: \4600000 ）
1.老化モデルマウスを用いた解析
老化脳における神経シナプスの変化を調べるため、老化モデルマウスであるKlotho変異マウス海馬シナプスにおけるタンパク発現を精査した。蛍光免疫染色法および蛍光強度の定量的測定では、シナプス小胞のマーカーであるSynaptophysinの発現が海馬CA3領域において軽度減少していた。次にシナプスエンドサイトーシス機能蛋白(Clathrin、AP2、Dynamin1、Amphiphysin1など)の発現と局在をそれぞれウエスタンブロッティング、蛍光免疫染色法により調べた。Klotho変異マウス海馬ではDynamin1の発現がわずかにの減少していたが、他のタンパクについては変化はみられなかった。
2.Klothoタンパクの局在
Klotho変異マウス脳における上記の変化とKlothoタンパクの関連を明らかにする目的で、Klothoタンパクの局在を蛍光免疫染色法により調べた。既にKlotho mRNAは脈絡叢上皮に局在することが報告されているが、Klothoタンパクも脈絡叢に特異的に発現していた。さらに共焦点顕微鏡観察、金コロイドを用いた凍結免疫電顕法により、Klothoタンパクが脈絡叢上衣細胞のapical側(脳室側)に選択的に局在することが明らかになった。脈絡叢は脳脊髄液の産生、調節に機能することから、Klotho変異マウス脳にみられた上記の比較的軽度な変化は、脳脊髄液産生、調節の変化を介した二次的な変化である可能性が示唆された。 -
AMPA型グルタミン酸受容体のエンドサイトーシスの分子機構
Grant number：13041045 2001
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究(A)
竹居 孝二, 山田 浩司, 絹田 正裕
Grant amount：\4000000 （ Direct expense: \4000000 ）
1.膵島β細胞株MIN6のキャラクタライゼイション
膵島β細胞にはAMPA受容体が発現していることが見い出されており、本研究ではAMPA受容体のエンドサイトーシスの機構を解明するためにβ細胞を用いることを提案した。
まず特異的抗体を用いたWestern blot法により、MIN6におけるAMPA受容体の発現を明らかにした。次にMIN6におけるエンドサイトーシス機能タンパクの発現を調べた。その結果、クラスリン依存性エンドサイトーシスの機能タンパクであるアンフィファイジン、さらにアンフィファイジンのリン酸化酵素CDK5が高発現することがWestern blot法により見い出された。
2.エンドサイトーシスのin vitro再構成系の確立
AMPA受容体エンドサイトーシスの分子メカニズム解明のためには、エンドサイトーシスによる取り込み小胞の形成をin vitroで再現する実験系の確立が必要であると考えた。In vitroで人工脂質膜(リポソーム)を膜成分として、ATPおよびGTP存在下に細胞質と反応させることにより、大型(直径>1μm)のリポソームから直径100nm以下の小胞が多数形成される実験系を確立した。さらに、形成された小胞の大きさ、数、相対的質量を動的光拡散測定装置を用いて測定することにより、小胞形成の定量化を可能とした。この実験系はAMPA受容体の選択的取り込みを解析するための実験系として応用されうる。 -
A Study on Molecular Mechanisms of Endocytosis
Grant number：12480217 2000 - 2001
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
TAKEI Kohji, YAMADA Hiroshi, KINUTA Masahiro
Grant amount：\14100000 （ Direct expense: \14100000 ）
Establishment of in vitro cell-free system: In order to elucidate molecular mechanisms involved in endocytosis, vesicle formation in endocytosis was reconstituted in vitro. Incubation of large liposomes, larger than 1 μm in diameter, with brain cytosol resulted in massive formation of small vesicles, smaller than 100 nm in diameter. The vesicle formation required both ATP and GTP. Vesicle formation was drastically reduced when liposomes were incubated with dynamin 1 -depleted cytosol, indicating that vesicle formation in this experimental system represents endocytic vesicle formation. The vesicle formed during the incubation can be analyzed quantitatively and qualitatively by dynamic light scattering.
Functions and Kinetics of membrane lipids: Functions of membrane lipids were studied by analyzing vesicle formation from liposomes of with various compositions. Vesicle formation increased as phosphatidylinositol-4.5-bisphosphate (PIP_2) concentration in liposomes was increased. Furthermore, PIP_2 was degraded to phosphatidylinositol-4-bisphosphate, then to phosphatidylinositol. Next, PIP_2 synthesis during the reaction was analyzed by addition of neomycin, inhibitor for PIP_2 degradation, in the reaction mixture. PIP_2 synthesis was increased by active form of ADP-ribosylation factor 6 (Arf6). It was suggested that increase of membrane recruitment of AP2, clathrin adaptor protein, by Arf6 might attribute to the increase of PIP_2 synthesis.
Kinetics of membrane lipids in culture cells: Degradation of PTP_2 synthesis upon endocytosis was examined in culture cells. Metabolically labeled HeLa cells were stimulated for endocytosis and the amount of PIP_2 was analyzed. Similar PIP_2 degradation as that observed in the cell-free system was observed. -
遺伝子、蛋白の機能、形態解析のための細胞内超微構造のデータベースの構築
Grant number：12208033 2000
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究(C)
竹居 孝二, 横田 一正, 山田 浩司, 絹田 正裕, 劉 渤江, 國島 丈夫
本研究の目的は既報論文の電子顕微鏡像を形態的特徴によって分類し、そのデータベースを構することである。本年度の研究実績は以下の通り。
1 論文検索および電子顕微鏡像の解析
今年度は対象論文を神経細胞に限定し、まずPubMedで『neuron(神経)』および『ultrastructure(微細構造)』のキーワードにより検索される約3万7千余の論文の一部について、本データベースの対象論文としての妥当性を分析した。その結果、対象となる電子顕微鏡像は一部の学術雑誌に集中して掲載されていることが判明したので、効率的なデータベース構築をするため、学術雑誌ごとに論文の分析、入力作業を行うこととした。現在、Cell Tissue Researchに掲載された1197件の論文について、電顕像をその特徴により分類し、画像入力およびPubMedからの書誌情報の取り込みを行っている。
2 データベース構築
今年度はデータベース構築のためのプロトタイプシステムの実装を行った。このシステムでは、PubMedから得られる論文の書誌情報、論文からスキャナで取り込んだ画像データ、および画像データの特徴をあらわすキーワードなどをデータベースに格納し、相互の関連付けを半自動で行っている。データベースに対する検索は、要求が最も高いと思われるキーワードからの検索を中心に実装した。PubMedの書誌情報がASN.1形式で構造化されているため、テキスト情報は構造化文書の標準規格であるXML形式で構造化した上でデータベースに格納するという構成を採用した。その結果として、データベースとしてはXML文書処理機能の豊富なOracle8iを、また検索システムはJava言語のServlet機能を用いたWWWサーバ・クライアント方式をそれぞれ採用した。この知見を元に、来年度はより使いやすいデータ入力方式や検索方法、PubMedの更新への自動追随などを検討していきたい。 -
松果体細胞がグルタミン酸作動性のパラニューロンであることの発見とその性格づけ
Grant number：97J03629 1998
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特別研究員奨励費
山田 浩司
Grant amount：\1300000 （ Direct expense: \1300000 ）