研究者詳細 - 木村　康二

論文 - 木村　康二

分割表示 124 件中 61 - 80 件目／全件表示 >>

基底膜下 stem-like cells による卵管上皮組織リモデリング

小林芳彦, 伊藤さやか, 木村康二, 奥田潔

日本繁殖生物学会講演要旨集 109 ( 0 ) P - 15-P-15 2016年

記述言語：日本語出版者・発行元：日本繁殖生物学会

<p>【目的】哺乳動物の卵管上皮組織は，排卵周期の進行に伴い変化することで卵管内において起こる様々な生理現象に最適な環境を生み出す。上皮層には既知の卵管上皮細胞（分泌細胞および繊毛細胞）に加え，少数のstem-like cells（CD44陽性細胞）の存在することが近年明らかとなったが，その役割は不明である。本研究はCD44陽性細胞の特性を明らかにすることを目的とした。【方法】24–72カ月齢のウシ卵管において，1） CD44陽性細胞の局在およびCD44と種々のマーカータンパク質の共局在を免疫組織化学的に調べることで同細胞の性質を推定した。2）卵管間質層から磁気ビーズ分離法により単離したCD44陽性細胞の基底膜通過能を，基底膜マトリックスMatrigelをコートしたTranswellを用いて調べた。3） Air-liquid interface（ALI）培養した間質層由来CD44陽性細胞に種々の物質を添加し，上皮/間葉マーカー発現の比率（Cytokeratin-7（CK7）：Vimentin（VIM）およびE-cadherin（CDH1）：VIM）を算出するとともに免疫細胞染色により間葉上皮転換能を評価した。【結果】1） CD44陽性細胞は上皮層に加えて間質層にも存在した。上皮層のCD44陽性細胞にはCK7陽性かつVIM陰性のもの，CK7陰性かつVIM陽性のものならびにCK7陽性かつVIM陽性のものが混在する一方，間質層のCD44陽性細胞は全てCK7陰性かつVIM陽性であった。卵管上皮層におけるVIM陽性のCD44陽性細胞は排卵前と比べ排卵後に減少する一方，CK7陽性のCD44陽性細胞は増加した。2）間質層由来CD44陽性細胞はMatrigel層を通過し，この通過は基底膜成分分解酵素matrix metalloproteinase-2の中和抗体により抑制された。3） Wnt4およびcAMP活性化剤Forskolinの共添加がVIM発現に対するCK7およびCDH1発現の比率を上昇させ，上皮様の形態を持つ細胞への分化を誘導した。以上より，新たに存在の示された間質層由来CD44陽性細胞は基底膜を通過でき，上皮細胞へ分化可能であること，さらに基底膜下のより未分化な細胞が，周期的にリモデリングされる卵管上皮組織を構築する細胞の供給源である可能性が示された。</p>

DOI： 10.14882/jrds.109.0_P-15

Possible role of interferon tau on the bovine corpus luteum and neutrophils during the early pregnancy 査読

Koumei Shirasuna, Haruka Matsumoto, Shuichi Matsuyama, Koji Kimura, Heinrich Bollwein, Akio Miyamoto

REPRODUCTION 150 ( 3 ) 217 - 225 2015年9月

記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：BIOSCIENTIFICA LTD

When pregnancy is established, interferon tau (IFNT), a well-known pregnancy recognition signal in ruminants, is secreted by embryonic trophoblast cells and acts within the uterus to prepare for pregnancy. IFNT acts as an endocrine factor on the corpus luteum (CL) to induce refractory ability against the luteolytic action of PGF(2 alpha). Hypothesising that IFNT may influence not only the uterine environment but also the CL in cows via local or peripheral circulation, we investigated qualitative changes in the CL of pregnant cows during the maternal recognition period (day 16) and the CL of non-pregnant cows. The CL of pregnant animals had a higher number of neutrophils, and the expression of interleukin 8 (IL8) mRNA and its protein was higher as well as compared with the CL of non-pregnant animals. Although IFNT did not affect progesterone (P-4) secretion and neutrophil migration directly, it stimulated IL8 mRNA expression on luteal cells (LCs), influencing the neutrophils, resulting in the increased migration of IFNT-activated neutrophils. Moreover, both IFNT-activated neutrophils and IL8 increased P-4 secretion from LCs in vitro. Our novel finding was the increase in neutrophils and IL8 within the CL of pregnant cows, suggesting the involvement of IFNT function within the CL toward establishment of pregnancy in cows. The present results suggest that IFNT upregulates neutrophil numbers and function via IL8 on LCs in the CL of early pregnant cows and that both neutrophils and IL8, stimulated by IFNT, are associated with an increase in P-4 concentrations during the maternal recognition period in cows.

DOI： 10.1530/REP-15-0085

ウシ子宮内膜上皮細胞におけるSide population細胞の解析

松山秀一, 古澤軌, 池田光美, 美辺詩織, 木村康二

The Journal of Reproduction and Development 61 ( Suppl. ) j140 - j140 2015年9月

記述言語：日本語出版者・発行元：(公社)日本繁殖生物学会

【目的】ウシにおいては分娩を機に受胎率が低下することが知られている。このような受胎率低下は分娩後の子宮内膜再生の不具合が一因と考えられるが，ウシの分娩後における子宮内膜再生メカニズムは未だ解明されていない。ウシとは異なり，月経周期ごとに脱落と増殖を繰り返し絶えず更新されるヒトの子宮内膜においては子宮内膜幹細胞が子宮内膜の更新に寄与することが示唆されている。我々はこれまでに，ウシ子宮内膜上皮細胞においても幹細胞活性を有すると報告されているSide population （SP）細胞が存在することを明らかにしており，本研究では，ウシ子宮内膜上皮培養細胞におけるSP細胞の出現パターンおよびSP細胞の分化能について明らかにすることを目的とした。【方法および結果】ウシ子宮からトリプシン処理により単離し，培養した子宮内膜上皮細胞を用いてHoechst33342にて染色後，フローサイトメトリー解析に供し，SP細胞の存在を確認した。さらにセルソーターによって，ウシの子宮内膜上皮培養細胞からSP細胞を分取し，骨芽細胞および脂肪細胞分化用培地を用いて培養したが，それぞれ骨芽細胞および脂肪細胞への分化は認められなかった。また，マトリゲルと混合したウシ子宮内膜上皮SP細胞を免疫不全マウスの皮下に注入し，9週間後に移植部位を確認したところ，テラトーマの形成は認められなかった。このように，ウシの子宮内膜上皮SP細胞はヒト子宮内膜SP細胞で示されているような多分化能を示さないことから，ウシの子宮内膜再生メカニズムは幹細胞が寄与するヒトの子宮内膜更新とは大きく異なる可能性が示唆された。また，子宮内膜上皮細胞におけるSP分画の割合は一定でなく個体間で大きく変動していたことから，ウシ子宮内膜上皮SP細胞は子宮内膜更新の段階に応じて増殖するような前駆細胞として機能することで子宮内膜の更新に寄与している可能性がある。

DOI： 10.14882/jrds.108.0_p-60

ウシにおける最終糖化産物の蓄積状況の検討

美辺詩織, 松山秀一, 木村康二

The Journal of Reproduction and Development 61 ( Suppl. ) j170 - j170 2015年9月

記述言語：日本語出版者・発行元：(公社)日本繁殖生物学会

【目的】乳牛では，高泌乳化に伴い穀類依存比率を高めた飼養体系に移行している一方で，受胎率は減少の一途を辿っている。近年，体内に過剰に摂取された余剰の糖などのエネルギー物質は非酵素的にタンパク質と結合して最終糖化産物（Advanced Glycation End Products：AGEs）を生み出し，このAGEsが様々な疾患や臓器・組織の老化を引き起こすことが明らかとなってきた。乳牛の低受胎には高エネルギー飼養体系により蓄積したAGEsが関与している可能性も考えられるが，これまで家畜における血中AGEs濃度を測定した報告はない。本研究ではウシの体内におけるAGEsの蓄積状況を把握するとともに，飼養形態や栄養状態との相関を明らかにすることを目的とした。【方法】日本飼養標準に示された養分要求量を充足するようにTMR給与が行われているホルスタイン経産牛（n=20）と粗飼料主体で飼養されているホルスタイン未経産牛（n=20）および黒毛和種（経産牛n=20，未経牛産n=19）から採血し，AGEsの一種であるメチルグリオキサール（MG）誘導体，グルコース，非エステル化脂肪酸（NEFA）濃度を測定した。【結果および考察】ホルスタイン経産牛（平均日齢 1878日，TMR給与）における血中MG誘導体濃度は，加齢による影響を排除するために日齢差がない黒毛和種経産牛（平均日齢 1858日，粗飼料給与）と比較した結果，有意に高かった。一方，血中グルコースおよびNEFA濃度には差が認められなかった。また，粗飼料主体で飼養されている日齢差がないホルスタイン種（平均日齢 517日）および黒毛和種（平均日齢 505日）の未経産牛の間には血中MG誘導体濃度に差が見られなかった。以上のことから，ホルスタイン経産牛におけるAGEsの蓄積は穀類依存比率を高めた飼養体系が一因である可能性が示唆された。

DOI： 10.14882/jrds.108.0_p-119

Generation of Naïve Bovine Induced Pluripotent Stem Cells Using PiggyBac Transposition of Doxycycline-Inducible Transcription Factors. 査読

Kawaguchi T, Tsukiyama T, Kimura K, Matsuyama S, Minami N, Yamada M, Imai H

PloS one 10 ( 8 ) e0135403 2015年8月

Regulation of gonadotropin secretion by monitoring energy availability 査読

Shuichi Matsuyama, Koji Kimura

Reproductive Medicine and Biology 14 ( 2 ) 39 - 47 2015年4月

記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：John Wiley and Sons Ltd

Nutrition is a principal environmental factor influencing fertility in animals. Energy deficit causes amenorrhea, delayed puberty, and suppression of copulatory behaviors by inhibiting gonadal activity. When gonadal activity is impaired by malnutrition, the signals originating from an undernourished state are ultimately conveyed to the gonadotropin-releasing hormone (GnRH) pulse generator, leading to suppressed secretion of GnRH and luteinizing hormone (LH). The mechanism responsible for energetic control of gonadotropin release is believed to involve metabolic signals, sensing mechanisms, and neuroendocrine pathways. The availabilities of blood-borne energy substrates such as glucose, fatty acids, and ketone bodies, which fluctuate in parallel with changes in nutritional status, act as metabolic signals that regulate the GnRH pulse generator activity and GnRH/LH release. As components of the specific sensing system, the ependymocytes lining the cerebroventricular wall in the lower brainstem integrate the information derived from metabolic signals to control gonadotropin release. One of the pathways responsible for the energetic control of gonadal activity consists of noradrenergic neurons from the solitary tract nucleus in the lower brainstem, projecting to the paraventricular nucleus of the hypothalamus. Further studies are needed to elucidate the mechanisms underlying energetic control of reproductive function.

DOI： 10.1007/s12522-014-0194-0

ウシ卵管内における局所調節因子アクチビンの標的細胞

山本ゆき, 小林芳彦, 小林宙, 木村康二, 奥田潔

日本繁殖生物学会講演要旨集 108 ( 0 ) P - 63-P-63 2015年

記述言語：日本語出版者・発行元：日本繁殖生物学会

【目的】アクチビン（ACV）Aは局所調節因子として卵胞発育や着床に関与する糖タンパク質である。ACV受容体（ActR）は，プロテインキナーゼとして機能する1型（ActR1）と，リガンド結合部を有する2型（ActR2）からなるヘテロ4量体である。ActRにACVが結合すると，シグナルタンパク質Smad2/3がリン酸化されシグナルが伝達される。我々は以前，ウシ卵管由来の活性型ACVAが排卵前後に増加する可能性を示した。本研究では，卵管におけるACVAの役割を解明することを目的に，以下の4点について検討した。【検討項目】1)ウシ卵管組織におけるActRs遺伝子発現，2)培養卵管上皮および間質細胞におけるActRsの発現，3)培養卵管上皮および間質細胞におけるSmad2/3発現，4)ウシ凍結精子（8個体）のActRsならびにSmad2/3発現。1)，2)，3) については卵管膨大部および峡部のそれぞれで検討した。【結果】1) 膨大部および峡部の卵管組織では ActR1BおよびActR2A の遺伝子発現が確認され，各遺伝子発現量は排卵前後で低かった。2) ActR1BおよびActR2A遺伝子は培養上皮および間質細胞の両方に発現していたが，タンパク質は上皮細胞においてのみ発現していた。 3)培養上皮および間質細胞の両方においてSmad2/3遺伝子発現が確認されたが，タンパク質は上皮細胞でのみ発現していた。4)精子において，ActR1BおよびActR2A の遺伝子およびタンパク質発現とともにSmad2/3遺伝子の発現が確認された。【考察】卵管上皮細胞および精子にActRsおよび Smad2/3が発現していたことから，両者はACVAの標的であることが示唆された。ウシ卵母細胞や初期胚にはすでにActRs の発現が確認されている。しかし卵管組織のActR遺伝子発現は，活性型ACVAが増加する排卵前後に低かった。以上より，排卵前後のウシ卵管内ACVAは卵母細胞のみならず精子にも作用している可能性が示された。

DOI： 10.14882/jrds.108.0_P-63

Interferon-tau attenuates uptake of nanoparticles and secretion of interleukin-1β in macrophages. 査読

Hara K, Shirasuna K, Usui F, Karasawa T, Mizushina Y, Kimura H, Kawashima A, Ohkuchi A, Matsuyama S, Kimura K, Takahashi M

PloS one 9 ( 12 ) e113974 2014年12月

Effect of estradiol during culture of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the mitochondrial DNA copies of oocytes and telomere length of granulosa cells 査読

M. Endo, K. Kimura, T. Kuwayama, Y. Monji, H. Iwata

ZYGOTE 22 ( 4 ) 431 - 439 2014年11月

記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：CAMBRIDGE UNIV PRESS

During the development of oocytes from early antral follicles (EAFs) to antral follicles (AFs), the mitochondrial DNA copy number (Mt DNA number) increases, and granulosa cells markedly proliferate. This study examined the effect of supplementation of culture medium with estradiol-17 beta(E-2) on the in vitro growth of oocytes, and increases in the Mt DNA number, and telomere length during the in vitro culture of oocytes derived from EAFs (0.4-0.7 mm in diameter). The E-2 supplementation improved antrum formation and the ratio of oocytes reaching the metaphase II (MII) stage, and there was a significant difference in these values between addition E-2 concentrations of 10 mu g/ml and 0.1 mu g/ml. When the oocytes were cultured in the medium containing 10 mu g/ml E-2, the Mt DNA number determined by real-time polymerase chain reaction (PCR) significantly increased, and the ratio of the Mt DNA number at the end of culture to the Mt DNA number at the beginning of the culture was greatly different among cows, and could be predicted by the degree of the difference between the Mt DNA number of oocytes derived from EAFs and that of oocytes derived from AFs (3-6 mm in diameter). When oocytes were cultured for 16 days in a medium containing 10 mu g/ml E-2 or 0.1 mu g/ml E-2, the Mt DNA number of oocytes grown in vitro did not differ, but the telomere length of the granulosa cells was significantly greater in the 10 mu g/ml E-2 group than in the 0.1 mu g/ml group. In conclusion, E-2 supplementation in culture medium improved the growth of oocytes derived from EAFs, and a high E-2 concentration increased the telomere length of the granulosa cells.

DOI： 10.1017/S0967199412000603

Successful Nonsurgical Transfer of Bovine Elongating Conceptuses and Its Application to Sexing 査読

Koji Kimura, Shuichi Matsuyama

JOURNAL OF REPRODUCTION AND DEVELOPMENT 60 ( 3 ) 210 - 215 2014年6月

記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：SOCIETY REPRODUCTION & DEVELOPMENT-SRD

The objectives of the present study were to establish a nonsurgical transfer method for elongating bovine conceptuses and to combine this method with biopsy and sexing. Bovine conceptuses were recovered from donor cows on days 13-14 of the estrus cycle. In experiment 1, day 13 conceptuses were transferred to recipient cows using a standard day 7 embryo transfer (ET) method. The pregnancy rate of day 13 conceptus transfer (CT) is comparable to that of day 7 ET. In experiment 2, day 14 conceptuses were transferred using modified methods (balloon catheters or ET guns with modified sheaths). Using the standard ET method, no pregnancies were obtained; however, when balloon catheters or ET guns with modified sheaths were used, the pregnancy rates after CT were 48.0% and 44.8%, respectively. In experiment 3, day 14 conceptuses were biopsied without a micromanipulator, sexed using the loop-mediated isothermal amplification method and transferred to recipient cows. The pregnancy rate of biopsied conceptuses was 46.2% and did not differ significantly from that of unbiopsied conceptuses. Moreover, all pregnant cows transferred conceptuses following biopsy and sexing delivered calves with the expected sexes. These results suggested that the nonsurgical bovine CT method was comparable to day 7 ET and that this technique enables biopsy and sexing without expensive equipment such as a micromanipulator or specialized skills.

DOI： 10.1262/jrd.2013-137

Resveratrol Improves the Mitochondrial Function and Fertilization Outcome of Bovine Oocytes 査読

Shun Takeo, Daichi Sato, Koji Kimura, Yasunori Monji, Takehito Kuwayama, Ryoka Kawahara-Miki, Hisataka Iwata

JOURNAL OF REPRODUCTION AND DEVELOPMENT 60 ( 2 ) 92 - 99 2014年4月

記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：SOCIETY REPRODUCTION & DEVELOPMENT-SRD

The aim of the present study was to address the effect of resveratrol-mediated upregulation of sirtuin 1 (SIRT1) during oocyte maturation on mitochondrial function, the developmental ability of oocytes and on mechanisms responsible for blockage of polyspermic fertilization. Oocytes collected from slaughterhouse-derived ovaries were cultured in TCM-199 medium supplemented with 10% FCS and 0 or 20 mu M resveratrol (Res). We examined the effect of Res on SIRT1 expression in in vitro-matured oocytes (Exp 1); fertilization and developmental ability (Exp 2); mitochondrial DNA copy number (Mt number), ATP content and mitochondrial membrane potential in matured oocytes (Exp 3); and the time required for proteinase to dissolve the zona pellucida following in vitro fertilization (as a marker of zona pellucida hardening), as well as on the distribution of cortical granules before and after fertilization (Exp 4). In Exp 1, the 20 mu M Res treatment upregulated protein expression of SIRT1 in oocytes. In Exp 2, Res treatment improved the ratio of normal fertilization and the total cell number of blastocysts. In Exp 3, Res treatment significantly increased the ATP content in matured oocytes. Additionally, Res increased the overall Mt number and mitochondrial membrane potential, but the effect was donor-dependent. In Exp 4, Res-induced zona hardening improved the distribution and exocytosis of cortical granules after in vitro fertilization. In conclusion, Res improved the quality of oocytes by improving mitochondrial quantity and quality. In addition, Res added to the maturation medium enhanced SIRT1 protein expression in oocytes and improved fertilization via reinforcement of the mechanisms responsible for blockage of polyspermic fertilization.

DOI： 10.1262/jrd.2013-102

Aerococcus vaginais sp nov., isolated from the vaginal mucosa of a beef cow, and emended descriptions of Aerococcus suis, Aerococcus viridans, Aerococcus urinaeequi, Aerococcus urinaehominis, Aerococcus urinae, Aerococcus christensenil and Aerococcus sanguinicola 査読

Masanori Tohno, Maki Kitahara, Shuichi Matsuyama, Koji Kimura, Moriya Ohkuma, Kiyoshi Tajima

INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY 64 ( Pt 4 ) 1229 - 1236 2014年4月

記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：SOC GENERAL MICROBIOLOGY

A gram-stain-positive, facultatively anaerobic, non-spore-forming, catalase-negative, coccoid-shaped bacterial strain, designated BV2(T), was isolated from the vaginal mucosa of a beef cow in Japan. Phylogenetic analysis showed that the isolate shared high 16S rRNA gene sequence similarity (92.9%) with Aerococcus suis 1821102(T) and low similarity (<92.7%) with any other recognized species of the genus Aerococcus. The DNA G+C content was 44.7 mol%, which is within the range observed among species of the genus Aerococcus (37.5-48.4 mol%). The major cellular fatty acid was C-18:1 omega 9c, similar to other type strains of species of the genus Aerococcus. The results of genotypic, phenotypic and chemotaxonomic analyses as well as the low degree of DNA DNA relatedness with all recognized members of the genus Aerococcus indicate that strain BV2(T) represents a novel species of the genus Aerococcus, for which the name Aerococcus vagina/is sp. nov. is proposed. The type strain is BV2(T) (=JCM 19163(T)=DSM 27293(T)). Emended descriptions of Aerococcus suis, Aerococcus viridans, Aerococcus urinaeequi, Aerococcus urinaehominis, Aerococcus urinae, Aerococcus christensenii and Aerococcus sanguinicola are also presented.

DOI： 10.1099/ijs.0.058081-0

Resveratrol improves the mitochondrial function and fertilization outcome of bovine oocytes. 査読

Takeo S, Sato D, Kimura K, Monji Y, Kuwayama T, Kawahara-Miki R, Iwata H

Journal of Reproduction and Development 60 ( 2 ) 92 - 99 2014年4月

高濃度エストロジェン投与が去勢雄ウシのLH分泌におよぼす影響

佐々木拓弥, 松山秀一, 木村康二, 上野山賀久, 束村博子, 松田二子, 大蔵聡

日本畜産学会大会講演要旨集 118回 199 - 199 2014年3月

ウシDDX4プロモーター制御下でDsRedを発現するトランスジェニックマウスの解析

古澤軌, 大越勝広, 細江実佐, 池田光美, 赤木悟史, 木村康二, 松山秀一, 徳永智之

日本繁殖生物学会講演要旨集 107 P - 87-P-87 2014年

記述言語：日本語出版者・発行元：日本繁殖生物学会

［目的］マウスでは，体外でES細胞やiPS細胞のような多能性幹細胞から機能的な生殖系列細胞を分化誘導する研究が進んでいる。ウシのように世代間隔が長い家畜動物に応用できれば，育種改良にかかる時間とコストを大幅に削減できる。本研究ではウシ生殖系列細胞の分化誘導過程を可視化するため，生殖系列細胞特異的に発現するウシDDX4(VASAホモログ)遺伝子の発現調節領域にDsRed遺伝子を連結したレポーターベクターを構築し，マウスを用いてその発現制御の特異性を検証した。［方法］ウシDDX4遺伝子開始コドンの上流3kbの配列にDsRed遺伝子を連結し，さらに終止コドンの下流1kbの配列を連結した。これを導入細胞選別のためのloxP-CAG-GFP-SVpA-loxPカセットを含むPiggyBacトランスポゾンベクターに組み込み，TT2マウスES細胞株に導入した。遺伝子導入ES細胞を用いて作成されたキメラマウスとその後代について，胎齢13.5日，生後7，11，14及び35日齢の雄生殖腺におけるDsRedの発現を調べた。［結果及び考察］免疫組織学的解析では胎齢13.5日の胎子においても生殖細胞特異的なDdx4の発現が確認されたが，これと一致したDsRedの発現が最初に観察されたのは生後14日齢からであった。蛍光顕微鏡による解析では，11日齢の精細管の一部でDsRed陽性細胞の出現が観察され，フローサイトメーター解析では14日齢で約3%，35日齢で約60%の精巣細胞がDsRed陽性を示すことが明らかになった。定量的PCR解析においても，生殖腺特異的なDsRedの発現が検出されるのは生後14日齢からであり，免疫組織学的解析の結果と一致した。これらの結果から，マウス生殖細胞において本研究で用いたウシDDX4発現制御領域による転写が開始するのは生後7–11日齢の間であり，これは分化型精原細胞と精母細胞の出現時期と一致した。

DOI： 10.14882/jrds.107.0_P-87

POU5F1発現誘導システムによる高品質ウシES細胞樹立の試み

池田光美, 古澤軌, 大越勝広, 細江実佐, 木村康二, 松山秀一, 赤木悟史, 徳永智之

日本繁殖生物学会講演要旨集 107 P - 96-P-96 2014年

記述言語：日本語出版者・発行元：日本繁殖生物学会

【目的】我々は第106回本学会において体外受精ウシ胚から樹立したES様細胞がDay 62のキメラウシ胎子組織に存在すること，また，胚体外組織にも寄与する可能性を報告した。しかし生殖系列細胞への分化が確認されておらず，また胚様体形成実験でも，分化誘導時の急速な細胞死が原因で多能性の証明には至っていない。本研究ではウシES様細胞に多能性関連因子の発現誘導システムを導入し，発現量と発現時期を調節することでより高品質なウシES細胞に改変することを試みた。【方法】Tet-On発現誘導システムにPOU5F1(OCT3/4)遺伝子を組み込み，PiggyBacトランスポゾンベクターを用いてウシES様細胞へ導入した。ドキシサイクリン(Dox)存在下でコロニーをピックアップし，遺伝子導入が確認された株について，Doxの有無による細胞の形態及び増殖性の比較と，幹細胞関連遺伝子発現の変化をqRT-PCRにより調べた。さらに，浮遊培養による胚様体形成実験を行った。【結果】POU5F1発現誘導株はコロニー形態がよりドーム状になり，細胞増殖速度は親株と比較して約2.5倍に亢進した。Doxを除去しても形態及び倍化時間が変化しなかったことから，外因性POU5F1の過剰発現により活性化された経路が，外因性POU5F1発現低下後も持続することが示唆された。qRT-PCR解析の結果，Dox添加による外因性POU5F1と幹細胞マーカーNANOG,CDH-1(E-cadherin)，MBD3の発現量増加，及びMycの発現量低下を確認した。さらにDoxの有無にかかわらず，親株と比較してCCND1(cyclin D1)の発現量の増加とBCL2の発現量の低下が認められた。胚様体形成実験では，分化培地での培養3週間後に胚様体が形成され，培養系での分化誘導が可能であることが示された。以上の結果により，外因性POU5F1の発現誘導により細胞増殖が亢進し，さらに多能性関連因子の発現誘導を介してES様細胞の性状を大きく変化させることが示唆された。

DOI： 10.14882/jrds.107.0_P-96

Characteristics of Bovine Inner Cell Mass-Derived Cell Lines and Their Fate in Chimeric Conceptuses 査読

Tadashi Furusawa, Katsuhiro Ohkoshi, Koji Kimura, Shuichi Matsuyama, Satoshi Akagi, Masahiro Kaneda, Mitsumi Ikeda, Misa Hosoe, Keiichiro Kizaki, Tomoyuki Tokunaga

BIOLOGY OF REPRODUCTION 89 ( 2 ) 28 2013年8月

記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：SOC STUDY REPRODUCTION

Bovine embryonic stem (ES) cells have the potential to provide significant benefits in a range of agricultural and biomedical applications. Here, we employed a combination of conventional methods using glycogen synthase kinase 3 and mitogen-activated protein kinase inhibitors to establish ES cell lines from in vitro fertilization (IVF) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) bovine embryos. Five male cell lines were established from IVF embryos, and two female and three male cell lines from SCNT blastocysts; we named these lines bovine ES cell-like cells (bESLCs). The lines exhibited dome-shaped colonies, stained positively for alkaline phosphatase, and expressed pluripotent stem cell markers such as POU5F1, SOX2, and SSEA-1. The expression levels of these markers, especially for NANOG, varied among the cell lines. A DNA methylation assay showed the POU5F1 promoter region was hypomethylated compared to fibroblast cells. An in vitro differentiation assay showed that endoderm and ectoderm marker genes, but not mesoderm markers, were upregulated in differentiating bESLCs. To examine bESLCs in later embryonic stages, we created 22 chimeric blastocysts with a male bESLC line carrying a GFP marker gene and transferred these to a recipient cow. Four chimeric embryos were subsequently retrieved on Day 13 and retransferred to two recipient cows. One living fetus was obtained at Day 62. GFP signals were not identified in fetal cells by fluorescence microscopy; however, genomic PCR analysis detected the GFP gene in major organs. Clusters of GFP-positive cells were observed in amniotic membranes, suggesting that bESLCs can be categorized as a novel type of ICM-derived cells that can potentially differentiate into epiblast and hypoblast lineages.

DOI： 10.1095/biolreprod.112.106641

Age-Associated Changes in Gene Expression and Developmental Competence of Bovine Oocytes, and a Possible Countermeasure Against Age-Associated Events 査読

S. Takeo, R. Kawahara-Miki, H. Goto, F. Cao, K. Kimura, Y. Monji, T. Kuwayama, H. Iwata

MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT 80 ( 7 ) 508 - 521 2013年7月

記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：WILEY-BLACKWELL

In general, maternal age affects the quality of oocytes and embryos. The present study aimed to examine the features and age-associated gene expression profiles of bovine oocytes and embryos as well as to discover possible countermeasures against age-associated events. Comprehensive gene expression assays of germinal vesicle and metaphase II (MII)-stage oocytes and 8- to 16-cell-stage embryos were conducted using next-generation sequencing technology. The gene expression profiles of aged cows showed high expression of genes related to oxidative phosphorylation, eIF4 and p70S6K signaling, and mitochondrial dysfunction in MII-stage oocytes. Oocytes derived from aged cows, compared with those derived from their younger counterparts, exhibited high levels of abnormal fertilization and blastocysts with low total cell numbers. Levels of reactive oxygen species (ROS) and SIRT1 were higher in in vitro-matured oocytes derived from aged cows than in those derived from their younger counterparts. Supplementation of maturation medium with N-acetyl-cysteine (NAC), but not resveratrol, reduced the levels of ROS in the oocytes derived from cows of both age groups; however, resveratrol, but not NAC, improved the fertilization ratio. Conversely, EX 527, an inhibitor of SIRT1, increased the ratio of abnormal fertilization. In conclusion, gene expression profiles of oocytes and embryos derived from aged cows differ from those of oocytes and embryos derived from young cows; in particular, oocytes derived from aged cows show protein and mitochondrial dysfunction. In addition, activation of SIRT1 in oocytes may be a potential countermeasure against age-associated events in oocytes derived from aged cows. Mol. Reprod. Dev. 80: 508-521, 2013. (c) 2013 Wiley Periodicals, Inc.

DOI： 10.1002/mrd.22187

その他リンク： http://orcid.org/0000-0003-2072-8851

The Promoter of the Oocyte-Specific Gene, Oog1, Functions in Both Male and Female Meiotic Germ Cells in Transgenic Mice 査読

Miya Ishida, Eriko Okazaki, Satoshi Tsukamoto, Koji Kimura, Akira Aizawa, Seiji Kito, Hiroshi Imai, Naojiro Minami

PLOS ONE 8 ( 7 ) e68686 2013年7月

記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）出版者・発行元：PUBLIC LIBRARY SCIENCE

Oog1 is an oocyte-specific gene whose expression is turned on in mouse oocytes at embryonic day (E) 15.5, concomitant with the time when most of the female germ cells stop proliferating and enter meiotic prophase. Here, we characterize the Oog1 promoter, and show that transgenic GFP reporter expression driven by the 2.7 kb and 3.9 kb regions upstream of the Oog1 transcription start site recapitulates the intrinsic Oog1 expression pattern. In addition, the 3.9 kb upstream region exhibits stronger transcriptional activity than does the 2.7 kb region, suggesting that regulatory functions might be conserved in the additional 1.2 kb region found within the 3.9 kb promoter. Interestingly, the longer promoter (3.9 kb) also showed strong activity in male germ cells, from late pachytene spermatocytes to elongated spermatids. This is likely due to the aberrant demethylation of two CpG sites in the proximal promoter region. One was highly methylated in the tissues in which GFP expression was suppressed, and another was completely demethylated only in Oog1pro3.9 male and female germ cells. These results suggest that aberrant demethylation of the proximal promoter region induced ectopic expression in male germ cells under the control of 3.9 kb Oog1 promoter. This is the first report indicating that sex-dependent gene expression is altered according to the length and the methylation status of the promoter region. Additionally, our results show that individual CpG sites are differentially methylated and play different roles in regulating promoter activity and gene transcription.

DOI： 10.1371/journal.pone.0068686

Age-associated changes in gene expression and developmental competence of bovine oocytes, and a possible countermeasure against age-associated events 査読

S. Takeo, R. Kawahara-Miki, H. Goto, F. Cao, K. Kimura, Y. Monji, T. Kuwayama, H. Iwata

Molecular Reproduction and Development 80 ( 7 ) 508 - 521 2013年7月

記述言語：英語掲載種別：研究論文（学術雑誌）

In general, maternal age affects the quality of oocytes and embryos. The present study aimed to examine the features and age-associated gene expression profiles of bovine oocytes and embryos as well as to discover possible countermeasures against age-associated events. Comprehensive gene expression assays of germinal vesicle and metaphase II (MII)-stage oocytes and 8- to 16-cell-stage embryos were conducted using next-generation sequencing technology. The gene expression profiles of aged cows showed high expression of genes related to oxidative phosphorylation, eIF4 and p70S6K signaling, and mitochondrial dysfunction in MII-stage oocytes. Oocytes derived from aged cows, compared with those derived from their younger counterparts, exhibited high levels of abnormal fertilization and blastocysts with low total cell numbers. Levels of reactive oxygen species (ROS) and SIRT1 were higher in in vitro-matured oocytes derived from aged cows than in those derived from their younger counterparts. Supplementation of maturation medium with N-acetyl-cysteine (NAC), but not resveratrol, reduced the levels of ROS in the oocytes derived from cows of both age groups
however, resveratrol, but not NAC, improved the fertilization ratio. Conversely, EX 527, an inhibitor of SIRT1, increased the ratio of abnormal fertilization. In conclusion, gene expression profiles of oocytes and embryos derived from aged cows differ from those of oocytes and embryos derived from young cows
in particular, oocytes derived from aged cows show protein and mitochondrial dysfunction. In addition, activation of SIRT1 in oocytes may be a potential countermeasure against age-associated events in oocytes derived from aged cows. © 2013 Wiley Periodicals, Inc.

DOI： 10.1002/mrd.22187

　前のページ - 次のページ　

1
2
3
4
5
6
7