2021/12/26 更新

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マツシタ オサム
松下 治
MATSUSHITA Osamu
所属
医歯薬学域 教授
職名
教授
外部リンク

学位

  • 医学博士 ( 1988年3月   岡山大学 )

研究キーワード

  • 細菌毒素

  • マトリックス・アンカリング型薬物

  • ドメイン・シャフリング

研究分野

  • ライフサイエンス / 細菌学  / 毒素遺伝子の転写・翻訳レベルでの発現調節機構の解明

  • ライフサイエンス / 応用微生物学  / ドメイン・シャフリングによる新規薬物シーズの研究開発

学歴

  • 岡山大学   Graduate School of Medicine  

    1984年4月 - 1988年3月

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    国名: 日本国

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  • 岡山大学   Medical School   Faculty of Medicine

    1978年4月 - 1984年3月

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    国名: 日本国

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経歴

  • 岡山大学   大学院医歯薬学総合研究科   教授

    2012年4月 - 現在

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    国名:日本国

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  • 北里大学   医学部   教授

    2007年2月 - 2012年3月

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    国名:日本国

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  • 香川大学   医学部   助教授

    2003年10月 - 2007年1月

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  • 香川医科大学   医学部   助教授

    1999年4月 - 2003年9月

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  • 香川医科大学   医学部   助手

    1992年4月 - 1999年3月

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  • 岡山大学   医学部   助手

    1988年4月 - 1992年3月

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所属学協会

委員歴

  • 日本細菌学会   理事  

    2015年1月 - 2018年12月   

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    団体区分:学協会

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  • 岡山県   備前地域感染症診査協議会 委員  

    2013年4月 - 現在   

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    団体区分:自治体

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  • 岡山市   感染症診査協議会 委員(感染症部会長)  

    2013年4月 - 現在   

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    団体区分:自治体

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論文

  • Detection of in-frame mutation by IS30-family insertion sequence in the phospholipid phosphatidylglycerol synthase gene (pgsA2) of high-level daptomycin-resistant Corynebacterium striatum. 査読

    Kazuyoshi Gotoh, I. Putu Bayu Mayura, Yusaku Enomoto, Koji Iio, Osamu Matsushita, Fumio Otsuka, Hideharu Hagiya

    European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases   2021年10月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Springer Science and Business Media LLC  

    DOI: 10.1007/s10096-021-04369-1

    PubMed

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    その他リンク: https://link.springer.com/article/10.1007/s10096-021-04369-1/fulltext.html

  • In vitro effectiveness of biapenem against IMP-producing Enterobacteriaceae. 査読

    Kazuyoshi Gotoh, Makoto Miyoshi, I Putu Bayu Mayura, Koji Iio, Osamu Matsushita, Fumio Otsuka, Hideharu Hagiya

    Journal of Medical Microbiology   70 ( 10 )   2021年10月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Microbiology Society  

    The options available for treating infections with carbapenemase-producing <italic>
    <named-content content-type="family">
    <ext-link xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink" ext-link-type="uri" xlink:href="http://doi.org/10.1601/nm.3091" xlink:type="simple">Enterobacteriaceae</ext-link>
    </named-content>
    </italic> (CPE) are limited; with the increasing threat of these infections, new treatments are urgently needed. Biapenem (BIPM) is a carbapenem, and limited data confirming its <italic>in vitro</italic> killing effect against CPE are available. In this study, we examined the minimum inhibitory concentrations (MICs) and minimum bactericidal concentrations (MBCs) of BIPM for 14 IMP-1-producing <italic>
    <named-content content-type="family">
    <ext-link xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink" ext-link-type="uri" xlink:href="http://doi.org/10.1601/nm.3091" xlink:type="simple">Enterobacteriaceae</ext-link>
    </named-content>
    </italic> strains isolated from the Okayama region in Japan. The MICs against almost all the isolates were lower than 0.5 µg ml−1, indicating susceptibility to BIPM, while approximately half of the isolates were confirmed to be bacteriostatic to BIPM. However, initial killing to a 99.9 % reduction was observed in seven out of eight strains in a time–kill assay. Despite the small data set, we concluded that the <italic>in vitro</italic> efficacy of BIPM suggests that the drug could be a new therapeutic option against infection with IMP-producing CPE.

    DOI: 10.1099/jmm.0.001430

    PubMed

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  • Elizabethkingia anophelis, an emerging pathogen, inhibits RAW 264.7 macrophage function. 査読

    I. Putu Bayu Mayura, Kazuyoshi Gotoh, Hayato Nishimura, Erina Nakai, Takehiko Mima, Yumiko Yamamoto, Kenji Yokota, Osamu Matsushita

    Microbiology and Immunology   65 ( 8 )   317 - 324   2021年8月

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    担当区分:最終著者   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/1348-0421.12888

    PubMed

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    その他リンク: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full-xml/10.1111/1348-0421.12888

  • Serodiagnosis and bacterial genome of Helicobacter pylori infection. 査読

    Aina Ichihara, Hinako Ojima, Kazuyoshi Gotoh, Osamu Matsushita, Susumu Take, Hiroyuki Okada, Akari Watanabe, Kenji Yokota

    Toxins   13 ( 7 )   467 - 467   2021年7月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:MDPI AG  

    The infection caused by Helicobacter pylori is associated with several diseases, including gastric cancer. Several methods for the diagnosis of H. pylori infection exist, including endoscopy, the urea breath test, and the fecal antigen test, which is the serum antibody titer test that is often used since it is a simple and highly sensitive test. In this context, this study aims to find the association between different antibody reactivities and the organization of bacterial genomes. Next-generation sequences were performed to determine the genome sequences of four strains of antigens with different reactivity. The search was performed on the common genes, with the homology analysis conducted using a genome ring and dot plot analysis. The two antigens of the highly reactive strains showed a high gene homology, and Western blots for CagA and VacA also showed high expression levels of proteins. In the poorly responsive antigen strains, it was found that the inversion occurred around the vacA gene in the genome. The structure of bacterial genomes might contribute to the poor reactivity exhibited by the antibodies of patients. In the future, an accurate serodiagnosis could be performed by using a strain with few gene mutations of the antigen used for the antibody titer test of H. pylori.

    DOI: 10.3390/toxins13070467

    PubMed

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  • Antibacterial effects of disulfiram in Helicobacter pylori. 査読

    Tomomi Kobatake, Keiki Ogino, Hiroyuki Sakae, Kazuyoshi Gotoh, Akari Watanabe, Osamu Matsushita, Hiroyuki Okada, Kenji Yokota

    Infection and Drug Resistance   14   1757 - 1764   2021年5月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Informa UK Limited  

    DOI: 10.2147/idr.s299177

    PubMed

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  • Septic pulmonary emboli caused by Tsukamurella inchonensis: A case report. 査読

    Kazuyoshi Gotoh, I Putu Bayu Mayura, Hideharu Hagiya, Kyoichi Obata, Tatsuo Ogawa, Koji Iio, Takumi Fujimori, Fumio Otsuka, Osamu Matsushita

    Journal of Infection and Chemotherapy   27 ( 2 )   369 - 372   2021年2月

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    担当区分:最終著者   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1016/j.jiac.2020.09.024

    PubMed

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  • Environmental survey of methicillin-resistant Staphylococci in a hospital in Japan. 査読

    AKARI WATANABE, TOKIKO WATANABE, SUSUMU KOKEGUCHI, YUMIKO YAMAMOTO, OSAMU MATSUSHITA, KENJI YOKOTA

    Biocontrol Science   26 ( 3 )   137 - 145   2021年

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:The Society for Antibacterial and Antifungal Agents, Japan  

    DOI: 10.4265/bio.26.137

    PubMed

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  • Enhancement of intestinal epithelial barrier function by Weissella confusa F213 and Lactobacillus rhamnosus FBB81 probiotic candidates in an in vitro model of hydrogen peroxide-induced inflammatory bowel disease. 査読

    Ni Nengah Dwi Fatmawati, Kazuyoshi Gotoh, I. Putu Bayu Mayura, Komang Ayu Nocianitri, Gede Ngurah Rsi Suwardana, Ni Luh Gede Yoni Komalasari, Yan Ramona, Masakiyo Sakaguchi, Osamu Matsushita, I. Nengah Sujaya

    BMC Research Notes   13 ( 1 )   489 - 489   2020年12月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Springer Science and Business Media LLC  

    <title>Abstract</title><sec>
    <title>Objective</title>
    <italic>Weissella confusa</italic> F213 (WCF213) and <italic>Lactobacillus rhamnosus</italic> FBB81 (LrFBB81) are two probiotic candidates isolated from humans in our previous study. Their functional activity on the mucosal barrier has not yet been adequately investigated. Therefore, the objective of this study was to investigate the effect of these strains on maintaining mucosal integrity in vitro. Caco-2 cell monolayers were pretreated with WCF213 and LrFBB81 before being exposed to hydrogen peroxide. The integrity of mucosal cells was evaluated by measuring the transepithelial resistance (TER), flux of FITC-labelled dextran, and ZO-1 protein distribution with the help of an immunofluorescence method.


    </sec><sec>
    <title>Results</title>
    WCF213 was found to significantly maintain the TER better than the control hydrogen peroxide-treated cells (<italic>p </italic>&lt; 0.001), followed by the strain combination, and LrFBB81 alone (<italic>p </italic>&lt; 0.05). The permeability of mucosa was also successfully maintained by the WCF213 strain. This was illustrated by the significant reduction in the flux of FITC-labelled dextran (<italic>p </italic>&lt; 0.05), which was larger than that exhibited by the other groups. The ZO-1 distribution of strain-treated cells showed less disruption than hydrogen peroxide-treated cells, consistent with the TER and FITC experimental results. These findings indicate that WCF213 and LrFBB81 plays important roles in the maintenance of mucosal integrity in a strain-dependent manner.


    </sec>

    DOI: 10.1186/s13104-020-05338-1

    PubMed

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    その他リンク: https://link.springer.com/article/10.1186/s13104-020-05338-1/fulltext.html

  • Polyglycolic acid‐collagen tube combined with collagen‐binding basic fibroblast growth factor accelerates gait recovery in a rat sciatic nerve critical‐size defect model. 査読

    Hisako Fujimaki, Kentaro Uchida, Gen Inoue, Osamu Matsushita, Noriko Nemoto, Masayuki Miyagi, Kazuhide Inage, Shotaro Takano, Sumihisa Orita, Seiji Ohtori, Keisuke Tanaka, Hiroyuki Sekiguchi, Masashi Takaso

    Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials   108 ( 2 )   326 - 332   2020年2月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1002/jbm.b.34391

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    その他リンク: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full-xml/10.1002/jbm.b.34391

  • Association of host immunity with Helicobacter pylori infection in recurrent gastric cancer. 査読

    Mayu Sato, Kou Miura, Chihiro Kageyama, Hiroyuki Sakae, Yuka Obayashi, Yoshiro Kawahara, Osamu Matsushita, Kenji Yokota, Hiroyuki Okada

    Infectious Agents and Cancer   14 ( 1 )   2019年12月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Springer Science and Business Media LLC  

    DOI: 10.1186/s13027-019-0221-1

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    その他リンク: http://link.springer.com/article/10.1186/s13027-019-0221-1/fulltext.html

  • Acceleration of bone regeneration of horizontal bone defect in rats using collagen‐binding basic fibroblast growth factor combined with collagen scaffolds. 査読

    Shin Nakamura, Takashi Ito, Kentaro Okamoto, Takehiko Mima, Kentaro Uchida, Yasir D. Siddiqui, Masahiro Ito, Masako Tai, Keisuke Okubo, Keisuke Yamashiro, Kazuhiro Omori, Tadashi Yamamoto, Osamu Matsushita, Shogo Takashiba

    Journal of Periodontology   90 ( 9 )   1043 - 1052   2019年9月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1002/jper.18-0674

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    その他リンク: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full-xml/10.1002/JPER.18-0674

  • Increase in antibiotic resistant Helicobacter pylori in a university hospital in Japan. 査読

    Chihiro Kageyama, Mayu Sato, Hiroyuki Sakae, Yuka Obayashi, Yoshiro Kawahara, Takehiko Mima, Osamu Matsushita, Kenji Yokota, Motowo Mizuno, Hiroyuki Okada

    Infection and Drug Resistance   Volume 12   597 - 602   2019年3月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Informa UK Limited  

    DOI: 10.2147/idr.s196452

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  • Ca2+‐induced orientation of tandem collagen binding domains from clostridial collagenase ColG permits two opposing functions of collagen fibril formation and retardation. 査読

    Perry Caviness, Ryan Bauer, Keisuke Tanaka, Katarzyna Janowska, Jeffrey Randall Roeser, Dawn Harter, Jes Sanders, Christopher Ruth, Osamu Matsushita, Joshua Sakon

    The FEBS Journal   285 ( 17 )   3254 - 3269   2018年9月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/febs.14611

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    その他リンク: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full-xml/10.1111/febs.14611

  • Vibrio alginolyticus VepA induces lysosomal membrane permeability and cathepsin-independent cell death. 査読

    Agus Eka Darwinata, Kazuyoshi Gotoh, Takehiko Mima, Yumiko Yamamoto, Kenji Yokota, Osamu Matsushita

    Acta Medica Okayama   72 ( 3 )   231 - 239   2018年6月

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    担当区分:最終著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The bacterium Vibrio alginolyticus, an opportunistic pathogen in humans, has a type III secretion system (T3SS) that is responsible for its cytotoxicity toward eukaryotic cells. The effector of T3SS that is responsible for the cytotoxicity had not been identified. Here we demonstrate that VepA, a homolog of the T3SS effector in V. parahaemolyticus, is required for cytotoxicity in V. alginolyticus. VepA induces lysosomal membrane permeabilization, and it allows the leakage of only small molecules into the cytosol. Our findings revealed that VepA induces cathepsin-independent cell death in mammalian cells. The ferrous ion, one of the small molecules in the lysosome contents, appears to be involved in the cell death caused by V. alginolyticus VepA.

    DOI: 10.18926/AMO/56068

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  • DEC205 mediates local and systemic immune responses to Helicobacter pylori infection in humans. 査読

    Masahide Kita, Kenji Yokota, Chihiro Kageyama, Susumu Take, Kazuyoshi Goto, Yoshiro Kawahara, Osamu Matsushita, Hiroyuki Okada

    Oncotarget   9 ( 22 )   15828 - 15835   2018年3月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Impact Journals, LLC  

    DOI: 10.18632/oncotarget.24574

    PubMed

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  • Expression of collagenase is regulated by the VarS/VarA two-component regulatory system in Vibrio alginolyticus. 査読

    Takehiko Mima, Kazuyoshi Gotoh, Yumiko Yamamoto, Keiko Maeda, Taku Shirakawa, Shunsuke Matsui, Yumi Murata, Takaki Koide, Hiroshi Tokumitsu, Osamu Matsushita

    The Journal of Membrane Biology   251 ( 1 )   51 - 63   2018年2月

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    担当区分:最終著者   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Springer Science and Business Media LLC  

    DOI: 10.1007/s00232-017-9991-9

    PubMed

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    その他リンク: http://link.springer.com/content/pdf/10.1007/s00232-017-9991-9.pdf

  • Basic fibroblast growth factor fused with tandem collagen-binding domains from Clostridium histolyticum collagenase ColG increases bone formation. 査読

    Hiroyuki Sekiguchi, Kentaro Uchida, Osamu Matsushita, Gen Inoue, Nozomu Nishi, Ryo Masuda, Nana Hamamoto, Takaki Koide, Shintaro Shoji, Masashi Takaso

    BioMed Research International   2018   1 - 8   2018年

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Hindawi Limited  

    Basic fibroblast growth factor 2 (bFGF) accelerates bone formation during fracture healing. Because the efficacy of bFGF decreases rapidly following its diffusion from fracture sites, however, repeated dosing is required to ensure a sustained therapeutic effect. We previously developed a fusion protein comprising bFGF, a polycystic kidney disease domain (PKD; s2b), and collagen-binding domain (CBD; s3) sourced from the<italic> Clostridium histolyticum</italic> class II collagenase, ColH, and reported that the combination of this fusion protein with a collagen-like peptide, poly(Pro-Hyp-Gly)10, induced mesenchymal cell proliferation and callus formation at fracture sites. In addition,<italic> C. histolyticum</italic> produces class I collagenase (ColG) with tandem CBDs (s3a and s3b) at the C-terminus. We therefore hypothesized that a bFGF fusion protein containing ColG-derived tandem CBDs (s3a and s3b) would show enhanced collagen-binding activity, leading to improved bone formation. Here, we examined the binding affinity of four collagen anchors derived from the two clostridial collagenases to H-Gly-Pro-Arg-Gly-(Pro-Hyp-Gly)12-NH2, a collagenous peptide, by surface plasmon resonance and found that tandem CBDs (s3a-s3b) have the highest affinity for the collagenous peptide. We also constructed four fusion proteins consisting of bFGF and s3 (bFGF-s3), s2b-s3b (bFGF-s2b-s3), s3b (bFGF-s3b), and s3a-s3b (bFGF-s3a-s3b) and compared their biological activities to those of a previous fusion construct (bFGF-s2b-s3) using a cell proliferation assay in vitro and a mouse femoral fracture model in vivo. Among these CB-bFGFs, bFGF-s3a-s3b showed the highest capacity to induce mesenchymal cell proliferation and callus formation in the mice fracture model. The poly(Pro-Hyp-Gly)10/bFGF-s3a-s3b construct may therefore have the potential to promote bone formation in clinical settings.

    DOI: 10.1155/2018/8393194

    PubMed

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    その他リンク: http://downloads.hindawi.com/journals/bmri/2018/8393194.xml

  • Effect of freeze-dried allograft bone with human basic fibroblast growth factor containing a collagen-binding domain from Clostridium histolyticum collagenase on bone formation after lumbar posterolateral fusion surgery in rats. 査読

    Gen Inoue, Kentaro Uchida, Osamu Matsushita, Hisako Fujimaki, Wataru Saito, Masayuki Miyagi, Hiroyuki Sekiguchi, Nozomu Nishi, Seiji Ohtori, Mizuki Yogoro, Masashi Takaso

    Spine   42 ( 17 )   E995 - E1001   2017年9月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Ovid Technologies (Wolters Kluwer Health)  

    DOI: 10.1097/brs.0000000000002074

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  • Enhancement of periosteal bone formation by basic fibroblast-derived growth factor containing polycystic kidney disease and collagen-binding domains from Clostridium histolyticum collagenase. 査読

    Kentaro Uchida, Osamu Matsushita, Nozomu Nishi, Gen Inoue, Kyosuke Horikawa, Masashi Takaso

    Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine   11 ( 4 )   1165 - 1172   2017年4月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1002/term.2019

    PubMed

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  • Oriented collagen tubes combined with basic fibroblast growth factor promote peripheral nerve regeneration in a 15 mm sciatic nerve defect rat model. 査読

    Hisako Fujimaki, Kentaro Uchida, Gen Inoue, Masayuki Miyagi, Noriko Nemoto, Taro Saku, Yoshihiro Isobe, Kazuhide Inage, Osamu Matsushita, Saburo Yagishita, Jun Sato, Shotaro Takano, Yoshihiro Sakuma, Seiji Ohtori, Kazuhisa Takahashi, Masashi Takaso

    Journal of Biomedical Materials Research Part A   105 ( 1 )   8 - 14   2017年1月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1002/jbm.a.35866

    PubMed

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  • Basic fibroblast growth factor-anchored multilayered mesenchymal cell sheets accelerate periosteal bone formation. 査読

    Kentaro Uchida, Gen Inoue, Osamu Matsushita, Kyosuke Horikawa, Hiroyuki Sekiguchi, Wataru Saito, Shotaro Takano, Hisako Fujimaki, Masayuki Miyagi, Masashi Takaso

    BioMed Research International   2017   1 - 8   2017年

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Hindawi Limited  

    Cell-based regenerative therapy has the potential to repair bone injuries or large defects that are recalcitrant to conventional treatment methods, including drugs and surgery. Here, we developed a multilayered cell-based bone formation system using cells coated with fibronectin-gelatin (FN-G) nanofilms. The multilayered mesenchymal cells (MLMCs) were formed after two days of culture and were shown to express higher levels of BMP-2 and VEGF compared to monolayer cultures of MCs. The MLMCs were used as a graft material in combination with a fusion protein consisting of basic fibroblast growth factor (bFGF), polycystic kidney disease (PKD) domain, and the collagen-binding domain (CBD) of<italic> Clostridium histolyticum</italic> collagenase. In femur sites grafted with the MLMCs, significantly higher levels of callus volume and bone mineral content were observed compared to the sham controls. The callus volume and bone mineral content were further increased in femur sites grafted with bFGF-PKD-CBD/MLMCs. Taken together, these results suggest that bFGF-PKD-CBD/MLMCs, which can be simply and rapidly generated in vitro, have the potential to promote bone repair when grafted into large defect sites.

    DOI: 10.1155/2017/4371460

    PubMed

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    その他リンク: http://downloads.hindawi.com/journals/bmri/2017/4371460.xml

  • Acceleration of bone formation during fracture healing by poly(Pro-Hyp-Gly)10 and basic fibroblast growth factor containing polycystic kidney disease and collagen-binding domains from Clostridium histolyticum collagenase. 査読

    Hiroyuki Sekiguchi, Kentaro Uchida, Gen Inoue, Osamu Matsushita, Wataru Saito, Jun Aikawa, Keisuke Tanaka, Hisako Fujimaki, Masayuki Miyagi, Masashi Takaso

    Journal of Biomedical Materials Research Part A   104 ( 6 )   1372 - 1378   2016年6月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1002/jbm.a.35670

    PubMed

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  • Acceleration of callus formation during fracture healing using basic fibroblast growth factor-kidney disease domain-collagen-binding domain fusion protein combined with allogenic demineralized bone powder. 査読

    Wataru Saito, Kentaro Uchida, Osamu Matsushita, Gen Inoue, Hiroyuki Sekiguchi, Jun Aikawa, Hisako Fujimaki, Masashi Takaso

    Journal of Orthopaedic Surgery and Research   10 ( 1 )   2015年12月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Springer Science and Business Media LLC  

    DOI: 10.1186/s13018-015-0201-0

    PubMed

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    その他リンク: http://link.springer.com/article/10.1186/s13018-015-0201-0/fulltext.html

  • Cross-excitation in peripheral sensory ganglia associated with pain transmission. 査読

    Katsuhiro Omoto, Kotaro Maruhama, Ryuji Terayama, Yumiko Yamamoto, Osamu Matsushita, Tomosada Sugimoto, Keiji Oguma, Yoshizo Matsuka

    Toxins   7 ( 8 )   2906 - 2917   2015年8月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:MDPI AG  

    DOI: 10.3390/toxins7082906

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  • Structures of three polycystic kidney disease-like domains from Clostridium histolyticum collagenases ColG and ColH. 査読

    Ryan Bauer, Katarzyna Janowska, Kelly Taylor, Brad Jordan, Steve Gann, Tomasz Janowski, Ethan C. Latimer, Osamu Matsushita, Joshua Sakon

    Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography   71 ( 3 )   565 - 577   2015年3月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:International Union of Crystallography (IUCr)  

    <italic>Clostridium histolyticum</italic>collagenases ColG and ColH are segmental enzymes that are thought to be activated by Ca2+-triggered domain reorientation to cause extensive tissue destruction. The collagenases consist of a collagenase module (s1), a variable number of polycystic kidney disease-like (PKD-like) domains (s2a and s2b in ColH and s2 in ColG) and a variable number of collagen-binding domains (s3 in ColH and s3a and s3b in ColG). The X-ray crystal structures of Ca2+-bound holo s2b (1.4 Å resolution,<italic>R</italic>= 15.0%,<italic>R</italic>free= 19.1%) and holo s2a (1.9 Å resolution,<italic>R</italic>= 16.3%,<italic>R</italic>free= 20.7%), as well as of Ca2+-free apo s2a (1.8 Å resolution,<italic>R</italic>= 20.7%,<italic>R</italic>free= 27.2%) and two new forms of N-terminally truncated apo s2 (1.4 Å resolution,<italic>R</italic>= 16.9%,<italic>R</italic>free= 21.2%; 1.6 Å resolution,<italic>R</italic>= 16.2%,<italic>R</italic>free= 19.2%), are reported. The structurally similar PKD-like domains resemble the V-set Ig fold. In addition to a conserved β-bulge, the PKD-like domains feature a second bulge that also changes the allegiance of the subsequent β-strand. This β-bulge and the genesis of a Ca2+pocket in the archaeal PKD-like domain suggest a close kinship between bacterial and archaeal PKD-like domains. Different surface properties and indications of different dynamics suggest unique roles for the PKD-like domains in ColG and in ColH. Surface aromatic residues found on ColH s2a-s2b, but not on ColG s2, may provide the weak interaction in the biphasic collagen-binding mode previously found in s2b-s3.<italic>B</italic>-factor analyses suggest that in the presence of Ca2+the midsection of s2 becomes more flexible but the midsections of s2a and s2b stay rigid. The different surface properties and dynamics of the domains suggest that the PKD-like domains of M9B bacterial collagenase can be grouped into either a ColG subset or a ColH subset. The conserved properties of PKD-like domains in ColG and in ColH include Ca2+binding. Conserved residues not only interact with Ca2+, but also position the Ca2+-interacting water molecule. Ca2+aligns the N-terminal linker approximately parallel to the major axis of the domain. Ca2+binding also increases stability against heat and guanidine hydrochloride, and may improve the longevity in the extracellular matrix. The results of this study will further assist in developing collagen-targeting vehicles for various signal molecules.

    DOI: 10.1107/s1399004714027722

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  • [A study to determine the optimum antigens for the serodiagnosis of Helicobacter pylori infection in Japanese patients and the association with IgG subclass and gastric cancer]. 査読

    Masahide Kita, Susumu Take, Hiroyuki Okada, Osamu Matsushita, Kenji Yokota

    Rinsho byori. The Japanese Journal of Clinical Pathology   63 ( 2 )   180 - 186   2015年2月

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    記述言語:日本語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Atrophic gastritis is caused by Helicobacter pylori infection, and is involved in gastric cancer. In this study, we investigated the association with total IgG and IgG subclass antibodies using several strains isolated from Japanese in H. pylori positive and negative individuals, and gastric atrophy using measuring pepsinogen I and II levels. We found that total IgG antibody measurement using typical Japanese genotype as an antigen was available for diagnosis of H. pylori infection, whereas IgG1 and IgG2 antibodies were not for diagnosis. Furthermore, the IgG1/G2 ratio was elevated in a patient with gastric cancer. The accuracy of serodiagnosis of H. pylori infection may increase when the optimal antigens are used, and measurement IgG subclass may provide additional prediction of gastric cancer.

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  • Acceleration of bone formation during fracture healing by injectable collagen powder and human basic fibroblast growth factor containing a collagen-binding domain from Clostridium histolyticum collagenase. 査読

    Wataru Saito, Kentaro Uchida, Masaki Ueno, Osamu Matsushita, Gen Inoue, Nozomu Nishi, Takayuki Ogura, Shunji Hattori, Hisako Fujimaki, Keisuke Tanaka, Masashi Takaso

    Journal of Biomedical Materials Research Part A   102 ( 9 )   3049 - 3055   2014年9月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1002/jbm.a.34974

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  • Direct cytocidal effect of galectin-9 localized on collagen matrices on human immune cell lines. 査読

    Youko Fukata, Aiko Itoh, Yasuhiro Nonaka, Takashi Ogawa, Takanori Nakamura, Osamu Matsushita, Nozomu Nishi

    Biochimica et Biophysica Acta (BBA)   1840 ( 6 )   1892 - 1901   2014年6月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1016/j.bbagen.2014.01.019

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  • Acceleration of periosteal bone formation by human basic fibroblast growth factor containing a collagen‐binding domain from Clostridium histolyticum collagenase. 査読

    Kentaro Uchida, Osamu Matsushita, Kouji Naruse, Takehiko Mima, Nozomu Nishi, Shunji Hattori, Takayuki Ogura, Gen Inoue, Keisuke Tanaka, Masashi Takaso

    Journal of Biomedical Materials Research Part A   102 ( 6 )   1737 - 1743   2014年6月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1002/jbm.a.34841

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    その他リンク: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full-xml/10.1002/jbm.a.34841

  • Acceleration of bone union after structural bone grafts with a collagen-binding basic fibroblast growth factor anchored-collagen sheet for critical-size bone defects. 査読

    Masaki Ueno, Kentaro Uchida, Wataru Saito, Osamu Matsushita, Mizuki Yogoro, Nozomu Nishi, Takayuki Ogura, Shunji Hattori, Gen Inoue, Keisuke Tanaka, Naonobu Takahira, Masashi Takaso

    Biomedical Materials   9 ( 3 )   035014 - 035014   2014年5月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:IOP Publishing  

    DOI: 10.1088/1748-6041/9/3/035014

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    その他リンク: https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1748-6041/9/3/035014

  • Treatment and prevention of chemotherapy-induced alopecia with PTH-CBD, a collagen-targeted parathyroid hormone analog, in a non-depilated mouse model. 査読

    Ranjitha Katikaneni, Tulasi Ponnapakkam, Osamu Matsushita, Joshua Sakon, Robert Gensure

    Anti-Cancer Drugs   25 ( 1 )   30 - 38   2014年1月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Ovid Technologies (Wolters Kluwer Health)  

    DOI: 10.1097/cad.0b013e3283650bff

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  • Cellular responses to Staphylococcus aureus alpha-toxin in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. 査読

    Mitsuhiro Okano, Tazuko Fujiwara, Shin Kariya, Takaya Higaki, Takenori Haruna, Osamu Matsushita, Yohei Noda, Seiichiro Makihara, Kengo Kanai, Yasuyuki Noyama, Masami Taniguchi, Kazunori Nishizaki

    Allergology International   63 ( 4 )   563 - 573   2014年

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Japanese Society of Allergology  

    DOI: 10.2332/allergolint.14-oa-0703

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  • The genetic diversity of Helicobacter pylori virulence genes is not associated with gastric atrophy progression. 査読

    Kita Masahide, Yokota Kenji, Okada Hiroyuki, Take Susumu, Takenaka Ryuta, Kawahara Yoshiro, Oguma Keiji, Matsushita Osamu, Yamamoto Kazuhide

    Acta Medica Okayama   67 ( 2 )   93 - 98   2013年4月

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    記述言語:英語   出版者・発行元:Okayama University Medical School  

    Atrophy of the gastric mucosa is a precursor of intestinal-type gastric cancer, and Helicobacter pylori infection causes atrophic gastritis. The aim of this study was to determine whether the genetic diversity of H. pylori virulence genes is associated with the development and progression of gastric atrophy in humans. We isolated and cultured H. pylori strains from patients with gastric ulcer and duodenal ulcer accompanied by atrophic gastritis in background mucosa. H. pylori strains were stored at -80℃ prior to the experiments being carried out. We analyzed iceA, babA, vacA, cagA, and cagE genes by PCR. The cagA gene was analyzed through sequencing of the C-terminal region containing the EPIYA motif, which is related to tyrosine phosphorylation. Severe atrophy was observed in patients with gastric ulcer. The major phenotype of the vacA gene was s1c/m1 (93オ). The cagA gene was detected in all strains. The cagE gene was not detected in 2 and 5 strains from the mild cases and severe cases, respectively. The major cagA EPIYA motif, which is amino acids repeat in the C terminus, was the A-B-D type (44 of 58 strains). The virulence genes were not statistically associated with the severity of atrophy in the background gastric mucosa in humans. Not only identification of bacterial virulence factors but also studies of the host response will be necessary to investigate the progression of gastric atrophy and subsequent cancer development in humans.

    DOI: 10.18926/AMO/49667

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    CiNii Article

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    その他リンク: http://search.jamas.or.jp/link/ui/2014027956

  • Effects of CB-VEGF-A injection in rat flap models for improved survival. 査読

    Minekatsu Akimoto, Akira Takeda, Osamu Matsushita, Joe Inoue, Keiko Sakamoto, Masakazu Hattori, Natsuko Kounoike, Eiju Uchinuma

    Plastic and Reconstructive Surgery   131 ( 4 )   717 - 725   2013年4月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Ovid Technologies (Wolters Kluwer Health)  

    DOI: 10.1097/prs.0b013e3182818b34

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  • Phospholipase C Produced by Clostridium botulinum types C and D: Comparison of gene, enzymatic, and biological activities with those of Clostridium perfringens alpha-toxin. 査読

    Fatmawati Ni Nengah Dwi, Sakaguchi Yoshihiko, Suzuki Tomonori, Oda Masataka, Shimizu Kenta, Yamamoto Yumiko, Sakurai Jun, Matsushita Osamu, Oguma Keiji

    Acta Medica Okayama   67 ( 1 )   9 - 18   2013年2月

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    記述言語:英語   出版者・発行元:Okayama University Medical School  

    Clostridium botulinum type C and D strains recently have been found to produce PLC on egg yolk agar plates. To characterize the gene, enzymatic and biological activities of C. botulinum PLCs (Cb-PLCs), the cb-plc genes from 8 strains were sequenced, and 1 representative gene was cloned and expressed as a recombinant protein. The enzymatic and hemolytic activities of the recombinant Cb-PLC were measured and compared with those of the Clostridium perfringens alpha-toxin. Each of the eight cb-plc genes encoded a 399 amino acid residue protein preceded by a 27 residue signal peptide. The protein consists of 2 domains, the N- and C-domains, and the overall amino acid sequence identity between Cb-PLC and alpha-toxin was greater than 50%, suggesting that Cb-PLC is homologous to the alpha-toxin. The key residues in the N-domain were conserved, whereas those in the C-domain which are important in membrane interaction were different than in the alpha-toxin. As expected, Cb-PLC could hydrolyze egg yolk phospholipid, p-nitrophenylphosphorylcholine, and sphingomyelin, and also exhibited hemolytic activity;however, its activities were about 4- to over 200-fold lower than those of alpha-toxin. Although Cb-PLC showed weak enzymatic and biological activities, it is speculated that Cb-PLC might play a role in the pathogenicity of botulism or for bacterial survival.

    DOI: 10.18926/AMO/49252

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    CiNii Article

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    その他リンク: http://search.jamas.or.jp/link/ui/2013249132

  • Structural comparison of ColH and ColG collagen-binding domains from Clostridium histolyticum. 査読

    Ryan Bauer, Jeffrey J. Wilson, Sagaya Theresa Leena Philominathan, Dan Davis, Osamu Matsushita, Joshua Sakon

    Journal of Bacteriology   195 ( 2 )   318 - 327   2013年1月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    <title>ABSTRACT</title>

    <named-content xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink" content-type="genus-species" xlink:type="simple">Clostridium histolyticum</named-content>
    secretes collagenases, ColG and ColH, that cause extensive tissue destruction in myonecrosis. The C-terminal collagen-binding domain (CBD) of collagenase is required for insoluble collagen fibril binding and subsequent collagenolysis. The high-resolution crystal structures of ColG-CBD (s3b) and ColH-CBD (s3) are reported in this paper. The new X-ray structure of s3 was solved at 2.0-Å resolution (
    <italic>R</italic>
    = 17.4%;
    <italic>R</italic>
    free
    = 23.3%), while the resolution of the previously determined s3b was extended to 1.4 Å (
    <italic>R</italic>
    = 17.9%;
    <italic>R</italic>
    free
    = 21.0%). Despite sharing only 30% sequence identity, the molecules resemble one another closely (root mean square deviation [RMSD] C
    α
    = 1.5 Å). All but one residue, whose side chain chelates with Ca
    2+
    , are conserved. The dual Ca
    2+
    binding site in s3 is completed by an unconserved aspartate. Differential scanning calorimetric measurements showed that s3 gains thermal stability, comparable to s3b, by binding to Ca
    2+
    (
    <italic>holo</italic>
    <italic>
    T
    m
    </italic>
    = 94.1°C;
    <italic>apo</italic>
    <italic>
    T
    m
    </italic>
    = 70.2°C).
    <italic>holo</italic>
    s3 is also stabilized against chemical denaturants urea and guanidine HCl. The three most critical residues for collagen interaction in s3b are conserved in s3. The general shape of the binding pocket is retained by altered loop structures and side chain positions. Small-angle X-ray scattering data revealed that s3 also binds asymmetrically to minicollagen. Besides the calcium-binding sites and the collagen-binding pocket, architecturally important hydrophobic residues and the hydrogen-bonding network around the
    <italic>cis</italic>
    -peptide bond are well conserved within the metallopeptidase subfamily M9B. CBDs were previously shown to bind to the extracellular matrix of various tissues. Compactness and extreme stability in physiological Ca
    2+
    concentration possibly make both CBDs suitable for targeted growth factor delivery.

    DOI: 10.1128/jb.00010-12

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  • Bacterial collagen-binding domain targets undertwisted regions of collagen. 査読

    Sagaya Theresa Leena Philominathan, Takaki Koide, Osamu Matsushita, Joshua Sakon

    Protein Science   21 ( 10 )   1554 - 1565   2012年10月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1002/pro.2145

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  • Treatment for chemotherapy-induced alopecia in mice using parathyroid hormone agonists and antagonists linked to a collagen binding domain. 査読

    Ranjitha Katikaneni, Tulasi Ponnapakkam, Hirofumi Suda, Shigeru Miyata, Joshua Sakon, Osamu Matsushita, Robert C. Gensure

    International Journal of Cancer   131 ( 5 )   E813 - E821   2012年9月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1002/ijc.27379

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  • A Single Injection of the anabolic bone agent, parathyroid hormone–collagen binding domain (PTH–CBD), results in sustained increases in bone mineral density for up to 12 months in normal female mice. 査読

    Tulasi Ponnapakkam, Ranjitha Katikaneni, Hirofumi Suda, Shigeru Miyata, Osamu Matsushita, Joshua Sakon, Robert C. Gensure

    Calcified Tissue International   91 ( 3 )   196 - 203   2012年9月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Springer Science and Business Media LLC  

    DOI: 10.1007/s00223-012-9626-1

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    その他リンク: http://link.springer.com/article/10.1007/s00223-012-9626-1/fulltext.html

  • Probing the 3-D structure, dynamics, and stability of bacterial collagenase collagen binding domain (apo- versus holo-) by limited proteolysis MALDI-TOF MS. 査読

    Cynthia R. Sides, Rohana Liyanage, Jackson O. Lay, Sagaya Theresa Leena Philominathan, Osamu Matsushita, Joshua Sakon

    Journal of the American Society for Mass Spectrometry   23 ( 3 )   505 - 519   2012年3月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Chemical Society (ACS)  

    DOI: 10.1007/s13361-011-0309-3

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    その他リンク: http://link.springer.com/article/10.1007/s13361-011-0309-3/fulltext.html

  • Prevention of chemotherapy-induced osteoporosis by cyclophosphamide with a long-acting form of parathyroid hormone. 査読

    T Ponnapakkam, R Katikaneni, T Nichols, G Tobin, J Sakon, O Matsushita, R C Gensure

    Journal of endocrinological investigation   34 ( 11 )   e392 - e397   2011年12月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

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  • Identification of a novel virulence factor in Clostridium difficile that modulates toxin sensitivity of cultured epithelial cells. 査読 国際誌

    Masashi Miura, Haru Kato, Osamu Matsushita

    Infection and immunity   79 ( 9 )   3810 - 20   2011年9月

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    担当区分:最終著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Two glucosylating toxins named toxins A and B play a role in the pathogenesis of Clostridium Difficile infection. The interaction of the toxins with host cell factors proceeds to downstream stages of cytotoxic effects in cells, in which involvement of other C. difficile factors remains unknown. We utilized culture filtrate of C. difficile with a low dilution to characterize the influence of putative minor proteins on the organization of the actin cytoskeleton in cultured epithelial cells and found a previously uncharacterized F-actin aggregated structure, termed "actin aggregate," at the juxtanuclear region. We reasoned that formation of actin aggregate was due to an additional factor(s) in the culture filtrate rather than the glucosylating toxins, because treatment of purified toxins rarely caused actin aggregate in cells. We focused on a previously uncharacterized hypothetical protein harboring a KDEL-like sequence as a candidate. The product of the candidate gene was detected in culture filtrate of C. difficile ATCC 9689 and was renamed Srl. Purified glutathione S-transferase-tagged Srl triggered formation of actin aggregate in the cells in the presence of either toxin A or B and enhanced cytotoxicity of each of the two toxins, including decreases in both cell viability and transepithelial resistance of cultured epithelial monolayer, although the recombinant Srl alone did not show detectable cytotoxicity. Srl-neutralized culture filtrate partially inhibited morphological changes of the cells in parallel with decreased actin aggregate formation in the cells. Thus, Srl might contribute to the modulation of toxin sensitivity of intestinal epithelial cells by enhancing cytotoxicity of C. difficile toxins.

    DOI: 10.1128/IAI.00051-11

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  • Monthly administration of a novel PTH-collagen binding domain fusion protein is anabolic in mice. 査読

    Tulasi Ponnapakkam, R. Katikaneni, E. Miller, A. Ponnapakkam, S. Hirofumi, S. Miyata, L. J. Suva, J. Sakon, O. Matsushita, R. C. Gensure

    Calcified Tissue International   88 ( 6 )   511 - 520   2011年6月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Springer Science and Business Media LLC  

    DOI: 10.1007/s00223-011-9485-1

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    その他リンク: http://link.springer.com/article/10.1007/s00223-011-9485-1/fulltext.html

  • Development of a high-throughput screening system for the compounds that inhibit collagen–protein interactions. 査読

    Hitomi Okano-Kosugi, Osamu Matsushita, Shinichi Asada, Andrew B. Herr, Kouki Kitagawa, Takaki Koide

    Analytical Biochemistry   394 ( 1 )   125 - 131   2009年11月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1016/j.ab.2009.07.017

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  • Ca2+-induced linker transformation leads to a compact and rigid collagen-binding domain of Clostridium histolyticum collagenase. 査読

    Sagaya T. L. Philominathan, Osamu Matsushita, Robert Gensure, Joshua Sakon

    FEBS Journal   276 ( 13 )   3589 - 3601   2009年6月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/j.1742-4658.2009.07078.x

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  • Unidirectional binding of clostridial collagenase to triple helical substrates. 査読

    Sagaya Theresa Leena Philominathan, Takaki Koide, Kentaro Hamada, Hiroyuki Yasui, Soenke Seifert, Osamu Matsushita, Joshua Sakon

    Journal of Biological Chemistry   284 ( 16 )   10868 - 10876   2009年4月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1074/jbc.m807684200

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  • 1H, 13C and 15N resonance assignments of Ca2+ bound collagen-binding domain derived from a clostridial collagenase. 査読

    Sagaya Theresa Leena Philominathan, Osamu Matsushita, John Brad Jordan, Joshua Sakon

    Biomolecular NMR Assignments   2 ( 2 )   127 - 129   2008年12月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Springer Science and Business Media LLC  

    DOI: 10.1007/s12104-008-9102-z

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    その他リンク: http://link.springer.com/article/10.1007/s12104-008-9102-z/fulltext.html

  • [Behavioral approach to facilitate appropriate use of antibiotics]. 招待

    Osamu Matsushita, Kazuko Higuchi, Noriko Ishii, Kiyoshi Negayama, Tomohiko Taminato

    Rinsho byori. The Japanese journal of clinical pathology   56 ( 11 )   994 - 1006   2008年11月

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    担当区分:筆頭著者   記述言語:日本語   掲載種別:研究論文(研究会,シンポジウム資料等)  

    Many hospitals have infection control education programs to facilitate the appropriate use of antimicrobial agents. Even with these efforts, however, it is not rare to encounter irregular prescriptions. In order to solve this discrepancy between knowledge and actual behavior, we chose an alternative approach to improve the decision making process. Recent advances in information technology have made it possible to not only instantly integrate various bacterial examination results using a computer, but to simultaneously carry out the statistical analyses at a much lower cost. We employed a client-server system to accomplish these tasks in Kagawa University Hospital. By connecting CCD camera-equipped microscopes to the system directly, image uploading has become a single-clicking job. Various microbial examination data were automatically transferred to the system once they became available in analytical devices such as BacT/ALERT 3D, VITEK, and an MIC analyzer. These data were presented to hospital doctors in well-designed web windows without delay. By removing psychological barriers to access laboratory examination data, statistics, and relevant information, more doctors seemed to independently follow scientific processes to choose antimicrobial agents. The daily behavior of hospital doctors has also been influenced by the system, e. g., pasting the microscopic images onto clinical records, or starting Gram staining in their own wards. These subtle but fundamental changes will eventually alter the way they make prescription decisions. The computer system was also useful for the infection control team to monitor and detect nosocomial infections, which has become essential to carry out its daily activities.

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  • High-level expression of his-tagged clostridial collagenase in Clostridium perfringens. 査読 国際誌

    Eiji Tamai, Shigeru Miyata, Hiroaki Tanaka, Hirofumi Nariya, Motoo Suzuki, Osamu Matsushita, Naoya Hatano, Akinobu Okabe

    Applied microbiology and biotechnology   80 ( 4 )   627 - 35   2008年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Springer Nature  

    Clostridium histolyticum collagenase is used to isolate cells from various organs and tissues for tissue engineering, and also to treat destructive fibrosis; thus, the demand for high-grade enzyme preparations is increasing. In this study, we constructed a plasmid encoding C. histolyticum type II collagenase (ColH) with a C-terminal hexahistidine tag (ColH-his) to facilitate the purification of the enzyme through immobilized metal affinity chromatography (IMAC). When ColH-his was expressed in a protease-deficient mutant of Clostridium perfringens, it was produced in the culture supernatant more efficiently than the untagged ColH. ColH-his exhibited the same hydrolytic activity as ColH against 4-phenylazobenzyloxy-carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg (Pz peptide), a synthetic collagenase substrate. From 100 ml of the culture supernatant, approximately 1 mg of ColH-his was purified by ammonium sulfate precipitation, IMAC, and high-performance liquid chromatography on a MonoQ column. When IMAC was performed on chelating Sepharose charged with Zn(2+) instead of Ni(2+), a potential carcinogenic metal, the specific activities against Pz peptide and type I collagen decreased slightly. However, they were comparable to those reported for other recombinant ColHs and a commercial C. histolyticum collagenase preparation, suggesting that this expression system is useful for large-scale preparation of high-grade clostridial collagenases.

    DOI: 10.1007/s00253-008-1592-1

    PubMed

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  • [Optimum preparation of levocarnitine chloride solution in the hospital pharmacy.] 査読

    Hiroaki TANAKA, Masato ASAKURA, Chiaki DOI, Noriyasu FUKUOKA, Eiji TAMAI, Shigeru MIYATA, Osamu MATSUSHITA, Akinobu OKABE, Kiyoshi NEGAYAMA, Hitoshi HOUCHI

    YAKUGAKU ZASSHI   126 ( 9 )   805 - 809   2006年9月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Pharmaceutical Society of Japan  

    DOI: 10.1248/yakushi.126.805

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  • Changes in ganglioside content affect the binding of Clostridium perfringens epsilon-toxin to detergent-resistant membranes of Madin-Darby canine kidney cells. 査読

    Seiko Shimamoto, Eiji Tamai, Osamu Matsushita, Junzaburo Minami, Akinobu Okabe, Shigeru Miyata

    Microbiology and Immunology   49 ( 3 )   245 - 253   2005年3月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/j.1348-0421.2005.tb03726.x

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  • High-level expression of clostridial sialidase using a ferredoxin gene promoter-based plasmid. 査読 国際誌

    A Takamizawa, S Miyata, O Matsushita, M Kaji, Y Taniguchi, E Tamai, S Shimamoto, A Okabe

    Protein Expression And Purification   36 ( 1 )   70 - 75   2004年7月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ACADEMIC PRESS INC ELSEVIER SCIENCE  

    A "large" sialidase isozyme (NanI) from Clostridium perfringens is a representative microbial sialidase with broad substrate specificity, being used for the analysis of sialoglycoconjugates. It is also a possible virulence factor. However, purification of the native enzyme in a large quantity is not practical due to its low productivity. To obtain the enzyme in a satisfactory yield, a gene encoding the NanI was transcriptionally fused to the fdx gene promoter (P-fdx) in a shuttle-vector, pFF, and transformed into C perfringens 13. The resultant strain released the enzyme into the culture medium, as the original strain does. The enzyme activity increased during the first 6 h of culture and thereafter remained at maximal levels. The maximal activity was approximately 3000-fold compared with that of the original strain, and 15-fold compared with that of recombinant Escherichia coli, which possesses extra copies of the tRNA gene for selected rare codons. This suggests the usefulness of a P-fdx-based plasmid for expressing AT-rich genes in C perfringens. The enzyme was successfully purified by two-step procedure with a specific activity of 2860 U/mg using 2'-(4-methylumbelliferyl)-alpha-D-N-acetylneuraminic acid and a yield of 1.69 mg of NanI per 100 ml of culture. The method described here can facilitate purification of NanI in enough quality and quantity to analyze the role of sialoglycoconjugates in cells and the pathogenic importance of NanI sialidase. (C) 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.

    DOI: 10.1016/j.pep.2004.03.004

    Web of Science

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  • A novel type of DNA curvature present in a Clostridium perfringens ferredoxin gene: characterization and role in gene expression. 査読 国際誌

    Masato Kaji, Osamu Matsushita, Eiji Tamai, Shigeru Miyata, Yuki Taniguchi, Seiko Shimamoto, Seiichi Katayama, Shushi Morita, Akinobu Okabe

    Microbiology (Reading, England)   149 ( Pt 11 )   3083 - 3091   2003年11月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    This study has revealed that a Clostridium perfringens ferredoxin gene (per-fdx) possesses a novel type of DNA curvature, which is formed by five phased A-tracts extending from upstream to downstream of the -35 region. The three A-tracts upstream of the promoter and the two within the promoter are located at the positions corresponding to A-tracts present in a C. perfringens phospholipase C gene (plc) and a Clostridium pasteurianum ferredoxin gene (pas-fdx), respectively. DNA fragments of the per-fdx, pas-fdx and plc genes (nucleotide positions -69 to +1 relative to the transcription initiation site) were fused to a chloramphenicol acetyltransferase reporter gene on a plasmid, pPSV, and their in vivo promoter activities were examined by assaying the chloramphenicol acetyltransferase activity of each C. perfringens transformant. Comparison of the three constructs showed that the order of promoter activity is, in descending order, per-fdx, pas-fdx and plc. Deletion of the three upstream A-tracts of the per-fdx gene drastically decreased the promoter activity, as demonstrated previously for the plc promoter. Substitution of the most downstream A-tract decreased the promoter activities of the per-fdx and pas-fdx genes. These results indicate that not only the phased A-tracts upstream of the promoter but also those within the promoter stimulate the promoter activity, and suggest that the high activity of the per-fdx promoter is due to the combined effects of these two types of A-tracts.

    DOI: 10.1099/mic.0.26503-0

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  • Accumulation of Clostridium perfringens epsilon-toxin in the mouse kidney and its possible biological significance. 査読 国際誌

    Eiji Tamai, Tetsuya Ishida, Shigeru Miyata, Osamu Matsushita, Hirofumi Suda, Shoji Kobayashi, Hiroshi Sonobe, Akinobu Okabe

    Infection and immunity   71 ( 9 )   5371 - 5   2003年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    In this paper we show that Clostridium perfringens epsilon-toxin accumulates predominantly in the mouse kidney, where it is distributed mainly in glomeruli, capillaries, and collecting ducts. Although some pycnotic and exfoliated epithelial cells were observed in distal tubuli and collecting ducts, there were no findings indicative of severe renal injury. Bilateral nephrectomy increased the mouse lethality of the toxin, suggesting that the kidney contributes to the host defense against the lethal toxicity of epsilon-toxin.

    DOI: 10.1128/IAI.71.9.5371-5375.2003

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  • A bacterial collagen-binding domain with novel calcium-binding motif controls domain orientation. 査読

    Wilson JJ, Matsushita O, Okabe A, Sakon J

    The EMBO Journal   22 ( 8 )   1743 - 1752   2003年4月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1093/emboj/cdg172

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  • Dual-site recognition of different extracellular matrix components by anti-angiogenic/neurotrophic serpin, PEDF. 査読

    Norihisa Yasui, Terumi Mori, Daisuke Morito, Osamu Matsushita, Hiroki Kourai, Kazuhiro Nagata, Takaki Koide

    Biochemistry   42 ( 11 )   3160 - 3167   2003年3月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Chemical Society (ACS)  

    DOI: 10.1021/bi0206558

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  • Clostridium perfringens ε-toxin forms a heptameric pore within the detergent-insoluble microdomains of Madin-Darby canine kidney cells and rat synaptosomes. 査読

    Shigeru Miyata, Junzaburo Minami, Eiji Tamai, Osamu Matsushita, Seiko Shimamoto, Akinobu Okabe

    Journal of Biological Chemistry   277 ( 42 )   39463 - 39468   2002年10月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1074/jbc.m206731200

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  • Phased A-tracts bind to the α subunit of RNA polymerase with increased affinity at low temperature. 査読

    Seiichi Katayama, Osamu Matsushita, Eiji Tamai, Shigeru Miyata, Akinobu Okabe

    FEBS Letters   509 ( 2 )   235 - 238   2001年12月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1016/s0014-5793(01)03148-9

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  • Cleavage of a C-terminal peptide Is essential for heptamerization of Clostridium perfringens ε-Toxin in the synaptosomal membrane. 査読

    Shigeru Miyata, Osamu Matsushita, Junzaburo Minami, Seiichi Katayama, Seiko Shimamoto, Akinobu Okabe

    Journal of Biological Chemistry   276 ( 17 )   13778 - 13783   2001年4月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1074/jbc.m011527200

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  • Substrate Recognition by the Collagen-binding Domain of Clostridium histolyticum Class I Collagenase 査読

    Osamu Matsushita, Takaki Koide, Ryoji Kobayashi, Kazuhiro Nagata, Akinobu Okabe

    Journal of Biological Chemistry   276 ( 12 )   8761 - 8770   2001年3月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1074/jbc.m003450200

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  • Collagen-binding domain of a Clostridium histolyticum collagenase exhibits a broad substrate spectrum both in vitro and in vivo. 査読

    T Toyoshima, O Matsushita, J Minami, N Nishi, A Okabe, T Itano

    Connective Tissue Research   42 ( 4 )   281 - +   2001年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:GORDON BREACH PUBLISHING, TAYLOR & FRANCIS GROUP  

    The substrate spectrum of the tandem collagen-binding domain (CBD) of Clostridium histolyticumclass I collagenase (ColG) was examined both in vitro and in vivo. CBD bound to insoluble type I. II, III and IV collagens in vitro, and to skin, aorta, tendon, kidney, trachea and corneal tissues containing various types of collagen fibrils or sheets. CBD bound to all kinds of collagen fibrils regardless of their diameters and also bound to sheet-forming collagen in the glomerular basal lamina or Descemet's membrane of the cornea. This wide substrate spectrum expands possible applications of the drug delivery system we proposed previously (PNAS 95:7018-7023, 1998). Therapeutic agents fused with CBD will bind not only to subcutaneous tissues, but also to other tissues containing non-type I collagen.

    Web of Science

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  • Construction and virulence testing of a collagenase mutant of Clostridium perfringens. 査読

    Milena M Awad, Darren M Ellemor, Amy E Bryant, Osamu Matsushita, Richard L Boyd, Dennis L Stevens, John J Emmins, Julian I Rood

    Microbial Pathogenesis   28 ( 2 )   107 - 117   2000年2月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1006/mpat.1999.0328

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  • Analysis of genes involved in nitrate reduction in Clostridium perfringens. 査読

    Katsuyo Fujinaga, Yuki Taniguchi, Yezhou Sun, Seiichi Katayama, Junzaburo Minami, Osamu Matsushita, Akinobu Okabe

    Microbiology   145 ( 12 )   3377 - 3387   1999年12月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Microbiology Society  

    DOI: 10.1099/00221287-145-12-3377

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  • The hydA gene encoding the H2-evolving hydrogenase of Clostridium perfringens: molecular characterization and expression of the gene. 査読

    Masato Kaji, Yuki Taniguchi, Osamu Matsushita, Seiichi Katayama, Shigeru Miyata, Shushi Morita, Akinobu Okabe

    FEMS Microbiology Letters   181 ( 2 )   329 - 336   1999年12月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Oxford University Press (OUP)  

    DOI: 10.1111/j.1574-6968.1999.tb08863.x

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  • A Clostridium perfringens hem gene cluster contains a cysGB homologue that is Involved in cobalamin biosynthesis. 査読

    Michio Koyama, Seiichi Katayama, Masato Kaji, Yuki Taniguchi, Osamu Matsushita, Junzaburo Minami, Shushi Morita, Akinobu Okabe

    Microbiology and Immunology   43 ( 10 )   947 - 957   1999年10月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/j.1348-0421.1999.tb03355.x

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  • Promoter upstream bent DNA activates the transcription of the Clostridium perfringens phospholipase C gene in a low temperature-dependent manner. 査読

    Katayama S, Matsushita O, Jung CM, Minami J, Okabe A

    The EMBO Journal   18 ( 12 )   3442 - 3450   1999年6月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1093/emboj/18.12.3442

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  • Purification of bovine S100A12 from recombinant Escherichia coli. 査読

    Kayoko Yamashita, Yuhta Oyama, Tsuyoshi Shishibori, Osamu Matsushita, Akinobu Okabe, Ryoji Kobayashi

    Protein Expression and Purification   16 ( 1 )   47 - 52   1999年6月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1006/prep.1998.1026

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  • Identification of metal ligands in the Clostridium histolyticum ColH collagenase. 査読

    Chang-Min Jung, Osamu Matsushita, Seiichi Katayama, Junzaburo Minami, Jun Sakurai, Akinobu Okabe

    Journal of Bacteriology   181 ( 9 )   2816 - 2822   1999年5月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    <title>ABSTRACT</title>

    A
    <italic>Clostridium histolyticum</italic>
    116-kDa collagenase has an H
    415
    EXXH motif but not the third zinc ligand, as found in already characterized zinc metalloproteinases. To identify its catalytic site, we mutated the codons corresponding to the three conserved residues in the motif to other amino acid residues. The mutation affecting His
    415
    or His
    419
    abolished catalytic activity and zinc binding, while that affecting Glu
    416
    did the former but not the latter. These results suggest that the motif forms the catalytic site. We also mutated the codons corresponding to other amino acid residues that are likely zinc ligands. The mutation affecting Glu
    447
    decreased markedly both the enzymatic activity and the zinc content, while that affecting Glu
    446
    or Glu
    451
    had smaller effects on activity and zinc binding. These mutations caused a decrease in
    <italic>k</italic>
    cat
    but no significant change in
    <italic>
    K
    m
    </italic>
    . These results are consistent with the hypothesis that Glu
    447
    is the third zinc ligand. The spacing of the three zinc ligands is the same in all known clostridial collagenases but not in other known gluzincins, indicating that they form a new gluzincin subfamily. The effects of mutations affecting Glu
    446
    and Glu
    451
    suggest that the two residues are also involved in catalysis, possibly through an interaction with the two zinc-binding histidine residues.

    DOI: 10.1128/jb.181.9.2816-2822.1999

    PubMed

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  • Three distinct anti-allergic drugs, amlexanox, cromolyn and tranilast, bind to S100A12 and S100A13 of the S100 protein family. 査読

    Shishibori T, Oyama Y, Matsushita O, Yamashita K, Furuichi H, Okabe A, Maeta H, Hata Y, Kobayashi R

    Biochemistry Journal   338 ( Pt 3 )   583 - 589   1999年3月

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  • Gene duplication and multiplicity of collagenases in Clostridium histolyticum. 査読

    Osamu Matsushita, Chang-Min Jung, Seiichi Katayama, Junzaburo Minami, Yukie Takahashi, Akinobu Okabe

    Journal of Bacteriology   181 ( 3 )   923 - 933   1999年2月

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    担当区分:筆頭著者   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    <title>ABSTRACT</title>

    <italic>Clostridium histolyticum</italic>
    collagenase contains a number of different active components. Previously we have shown that
    <italic>colH</italic>
    encodes a 116-kDa collagenase (ColH) and a 98-kDa gelatinase. We purified a different 116-kDa collagenase (ColG) from the culture supernatant and sequenced its gene (
    <italic>colG</italic>
    ). We also identified four other gelatinases (105, 82, 78, and 67 kDa) and determined their N-terminal amino acid sequences, all of which coincided with that of either ColG or ColH. Hybridization experiments showed that each gene is present in a single copy and each gene is transcribed into a single mRNA. These results suggest that all the gelatinases are produced from the respective full-length collagenase by the proteolytic removal of C-terminal fragments. The substrate specificities of the enzymes suggest that
    <italic>colG</italic>
    and
    <italic>colH</italic>
    encode class I and class II enzymes, respectively. Analysis of their DNA locations by pulsed-field gel electrophoresis and nucleotide sequencing of their surrounding regions revealed that the two genes are located in different sites on the chromosome.
    <italic>C. histolyticum colG</italic>
    is more similar to
    <italic>C. perfringens colA</italic>
    than to
    <italic>colH</italic>
    in terms of domain structure. Both
    <italic>colG</italic>
    and
    <italic>colA</italic>
    have a homologous gene,
    <italic>mscL</italic>
    , at their 3′ ends. These results suggest that gene duplication and segment duplication have occurred in an ancestor cell common to
    <italic>C. histolyticum</italic>
    and
    <italic>C. perfringens</italic>
    and that further divergence of the parent gene produced
    <italic>colG</italic>
    and
    <italic>colA</italic>
    .

    DOI: 10.1128/jb.181.3.923-933.1999

    PubMed

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  • Collagen-binding growth factors: Production and characterization of functional fusion proteins having a collagen-binding domain. 査読

    N. Nishi, O. Matsushita, K. Yuube, H. Miyanaka, A. Okabe, F. Wada

    Proceedings of the National Academy of Sciences   95 ( 12 )   7018 - 7023   1998年6月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Proceedings of the National Academy of Sciences  

    DOI: 10.1073/pnas.95.12.7018

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  • A study of the collagen-binding domain of a 116-kDa Clostridium histolyticum collagenase. 査読

    Osamu Matsushita, Chang-Min Jung, Junzaburo Minami, Seiichi Katayama, Nozomu Nishi, Akinobu Okabe

    Journal of Biological Chemistry   273 ( 6 )   3643 - 3648   1998年2月

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    担当区分:筆頭著者   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1074/jbc.273.6.3643

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  • Lambda-toxin of Clostridium perfringens activates the precursor of epsilon-toxin by releasing its N- and C-terminal peptides. 査読

    Junzaburo Minami, Seiichi Katayama, Osamu Matsushita, Chieko Matsushita, Akinobu Okabe

    Microbiology and Immunology   41 ( 7 )   527 - 535   1997年7月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/j.1348-0421.1997.tb01888.x

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  • Expression of the colH gene encoding Clostridium histolyticum collagenase in Bacillus subtilis and Its application to enzyme purification. 査読

    Chang-Min Jung, Osamu Matsushita, Seiichi Katayama, Junzaburo Minami, Lichiro Ohhira, Akinobu Okabe

    Microbiology and Immunology   40 ( 12 )   923 - 929   1996年12月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/j.1348-0421.1996.tb01161.x

    PubMed

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  • An upstream activating sequence containing curved DNA involved in activation of the Clostridium perfringens plc promoter. 査読

    C. Matsushita, O. Matsushita, S. Katayama, J. Minami, K. Takai, A. Okabe

    Microbiology   142 ( 9 )   2561 - 2566   1996年9月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Microbiology Society  

    DOI: 10.1099/00221287-142-9-2561

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  • Analysis of the phospholipase C gene of Clostridium perfringens KZ1340 isolated from antarctic soil. 査読

    Kohtaro Kameyama, Osamu Matsushita, Seiichi Katayama, Junzaburo Minami, Masazumi Maeda, Shinichi Nakamura, Akinobu Okabe

    Microbiology and Immunology   40 ( 4 )   255 - 263   1996年4月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/j.1348-0421.1996.tb03344.x

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  • Purification, characterization, and primary structure of Clostridium perfringens lambda-toxin, a thermolysin-like metalloprotease. 査読

    F Jin, O Matsushita, S Katayama, S Jin, C Matsushita, J Minami, A Okabe

    Infection and Immunity   64 ( 1 )   230 - 237   1996年1月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    The lambda-toxin of Clostridium perfringens type B NCIB10691 was purified by ammonium sulfate precipitation, followed by size exclusion, anion-exchange, and hydrophobic interaction chromatography. The purified toxin had an apparent molecular mass of 36 kDa, as determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The toxin possessed casein-hydrolyzing activity, which was inhibited specifically by metal chelators, indicating that the toxin is a metalloprotease. The gene encoding the lambda-toxin (lam), which was shown by Southern analysis to be located on a 70-kb plasmid, was cloned into Escherichia coli cells. Nucleotide and N-terminal amino acid sequencing revealed that the lam gene encodes a 553-amino-acid protein, which is processed into a mature form, the molecular mass of which was calculated to be 35,722 Da. The deduced amino acid sequence of the mature enzyme contains an HEXXH motif characteristic of zinc metalloproteases and is homologous to other known enzymes belonging to the thermolysin family. The purified toxin degraded various biologically important substances, such as collagen, fibronectin, fibrinogen, immunoglobulin A, and the complement C3 component. It caused an increase in vascular permeability and hemorrhagic edema on injection into the dorsal skin of mice. These results suggest that the toxin contributes to the pathogenesis of histolytic infection by lambda-toxin-producing C. perfringens.

    DOI: 10.1128/iai.64.1.230-237.1996

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  • Phylogenetic analysis of phospholipase C genes from Clostridium perfringens types A to E and Clostridium novyi. 査読

    K Tsutsui, J Minami, O Matsushita, S Katayama, Y Taniguchi, S Nakamura, M Nishioka, A Okabe

    Journal of Bacteriology   177 ( 24 )   7164 - 7170   1995年12月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    The phylogenetic interrelationships between strains of 5 toxin types (A to E) of Clostridium perfringens were examined by analysis of differences in the nucleotide sequences of phospholipase C genes (plc genes) among 10 strains, including 3 strains for which the plc gene sequences have been previously reported. A plc gene was also cloned from a Clostridium novyi type A strain and sequenced to analyze the interspecies diversity of plc genes. Phylogenetic trees constructed by the neighbor-joining method revealed that the phylogeny of C. perfringens strains is not related to toxin typing, in agreement with the results of a comparative genome mapping study by Canard et al. (B. Canard, B. Saint-Joanis, and S. T. Cole, Mol. Microbiol. 6:1421-1429, 1992). Various C. perfringens phospholipase C enzymes were purified from cultures of Escherichia coli cells into which the encoding plc genes had been cloned. All of the enzymes showed the same specific activity. On the other hand, the level of plc transcripts differed greatly (up to 40-fold) from one C. perfringens strain to another. No significant difference in the nucleotide sequence of the plc promoter region was observed for any of the plc genes. These results suggest that the variation in phospholipase C activity among different strains is not due to mutation in the plc coding region but to that in an extragenic region. The evolution of C. perfringens phospholipase C is discussed on the basis of similarities and differences between clostridial plc genes.

    DOI: 10.1128/jb.177.24.7164-7170.1995

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  • A Method for purification of Clostridium perfringens phospholipase C from recombinant Bacillus subtilis cells. 査読

    Y Hirata, J Minami, M Koyama, O Matsushita, S Katayama, F Jin, H Maeta, A Okabe

    Applied and Environmental Microbiology   61 ( 11 )   4114 - 4115   1995年11月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    We developed a method to purify Clostridium perfringens phospholipase C from a culture of recombinant Bacillus subtilis cells. This method consists of three purification steps, and it allowed us to obtain 6.2 mg of pure phospholipase C from 800 ml of culture.

    DOI: 10.1128/aem.61.11.4114-4115.1995

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  • Genetic and phenotypic analysis of Borrelia miyamotoi sp. nov., isolated from the ixodid tick Ixodes persulcatus, the vector for Lyme disease in Japan. 査読

    M. Fukunaga, Y. Takahashi, Y. Tsuruta, O. Matsushita, D. Ralph, M. McClelland, M. Nakao

    International Journal of Systematic Bacteriology   45 ( 4 )   804 - 810   1995年10月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Microbiology Society  

    DOI: 10.1099/00207713-45-4-804

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  • Identification of the gene encoding a mechanosensitive channel MscL homologue in Clostridium perfringens. 査読

    Osamu Matsushita, Chang-Min Jung, Akinobu Okabe

    Gene   165 ( 1 )   147 - 148   1995年1月

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    担当区分:筆頭著者   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1016/0378-1119(95)00490-w

    PubMed

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  • Role of alpha-toxin in Clostridium perfringens infection determined by using recombinants of C. perfringens and Bacillus subtilis. 査読

    M Ninomiya, O Matsushita, J Minami, H Sakamoto, M Nakano, A Okabe

    Infection and Immunity   62 ( 11 )   5032 - 5039   1994年11月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    Clostridium perfringens type A strains which differed in alpha-toxin (phospholipase C [PLC]) productivity were inoculated intraperitoneally or intravenously into mice, and then their 50% mouse lethal doses (LD50) were determined. Strain NCTC 8237 produced ninefold higher PLC activity than strain 13. The mean LD50 for the former was 1 log unit lower than that for the latter. Two isogenic strains were constructed from strain 13: strain 13(pJIR418 alpha) (pJIR418 alpha contains the plc gene), which produced ninefold higher PLC activity than strain 13; and strain 13 PLC-, which showed no PLC productivity at all because of transformation-mediated gene disruption. The mean LD50 for strain 13(pJIR418 alpha) was 1 log unit lower than those for strain 13 PLC- and strain 13. These results indicate that PLC functions as a virulence-determining factor when it is produced in a sufficient amount. Such a difference in LD50 was also observed between Bacillus subtilis with and without the cloned plc gene. Inoculation of B. subtilis PLC+ intravenously into mice caused marked thrombocytopenia and leukocytosis. Mice inoculated with B. subtilis at 2 LD50 died because of circulatory collapse. Histological examination revealed that intravascular coagulation and vascular congestion occurred most prominently in the lungs. These results suggest that PLC plays a key role in the systemic intoxication of clostridial myonecrosis, probably by affecting the functions of platelets and phagocytes.

    DOI: 10.1128/iai.62.11.5032-5039.1994

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  • Cloning and nucleotide sequence analysis of the colH gene from Clostridium histolyticum encoding a collagenase and a gelatinase. 査読

    K Yoshihara, O Matsushita, J Minami, A Okabe

    Journal of Bacteriology   176 ( 21 )   6489 - 6496   1994年11月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    The colH gene encoding a collagenase was cloned from Clostridium histolyticum JCM 1403. Nucleotide sequencing showed a major open reading frame encoding a 116-kDa protein of 1,021 amino acid residues. The deduced amino acid sequence contains a putative signal sequence and a zinc metalloprotease consensus sequence, HEXXH. A 116-kDa collagenase and a 98-kDa gelatinase were copurified from culture supernatants of C. histolyticum. While the former degraded both native and denatured collagen, the latter degraded only denatured collagen. Peptide mapping with V8 protease showed that all peptide fragments, except a few minor ones, liberated from the two enzymes coincided with each other. Analysis of the N-terminal amino acid sequence of the two enzymes revealed that their first 24 amino acid residues were identical and coincided with those deduced from the nucleotide sequence. These results indicate that the 98-kDa gelatinase is generated from the 116-kDa collagenase by cleaving off the C-terminal region, which could be responsible for binding or increasing the accessibility of the collagenase to native collagen fibers. The role of the C-terminal region in the functional and evolutional aspects of the collagenase was further studied by comparing the amino acid sequence of the C. histolyticum collagenase with those of three homologous enzymes: the collagenases from Clostridium perfringens and Vibrio alginolyticus and Achromobacter lyticus protease I.

    DOI: 10.1128/jb.176.21.6489-6496.1994

    PubMed

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  • Comparison of the virulence of methicillin-resistant and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. 査読

    Sadao Mizobuchi, Junzaburo Minami, Fu Jin, Osamu Matsushita, Akinobu Okabe

    Microbiology and Immunology   38 ( 8 )   599 - 605   1994年8月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/j.1348-0421.1994.tb01829.x

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  • A Clostridium perfringens vector for the selection of promoters. 査読

    Chieko Matsushita, Osamu Matsushita, Michio Koyama, Akinobu Okabe

    Plasmid   31 ( 3 )   317 - 319   1994年5月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1006/plas.1994.1035

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  • Enterotoxic activity of Klebsiella oxytoca cytotoxin in rabbit intestinal loops. 査読

    J Minami, S Katayama, O Matsushita, H Sakamoto, A Okabe

    Infection and Immunity   62 ( 1 )   172 - 177   1994年1月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    We examined the enterotoxicity of a Klebsiella oxytoca cytotoxin which is produced by K. oxytoca OK-1, a strain from a patient with antibiotic-associated hemorrhagic colitis. Injection of the cytotoxin into ligated ileal and colonic loops in rabbits caused the accumulation of fluid in the loops. The fluid was bloody in the ileal loops but not in the colonic ones. Histological examination revealed intense mucosal hemorrhage with erosion in the ileum, whereas no microscopic change was noted in the colon. The fluid accumulation was shown to be a dose-dependent response in both ileal and colonic loops. The amounts of the cytotoxin required for maximal fluid accumulation in ileal and colonic loops were 60 and 10 micrograms, respectively. Fluid accumulation was first noticeable in ileal loops 12 h and in colonic ones 5 h after the injection of these doses of the cytotoxin and then proceeded with time. When K. oxytoca OK-1, a cytotoxin-producing strain, was inoculated into the loops at doses of 1 x 10(8) and 5 x 10(9) CFU, similar fluid accumulation was observed. However, inoculation of K. oxytoca ATCC 13182, a non-cytotoxin-producing strain, at the same doses did not cause any change. These results suggest that the cytotoxin-producing strain of K. oxytoca is the causative organism of antibiotic-associated hemorrhagic colitis and that the toxin is the factor responsible for pathogenesis.

    DOI: 10.1128/iai.62.1.172-177.1994

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  • Purification and characterization of Clostridium perfringens 120-kilodalton collagenase and nucleotide sequence of the corresponding gene. 査読

    O Matsushita, K Yoshihara, S Katayama, J Minami, A Okabe

    Journal of Bacteriology   176 ( 1 )   149 - 156   1994年1月

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    担当区分:筆頭著者   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    Clostridium perfringens type C NCIB 10662 produced various gelatinolytic enzymes with molecular masses ranging from approximately 120 to approximately 80 kDa. A 120-kDa gelatinolytic enzyme was present in the largest quantity in the culture supernatant, and this enzyme was purified to homogeneity on the basis of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The purified enzyme was identified as the major collagenase of the organism, and it cleaved typical collagenase substrates such as azocoll, a synthetic substrate (4-phenylazobenzyloxy-carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg [Pz peptide]), and a type I collagen fibril. In addition, a gene (colA) encoding a 120-kDa collagenase was cloned in Escherichia coli. Nested deletions were used to define the coding region of colA, and this region was sequenced; from the nucleotide sequence, this gene encodes a protein of 1,104 amino acids (M(r), 125,966). Furthermore, from the N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme which was found in this reading frame, the molecular mass of the mature enzyme was calculated to be 116,339 Da. Analysis of the primary structure of the gene product showed that the enzyme was produced with a stretch of 86 amino acids containing a putative signal sequence. Within this stretch was found PLGP, the amino acid sequence constituting the Pz peptide. This sequence may be implicated in self-processing of the collagenase. A consensus zinc-binding sequence (HEXXH) suggested for vertebrate Zn collagenases is present in this bacterial collagenase. Vibrio alginolyticus collagenase and Achromobacter lyticus protease I showed significant homology with the 120-kDa collagenase of C. perfringens, suggesting that these three enzymes are evolutionarily related.

    DOI: 10.1128/jb.176.1.149-156.1994

    PubMed

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  • Comparison of the alpha-toxin genes of Clostridium perfringens type A and C strains: evidence for extragenic regulation of transcription. 査読

    S Katayama, O Matsushita, J Minami, S Mizobuchi, A Okabe

    Infection and Immunity   61 ( 2 )   457 - 463   1993年2月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    The Clostridium perfringens plc gene encoding phospholipase C (alpha-toxin) was cloned from type C NCIB 10662, a strain which produces low levels of phospholipase C activity. The nucleotide sequence of a cloned 3.1-kb HindIII fragment was determined. The same fragment was also cloned from type A NCTC 8237, a phospholipase C-overproducing strain. In this case, an open reading frame (ORF2) truncated in the previously cloned 2-kb fragment was also sequenced. Comparison of the nucleotide sequence between the 3.1-kb fragments of the two type strains shows some differences both in the plc gene and in ORF2. However, when the 3.1-kb fragment was cloned into plasmid pUC19 and expressed in Escherichia coli, the plc genes from both type strains were similarly expressed and the toxins produced showed similar levels of activity. Northern blot analysis revealed that the type A strain produced 16 to 23 times more plc mRNA than the type C strain. These results indicate that in C. perfringens the two plc genes are transcribed at different rates, probably because of a difference in a locus lying outside of the cloned fragments. Gel retardation analysis showed that the type A strain possessed two different proteins that bound different regions of the plc gene. However, one of these proteins, which binds within the plc coding region, was not found in the type C strain, suggesting that it plays a role in the regulation of the plc gene expression.

    DOI: 10.1128/iai.61.2.457-463.1993

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  • Melibiose transport system in Lactobacillus plantarum. 査読

    Chiyuki Tamura, Osamu Matsushita

    Microbiology and Immunology   36 ( 11 )   1119 - 1128   1992年11月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/j.1348-0421.1992.tb02116.x

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  • Properties of a genetically reconstructed Prevotella ruminicola endoglucanase. 査読

    G Maglione, O Matsushita, J B Russell, D B Wilson

    Applied and Environmental Microbiology   58 ( 11 )   3593 - 3597   1992年11月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    A pUC19-derived plasmid was constructed that coded for a hybrid cellulase with the Thermomonospora fusca E2 cellulose-binding domain at its C terminus joined to the Prevotella ruminicola 40.5-kDa carboxymethyl cellulase (CMCase). The hybrid enzyme was purified and characterized enzymatically. It bound tightly to cellulose, and its specific activities on carboxymethyl cellulose, amorphous cellulose, and ball-milled cellulose were 1.5, 10, and 8 times that of the 40.5-kDa CMCase, respectively. Furthermore, the modified enzyme gave synergism with an exocellulase in the degradation of filter paper, while the 40.5-kDa CMCase did not.

    DOI: 10.1128/aem.58.11.3593-3597.1992

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  • Role of the upstream region containing an intrinsic DNA curvature in the negative regulation of the phospholipase C gene of Clostridium perfringens. 査読

    Tatsuo Toyonaga, Osamu Matsushita, Sei-ichi Katayama, Junzaburo Minami, Akinobu Okabe

    Microbiology and Immunology   36 ( 6 )   603 - 613   1992年6月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/j.1348-0421.1992.tb02060.x

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  • Membrane lipids of Mycoplasma orale: lipid composition and synthesis of phospholipids. 査読

    Hirai Y, Kukida S, Matsushita O, Nagamachi E, Tomochika K, Kanemasa Y

    Physiological Chemistry and Physics and Medical NMR   24 ( 1 )   21 - 27   1992年

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  • Adaptational changes of fatty acid composition and the physical state of membrane lipids following the change of growth temperature in Yersinia enterocolitica. 査読

    Eiko Nagamachi, Sei-ichiro Shibuya, Yoshikazu Hirai, Osamu Matsushita, Ken-ichi Tomochika, Yasuhiro Kanemasa

    Microbiology and Immunology   35 ( 12 )   1085 - 1093   1991年12月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/j.1348-0421.1991.tb01630.x

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  • A Bacteroides ruminicola 1,4-beta-D-endoglucanase is encoded in two reading frames. 査読

    O Matsushita, J B Russell, D B Wilson

    Journal of Bacteriology   173 ( 21 )   6919 - 6926   1991年11月

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    担当区分:筆頭著者   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    Escherichia coli transformed with a plasmid containing a Bacteroides ruminicola endoglucanase (carboxymethyl cellulase [CMCase]) gene produced three immunologically cross-reacting CMCases which had molecular weights of 40,500, 84,000, and 88,000, while B. ruminicola produced CMCases with molecular weights of 82,000 and 88,000. The two B. ruminicola enzymes (purified from culture supernatants) had different N-terminal amino acid sequences, but each enzyme was encoded by the same gene (three independent clones had the same DNA sequence). The 88,000-molecular-weight CMCase (88K CMCase) gene appeared to contain two open reading frames which overlapped for 18 bp and were -1 out of frame, and each open reading frame contained several stop codons near the overlap region. The two 88K CMCase open reading frames had enough DNA to produce a protein of 106K, but the mobility of the enzyme in sodium dodecyl sulfate gels gave a value which was 20% lower. On the basis of the -1 frame shift and the large deviation in theoretical versus actual size, it appears that an unusual event (e.g., ribosomal hopping or RNA splicing) is involved in either the translation or the transcription of the 88K B. ruminicola CMCase gene. The 82K CMCase was completely encoded in the second reading frame, and its size was in agreement with the DNA sequence.

    DOI: 10.1128/jb.173.21.6919-6926.1991

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  • An indirect immunofluorescence method for detection of Mycoplasma hominis in vaginal smears. 査読

    Yoshikazu Hirai, Tomohisa Kanatani, Masako Ono, Osamu Matsushita, Yasuhiro Kanemasa

    Microbiology and Immunology   35 ( 10 )   831 - 839   1991年10月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Wiley  

    DOI: 10.1111/j.1348-0421.1991.tb02023.x

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  • Cloning and sequencing of a Bacteroides ruminicola B14 endoglucanase gene. 査読

    O Matsushita, J B Russell, D B Wilson

    Journal of Bacteriology   172 ( 7 )   3620 - 3630   1990年7月

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    担当区分:筆頭著者   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    Bacteroides ruminicola B(1)4, a noncellulolytic rumen bacterium, produces an endoglucanase (carboxymethylcellulase [CMCase]) that is excreted into the culture supernatant. Cultures grown on glucose, fructose, maltose, mannose, and cellobiose had high specific activities of CMCase (greater than 3 mmol of reducing sugar per mg of protein per min), but its synthesis was repressed by sucrose. B. rumincola did not grow on either ball-milled or acid-swollen cellulose even though the CMCase could hydrolyze swollen cellulose. The CMCase gene was cloned into Escherichia coli, and its nucleotide sequence contained a single open reading frame coding for a protein of 40,481 daltons. The enzyme was overproduced in E. coli under the control of the tac promoter and purified to homogeneity. The N-terminal sequence, amino acid composition, and molecular weight of the purified enzyme were similar to the values predicted from the open reading frame of the DNA sequence. However, the CMCase present in B. ruminicola was found to have a monomer molecular weight of 88,000 by Western immunoblotting. This discrepancy appeared to have resulted from our having cloned only part of the CMCase gene into E. coli. The amino acid sequence of the CMCase showed homology to sequences of beta-glucanases from Ruminococcus albus and Clostridium thermocellum.

    DOI: 10.1128/jb.172.7.3620-3630.1990

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  • Lincomycin increases the half-life of beta-lactamase mRNA. 査読

    O Matsushita, A Okabe, H Hayashi, Y Kanemasa

    Antimicrobial Agents and Chemotherapy   33 ( 6 )   805 - 809   1989年6月

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    担当区分:筆頭著者   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    Escherichia coli K-12 strains isolates carrying plasmid pBR322 were grown in the presence of subinhibitory concentrations of lincomycin, which stimulated beta-lactamase synthesis about 2.5-fold, and the effects of the drug on the synthesis and degradation of bla mRNA were studied. The bla mRNA levels determined by 1-min pulse-labeling with [3H]uridine were significantly higher in a lincomycin-containing culture than in the control culture, indicating that stimulation of beta-lactamase synthesis is caused by an increase in the amount of bla mRNA. The enhancing effect of lincomycin was observed in strains harboring pBR322 delta P1 and pBR322 delta P3, which lacked the P1 or P3 promoter, respectively, as well as in the strain harboring pBR322. S1 nuclease analysis showed that the half-life of bla mRNA increased about 2.7-fold when lincomycin was present. These results indicate that the increase in beta-lactamase synthesis caused by lincomycin is due to an increase in the stability of bla mRNA rather than activation of its synthesis.

    DOI: 10.1128/aac.33.6.805

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  • Effects of lincomycin on synthesis of TEM beta-lactamase by Escherichia coli. 査読

    AKINOBU OKABE, OSAMU MATSUSHITA, HIDEO HAYASHI

    The Journal of Antibiotics   41 ( 5 )   667 - 674   1988年

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Japan Antibiotics Research Association  

    DOI: 10.7164/antibiotics.41.667

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  • Lincomycin stimulates synthesis of TEM-2 beta-lactamase by Escherichia coli. 査読

    A Okabe, O Matsushita, S Katayama, H Hayashi

    Antimicrobial Agents and Chemotherapy   30 ( 1 )   82 - 87   1986年7月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Society for Microbiology  

    Lincomycin increased the TEM-2 beta-lactamase activity of Escherichia coli K-12 cells carrying plasmid RP4 at a concentration which slightly inhibited cell growth. In a control culture beta-lactamase activity reached its maximal level in late log phase, whereas when lincomycin was present beta-lactamase activity continued to increase into the stationary phase. Lincomycin (100 micrograms/ml) inhibited both cell growth and protein synthesis by about 35% but stimulated beta-lactamase activity 2.5-fold per ml of culture and about 4-fold per cell after 20 h of growth. The amount of beta-lactamase produced in each culture was also compared by densitophotometry of a stained sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel. The relative values were in good agreement with the relative enzyme activities, indicating that the stimulatory effect of lincomycin was due to an increase in the amount of beta-lactamase protein. Inactivation of beta-lactamase appeared to be faster when lincomycin was present. This was determined by measuring the decrease in beta-lactamase activity when phenethyl alcohol was present to prevent maturation of the enzyme. There was no significant difference in plasmid copy number between the cells grown in the presence or absence of lincomycin. These results indicate that lincomycin stimulates transcription, translation, or translocation of beta-lactamase.

    DOI: 10.1128/aac.30.1.82

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書籍等出版物

  • コンパクト微生物学

    監修 小熊, 恵二, 堀田, 博, 編集 林, 俊治, 石戸, 聡( 範囲: 第9章 臓器感染症 消化器系 泌尿生殖系 神経系)

    南江堂  2021年3月  ( ISBN:9784524226368

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    総ページ数:xix, 294p   記述言語:日本語

    CiNii Books

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  • シンプル微生物学

    編集 小熊, 恵二, 堀田, 博, 若宮, 伸隆( 範囲: 感染症成立の要因; クロストリジウム属)

    南江堂  2018年3月  ( ISBN:9784524254835

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    総ページ数:xvi, 457p   記述言語:日本語

    CiNii Books

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MISC

  • 新しいHelicobacter属の知見

    横田憲治, 喜多雅英, 岡田裕之, 松下 治, 小熊恵二

    日本臨床   71 ( 8 )   1374 - 1379   2013年8月

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    記述言語:日本語  

    PubMed

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  • Clostridial hydrolytic enzymes degrading extracellular components. 査読

    Osamu Matsushita, Akinobu Okabe

    Toxicon   39 ( 11 )   1769 - 1780   2001年11月

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    担当区分:筆頭著者   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1016/s0041-0101(01)00163-5

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  • ガス壊疽菌群のコラゲナーゼに関する研究 招待 査読

    松下 治

    日本細菌学雑誌   54 ( 4 )   753 - 761   1999年11月

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    担当区分:筆頭著者, 最終著者, 責任著者   出版者・発行元:Japanese Society for Bacteriology  

    DOI: 10.3412/jsb.54.753

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  • 細菌性メタロプロテアーゼ 査読

    岡部昭延、松下 治、南 純三朗

    日本細菌学雑誌   50 ( 4 )   971 - 989   1995年10月

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    出版者・発行元:Japanese Society for Bacteriology  

    DOI: 10.3412/jsb.50.971

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産業財産権

  • Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone

    Robert C. Gensure, Joshua Sakon, Osamu Matsushita, Tulasi Ponnapakkam

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    出願人:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS

    出願番号:US 16/517,98  出願日:2019年7月22日

    公開番号:US 2019/0338010 A1  公開日:2019年11月7日

    特許番号/登録番号:US 10,519,213 B2  登録日:2019年12月31日 

    権利者:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS;OCHSNER CLINIC FOUNDATION;NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KAGAWA UNIVERSITY

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  • Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone

    Robert C. Gensure, Joshua Sakon, Osamu Matsushita, Tulasi Ponnapakkam

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    出願人:The Board of Trustees of the University of Arkansas

    出願番号:US 16/249,540  出願日:2019年1月16日

    公開番号:US 2019/0135890 A1  公開日:2019年5月9日

    特許番号/登録番号:US 10,358,471 B2  登録日:2019年7月23日 

    権利者:The Board of Trustees of the University of Arkansas;Ochsner Clinic Foundation;National University Corporation Kagawa University

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  • コラーゲン結合タンパク質による治療剤の送達

    サコン ジョシュア, フィロミネイサン サガヤ テレサ レーナ, ポンナパッカム トゥラシ, カティカネニ ランジータ, 小出 隆規, 松下 治, ジェンシュア ロバート シー, 西 望

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    出願人:ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー

    出願番号:特願2018-038513  出願日:2018年3月5日

    公開番号:特開2018-104461  公開日:2018年7月5日

    特許番号/登録番号:特許第6697019号  登録日:2020年4月27日 

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  • Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein

    Tulasi Ponnapakkam, Sagaya Theresa Leena Philominathan, Joshua Sakon, Ranjitha Katikaneni, Takaki Koide, Osamu Matsushita, Robert C. Gensure, Nozomu Nishi

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    出願人:The Board of Trustes of the University of Arkansas

    出願番号:US 15/407,589  出願日:2017年1月17日

    公開番号:US 2017/0204390 A1  公開日:2017年7月20日

    特許番号/登録番号:US 11,001,820 B2  登録日:2021年5月11日 

    権利者:The Board of Trustes of the University of Arkansas;Montefiore Medical CenterThe Kitasato Institute;National University Corporation Kagawa University

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  • Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone

    Robert C. Gensure, Joshua Sakon, Osamu Matsushita, Tulasi Ponnapakkam

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    出願人:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS

    出願番号:US 15/387,817  出願日:2016年12月22日

    公開番号:US 2017/0101457 A1  公開日:2017年4月13日

    特許番号/登録番号:US 10,202,434 B2  登録日:2019年2月12日 

    権利者:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS;OCHSNER CLINIC FOUNDATION;NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KAGAWA UNIVERSITY

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  • Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein

    Tulasi Ponnapakkam, Sagaya Theresa Leena Philominathan, Joshua Sakon, Ranjitha Katikaneni, Takaki Koide, Osamu Matsushita, Robert C. Gensure

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    出願人:The Board of Trustes of the University of Arkansas

    出願番号:US 15/386,626  出願日:2016年12月21日

    公開番号:US 2017/0106093 A1  公開日:2017年4月20日

    特許番号/登録番号:US 10,213,488 B2  登録日:2019年2月26日 

    権利者:The Board of Trustes of the University of Arkansas;The Kitasato Institute;Montefiore Medical Center

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  • コラーゲン結合領域と副甲状腺ホルモンとの融合タンパク

    松下 治, ジェンシュア, ロバート シー, サコン ジョシュア, ポンナパッカム トゥラシ

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    出願人:ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー

    出願番号:特願2016-157345  出願日:2016年8月10日

    公開番号:特開2017-25069  公開日:2017年2月2日

    特許番号/登録番号:特許第6366653号  登録日:2018年7月13日  発行日:2018年8月1日

    権利者:ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー;国立大学法人 香川大学;オクスナー クリニック ファウンデイション

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  • 神経再生用移植材料、神経再生用移植材料の製造方法、及び神経再生用移植材料製造用キット

    内田 健太郎, 井上 玄, 藤巻 寿子, 高相 晶士, 佐久 太郎, 礒部 仁博, 松下 治, 美間 健彦, 西 望, 服部 俊治, 田中 啓友, 小倉 孝之

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    出願人:学校法人北里研究所

    出願番号:特願2016-554137  出願日:2015年10月16日

    公表番号:WO2016/060252  公表日:2016年4月21日

    特許番号/登録番号:特許第6699821号  登録日:2020年5月7日  発行日:2020年5月27日

    権利者:学校法人北里研究所;株式会社アトリー;国立大学法人 岡山大学;国立大学法人 香川大学;株式会社ニッピ

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  • コラーゲン結合領域と副甲状腺ホルモンとの融合タンパク

    松下 治, ジェンシュア ロバート シー, サコン ジョシュア, ポンナパッカム トゥラシ

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    出願人:ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー

    出願番号:特願2015-173678  出願日:2015年9月3日

    公開番号:特開2016-094385  公開日:2016年5月26日

    特許番号/登録番号:特許第5989876号  登録日:2016年8月19日 

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  • Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone

    Robert C. Gensure, Joshua Sakon, Osamu Matsushita, Tulasi Ponnapakkam

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    出願人:Ochsner Clinic Foundation

    出願番号:US 14/743,629  出願日:2015年6月18日

    公開番号:US 2015/0284701 A1  公開日:2015年10月8日

    特許番号/登録番号:US 9,528,099 B2  登録日:2016年12月27日 

    権利者:Ochsner Clinic Foundation;National University Corporation Kagawa University;The Board of Trustees of the University of Arkansas

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  • コラーゲン結合領域と副甲状腺ホルモンとの融合タンパク

    松下 治, ジェンシュア ロバート シー, サコン ジョシュア, ポンナパッカム トゥラシ

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    出願人:ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー

    出願番号:特願2013-194484  出願日:2013年9月19日

    公開番号:特開2014-040431  公開日:2014年3月6日

    特許番号/登録番号:特許第5821066号  登録日:2015年10月16日 

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  • Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone

    Robert C. Gensure, Joshua Sakon, Osamu Matsushita, Tulasi Ponnapakkam

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    出願人:National University Corporation Kagawa University

    出願番号:US 13/898,058  出願日:2013年5月20日

    公開番号:US 2013/0337017 A1  公開日:2013年12月19日

    特許番号/登録番号:US 9,062,300 B2  登録日:2015年5月23日 

    権利者:National University Corporation Kagawa University;Ochsner Clinic Foundation;The Board of Trustees of the University of Arkansas

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  • Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein

    Tulasi Ponnapakkam, Sagaya Theresa Leena Philominathan, Joshua Sakon, Ranjitha Katikaneni, Takaki Koide, Osamu Matsushita, Robert C. Gensure

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    出願人:The Kitasato Institute

    出願番号:US 14/378,067  出願日:2013年2月11日

    公開番号:US 2015/0038423 A1  公開日:2015年2月5日

    公表番号:WO2013/120060  公表日:2013年8月15日

    特許番号/登録番号:US 9,526,765 B2  登録日:2016年12月27日 

    権利者:The Kitasato Institute;Montefiore Medical Center;Board of Trustees of the University of Arkansas

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  • コラーゲン結合タンパク質による治療剤の送達

    サコン ジョシュア, フィロミネイサン サガヤ テレサ レーナ, ポンナパッカム トゥラシ, カティカネニ ランジータ, 小出 隆規, 松下 治, ジェンシュア ロバート シー, 西 望

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    出願人:ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー

    出願番号:特願2014-547503  出願日:2012年12月14日

    公表番号:特表2015-513312  公表日:2015年5月7日

    特許番号/登録番号:特許第6366507号  登録日:2018年7月13日  発行日:2018年8月1日

    権利者:ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー;学校法人 北里研究所;モンテフィオーレ メディカル センター;国立大学法人 香川大学

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  • Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein

    Joshua Sakon, Sagaya Theresa Leena Philominathan, Ranjitha Katikaneni, Osamu Matsushita, Tulasi Ponnapakkam, Takaki Koide, Robert C Gensure, Nozomu Nishi

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    出願人:The Board of Trustees of the University of Arkansas

    出願番号:EP 18173596.0 A  出願日:2012年12月14日

    公開番号:EP 3391899 A1  公開日:2018年10月24日

    公表番号:12857691.5/2 790 717  公表日:2018年10月24日

    特許番号/登録番号:EP 3 391 899 B1  登録日:2020年7月15日 

    権利者:The Board of Trustees of the University of Arkansas;The Kitasato Institute;Montefiore Medical Center;National University Corporation Kagawa University

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  • Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein

    Tulasi Ponnapakkam, Sagaya Theresa Leena Philominathan, Joshua Sakon, Ranjitha Katikaneni, Takaki Koide, Osamu Matsushita, Robert C. Gensure, Nozomu Nishi

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    出願人:The Kitasato Institute

    出願番号:US 14/365,226  出願日:2012年12月14日

    公開番号:US 2014/0377215 A1  公開日:2014年12月25日

    公表番号:WO013/090770  公表日:2013年6月20日

    特許番号/登録番号:US 9,579.273 B2  登録日:2017年2月28日 

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  • Delivery of therapeutic agents by a collagen binding protein

    Joshua Sakon, Sagaya Theresa Leena Philominathan, Ranjitha Katikaneni, Osamu Matsushita, Tulasi Ponnapakkam, Takaki Koide, Robert C Gensure, Nozomu Nishi

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    出願人:The Board of Trustees of the University of Arkansas

    出願番号:EP 12857691.5 A  出願日:2012年12月14日

    公開番号:EP 2790717 A4  公開日:2016年3月9日

    公表番号:WO2013/090770  公表日:2013年6月20日

    特許番号/登録番号:EP 2 790 717 B1  登録日:2018年5月30日 

    権利者:The Board of Trustees of the University of Arkansas;The Kitasato Institute;Montefiore Medical Center;National University Corporation Kagawa University

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  • Delivery of therapeutic agents using bacterial collagen-binding polypeptide segments

    Joshua Sakon, Sagaya Theresa Leena Philominathan, Ranjitha Katikaneni, Osamu Matsushita, Tulasi Ponnapakkam, Takaki Koide, Robert C. Gensure, Nozomu Nishi

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    出願人:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS

    出願番号:US 2012/069831  出願日:2012年12月14日

    公表番号:WO2013/090770  公表日:2013年6月20日

    特許番号/登録番号:CA 2 859 412 C  登録日:2021年5月25日 

    権利者:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS;MONTEFIORE MEDICAL CENTER;THE KITASATO INSTITUTE

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  • 成長因子アンカーリング型骨移植材料および成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キット

    内田 健太郎, 成瀬 康治, 高相 晶士, 美間 健彦, 松下 治, 原口 高志, 西 望

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    出願人:学校法人北里研究所

    出願番号:特願2013-515034  出願日:2012年3月26日

    特許番号/登録番号:特許第5512887号  登録日:2014年4月4日 

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  • Growth factor anchoring type bone graft material, method for producing growth factor anchoring type bone graft material, kit for producing growth factor anchoring type bone graft material, and method for forming bone

    Kentaro Uchida, Koji Naruse, Masashi Takaso, Takehiko Mima, Osamu Matsushita, Takashi Haraguchi, Nozomu Nishi

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    出願人:SCHOOL JURIDICAL PERSON KITASATO INSTITUTE

    出願番号:US 14/117,599  出願日:2012年3月26日

    公開番号:US 2014/0335146 A1  公開日:2014年11月13日

    公表番号:WO2012/157339  公表日:2012年11月22日

    特許番号/登録番号:US 9,248,164 B2  登録日:2016年2月2日 

    権利者:SCHOOL JURIDICAL PERSON KITASATO INSTITUTE;NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KAGAWA UNIVERSITY

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  • Growth factor anchoring type bone graft material, method for producing growth factor anchoring type bone graft material, kit for producing growth factor anchoring type bone graft material, and method for forming bone

    Kentaro Uchida, Koji Naruse, Masashi Takaso, Takehiko Mima, Osamu Matsushita, Takashi Haraguchi, Nozomu Nishi

     詳細を見る

    出願人:School Juridical Person Kitasato Institute

    出願番号:EP 12785014.7 A  出願日:2012年3月26日

    公開番号:EP 2708246 A4  公開日:2014年11月19日

    公表番号:WO2012/157339  公表日:2012年11月22日

    特許番号/登録番号:EP 2 708 246 B1  登録日:2017年11月1日 

    権利者:School Juridical Person Kitasato Institute;National University Corporation Kagawa University

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  • コラーゲン結合領域と副甲状腺ホルモンとの融合タンパク

    松下 治, ジェンシュア ロバート シー, サコン ジョシュア, ポンナパッカム トゥラシ

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    出願人:ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー

    出願番号:特願2010-503048  出願日:2008年4月9日

    特許番号/登録番号:特許第5520811号  登録日:2014年4月11日 

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  • Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone

    Joshua Sakon, Osamu Matsushita, Robert C. Gensure, Tulasi Ponnapakkam

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    出願人:The Board of Trustees of The University of Arkansas

    出願番号:EP 16169069.8 A  出願日:2008年4月9日

    公開番号:EP 3091075 A1  公開日:2016年11月9日

    特許番号/登録番号:EP 3 091 075 B1  登録日:2018年6月13日 

    権利者:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS;National University Corporation Kagawa University;Ochsner Clinic Foundation

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  • Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone

    Joshua Sakon, Robert C. Gensure, Osamu Matsushita

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    出願人:The Board of Trustees of the University of Arkansas

    出願番号:US 12/594,547  出願日:2008年4月9日

    公開番号:US 2010/0129341 A1  公開日:2010年5月27日

    特許番号/登録番号:US 8.450,273 B2  登録日:2013年5月28日 

    権利者:The Board of Trustees of the University of Arkansas;Ochsner Clinic Foundation;National University Corporation Kagawa University

    researchmap

  • Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone

    Joshua Sakon, Osamu Matsushita, Robert C. Gensure, Tulasi Ponnapakkam

     詳細を見る

    出願人:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS

    出願番号:EP 08742686.2 A  出願日:2008年4月9日

    公開番号:EP 2155874 A4  公開日:2010年9月1日

    公表番号:WO2008/124166  公表日:2008年10月16日

    特許番号/登録番号:EP 2 155 874 B1  登録日:2016年5月11日 

    権利者:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS;National University Corporation Kagawa University;Ochsner Clinic Foundation

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  • Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone

    Osamu Matsushita, Robert C. Gensure, Joshua Sakon, Tulasi Ponnapakkam

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    出願人:The Board of Trustees of the University of Arkansas; National University Corporation Kagawa University; Ochsner Clinic Foundation

    出願番号:2 683 862  出願日:2008年4月9日

    公開日:2008年10月16日

    特許番号/登録番号:CA 2 930 681 C  登録日:2019年10月15日 

    権利者:The Board of Trustees of the University of Arkansas;Ochsner Clinic Foundation;National University Corporation Kagawa University

  • Fusion protein of collagen-binding domain and parathyroid hormone

    Osamu Matsushita, Robert C. Gensure, Joshua Sakon, Tulasi Ponnapakkam

     詳細を見る

    出願人:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS

    出願番号:2 683 862  出願日:2008年4月9日

    公開日:2008年10月16日

    特許番号/登録番号:CA 2 930 681 C  登録日:2019年10月15日 

    権利者:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS;NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KAGAWA UNIVERSITY;OCHSNER CLINIC FOUNDATION

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  • Fusion protein of collagen-binding domain and parathyroid hormone

    Joshua Sakon, Osamu Matsushita, Robert C. Gensure, Tulasi Ponnapakkam

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    出願人:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS

    出願番号:US2008/004589  出願日:2008年4月9日

    公表番号:WO2008/124166 A3  公表日:2008年10月16日

    特許番号/登録番号:CA 2 683 862 C  登録日:2016年8月2日 

    権利者:THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF ARKANSAS;NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KAGAWA UNIVERSITY;OCHSNER CLINIC FOUNDATION

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  • Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone

    Joshua Sakon, Osamu Matsushita, Robert C. Gensure, Tulasi Ponnapakkam

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    出願人:The Board of Trustees of the University of Arkansas; National University Corporation Kagawa University; Ochsner Clinic Foundation

    出願番号:US2008/004589  出願日:2008年4月9日

    公表番号:WO2008/124166 A3  公表日:2008年10月16日

    特許番号/登録番号:CA 2 683 862 C  登録日:2016年8月2日 

    権利者:The Board of Trustees of the University of Arkansas;National University Corporation Kagawa University;Ochsner Clinic Foundation

  • 新規酵素活性ポリペプチド及びそれを用いる融合タンパク質切断キット

    松下 治, 岡部 昭延, 鄭 昌敏

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    出願人:生化学工業株式会社

    出願番号:特願平9-310887  出願日:1997年11月12日

    公開番号:特開平11-137256  公開日:1999年5月25日

    特許番号/登録番号:特許第4484971号  登録日:2010年4月2日 

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受賞

  • 黒屋奨学賞受賞

    1999年4月   日本細菌学会   ガス壊疽菌群のコラゲナーゼに関する研究

    松下 治

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共同研究・競争的資金等の研究

  • 絞扼性神経障害に関与するT細胞サブセットの同定と神経ペプチド による治療法の開発

    研究課題/領域番号:21K09308  2021年04月 - 2024年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    高相 晶士, 松下 治, 廣澤 直也, 佐藤 雅, 宮城 正行

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    配分額:4160000円 ( 直接経費:3200000円 、 間接経費:960000円 )

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  • バイオミメティック Veing Wrapping による末梢神経障害治療法の確立

    研究課題/領域番号:20K09415  2020年04月 - 2023年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    井上 玄, 内田 健太郎, 松下 治, 大鳥 精司, 馬渕 洋, 宮城 正行

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    配分額:4290000円 ( 直接経費:3300000円 、 間接経費:990000円 )

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  • コラーゲン結合型FGF-2による水平性歯槽骨吸収に対する歯周組織再生療法の開発

    研究課題/領域番号:19H03831  2019年04月 - 2023年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(B)  基盤研究(B)

    高柴 正悟, 松下 治, 平山 晴子, 山本 直史, 美間 健彦, 伊東 孝

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    配分額:17030000円 ( 直接経費:13100000円 、 間接経費:3930000円 )

    本研究は,水平性骨吸収に対する歯周組織再生療法を実現するために,既に歯科臨床で応用されている塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)と細菌由来のコラーゲン結合ドメイン(CBD)を組み合わせた融合タンパク質(CBFGF)を用いた研究である。本研究の目的は,CBFGFの最適化とイヌを用いた実験モデルによる非臨床試験データの取得である。2019年度は,認可済みのbFGF製剤に合わせて,CBFGFを組換融合型から架橋型へ変更するための実験とイヌの骨欠損モデルを用いた実験を実施した。まず,CBFGFの最適化について,架橋反応の比率・濃度などの反応条件を決定するために,多量のbFGFとCBDを要した。そこで,大腸菌生産系を用いてbFGFとCBDを精製し,実験効率の改善を図った。現在は,CBDとbFGFを架橋する適切な条件を探索しているところである。また,イヌを用いた実験モデルでは,歯周組織再生療法の適応症である垂直性骨欠損(2壁性)で組換融合型CBFGFの有効性を実証し,水平性骨欠損および垂直性骨欠損(1壁性)を作製して,組換融合型CBFGFを投与した。現在,動物へのタンパク質の投与は終了し,一部のサンプルはCT撮影まで行っている。
    また,組換融合型CBFGFについてこれまでに得られたデータについては,研究発表(Takashiba S, International Academy of Periodontology, 2019;Nakamura S, et al, International Association of Dental Research, General Session & Exhibition, 2019;岡本ら,日本歯科保存学会,2019;高柴,BioJapan 2019)を行って,今後の研究の進め方やCBFGFの製剤化に関して,様々な研究者や企業と情報交換を行った。

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  • ピロリ菌除菌療法における腸内エコシステム破綻のメカニズムと制御

    研究課題/領域番号:19K08395  2019年04月 - 2022年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    岡田 裕之, 後藤 和義, 横田 憲治, 松下 治, 田中 健大, 岡上 昇太郎

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    配分額:4160000円 ( 直接経費:3200000円 、 間接経費:960000円 )

    大学新入生において標準的なピロリ菌除菌レジメンの下で下痢・軟便を主とした副作用を起こす患者の腸内細菌叢に共通するファクターを見出すことを目的とする。さらにはメタゲノムデータと常在細菌叢の抗菌薬感受性を融合させることで、なぜ特定の菌叢を持つ(または持たない)ことでDysbiosisが起こるのか、そのメカニズムを説明する。さらに内視鏡的な胃炎、組織学的胃炎評価も行い、最終的に腸内細菌叢解析データと融合する。平成31年度(2019年度)から3年間にわたり岡山大学医学部・歯学部新入生(医学科・保健学科・歯学部)に対してピロリ菌検診を例年通り実施し、H.pylori-IgG抗体陽性例を本研究の対象とする。
    2019年度は新入生314人中17人が抗体陽性であった。抗体陽性者14人に内視鏡検査を行い、内視鏡的胃炎、組織学的胃炎の評価および菌株培養を行った。組織学的陽性例は現感染と診断した。組織学的胃炎、菌株培養陰性例に対しては、さらに尿素呼気試験も行い、それら3検査とも陰性の場合は抗体検査が偽陽性と判断し、未感染と診断した。その結果、現感染11名、未感染3名であった。現感染者には除菌治療を行い、除菌前、除菌1週後、2ケ月後の糞便採取を行うとともに、除菌前後2週間の排便回数も含めた消化管症状についてアンケートを実施した。未感染者に対しても1回糞便採取とアンケートを実施した。
    得られた糞便の核酸抽出を実施した。
    2020年度、2021年度新入生に対しても同様に進めていく予定である。

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  • 細菌性コラゲナーゼによる基質認識機構の解明と血管新生薬物シーズへの展開

    研究課題/領域番号:18K07111  2018年04月 - 2021年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    松下 治, 美間 健彦, 内田 健太郎

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    配分額:4420000円 ( 直接経費:3400000円 、 間接経費:1020000円 )

    細菌性コラゲナーゼは、触媒モジュールと基質アンカー・モジュールよりなる。塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を基質アンカー・モジュールと融合(CB-bFGF)して、bFGFをコラーゲン基剤に結合し、bFGFの組織修復能を局所で長期間発揮させることができた。本複合剤を整形外科領域で骨移植や重症骨折後の骨新生誘導に応用できた。
    本課題では、歯周病による歯槽骨の水平欠損に対する本複合剤の有用性をラット・モデルにより検討した。CB-bFGF固相化コラーゲンを骨欠損部に充填することで、有意な骨形成を誘導できた。オステオカルシン、proliferating cell nuclear antigen、オステオポンチン陽性細胞が増加することを示した(論文1)。生体内でのCB-bFGFの薬物動態と治療効果を明らかにするため、イヌを用いた前臨床研究を実施し解析を進めている(論文準備中)。
    CB-bFGFを用いた神経再生を試みた。「ナーブリッジ」は、我が国で開発された神経再生用医療機器である。ポリグリコール酸製の外鞘の内腔にコラーゲンを充填した構造を有し、神経欠損部に固定して中枢側から伸長する自己神経を末梢側へ誘導する。CB-bFGFにより神経再生に必要な血管などの支持組織を効果的に誘導できれば、本機器による神経再生を促進できる。15mmにわたり坐骨神経を欠損したラット・モデルを作成し、CB-bFGFを固相化したナーブリッジによる神経再生を組織学的、行動学的に検討した。8週後のミエリン繊維の再生は、CB-bFGF群ラットでは7/8 (87.5%)、bFGF群では3/8 (37.5%) 、PBS群では1/8 (12.5%)に認められた。また4週後の歩行機能を足跡面積を用いて評価したところ、CB-bFGF群ラットは、bFGF群、PBS群より優位に広範囲の歩行が認められた(論文2)。

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  • 腸管スキャフォールドとコラーゲン結合型成長因子を用いた拍動性グラフトの創成

    研究課題/領域番号:18K08759  2018年04月 - 2021年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    笠原 真悟, 松下 治, 王 英正, 美間 健彦

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    配分額:4030000円 ( 直接経費:3100000円 、 間接経費:930000円 )

    組織工学を用いた臓器再生研究の分野で、脱細胞化した心臓に心筋細胞を移植する
    ことで拍動が得られることが報告された。また、脱細胞化した腸管を組織工学の鋳型として利用できることも報告された。これまでに我々は、細菌性コラゲナーゼのコラーゲン・アンカー部を用いて結合組織やコラーゲン基剤に成長因子をアンカリングすることで、その効果を持続的に発揮させられることを示した。
    2019年度は、ラット小腸を腸間膜動静脈を含め脱細胞化して足場とし、心筋細胞の増殖と血管新生を誘導する種々の成長因子をアンカリングしつつ、ラット新生児の心臓由来細胞を播種することで、栄養血管を備えた拍動する心筋の筒を作製しようと考えていた。
    まずラット小腸の脱細胞化を試みた。生体から小腸を採取し、動静脈にカニュレーションし、界面活性剤を24から48時間程度還流することにより脱細胞化できることを確認した。続いて、脱細胞化した小腸の細胞外マトリックスを足場として、心筋細胞を生着させようと試みた。従来我々が用いていた解放空間における灌流装置で、脱細胞化小腸にラット新生児心筋細胞を付着させ培養液を還流したが、良好な成育は認められなかった。心筋の破砕の程度、還流流量などを変化させたが、十分な生着といえる成果は得られなかった。そこで、温度、湿度、CO2濃度を管理できるインキュベータ内で培養すべく、小型の還流装置を試作した。しかしながら最適な還流量の確立が困難で、現在足場素材、大きさの再検討、それに対する流量の検討を進めている。

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  • 注入型局所硬化ゲルを用いた幹細胞・成長因子送達による新規難治性骨折治療法の開発

    研究課題/領域番号:18K09079  2018年04月 - 2021年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    内田 健太郎, 松下 治, 馬渕 洋

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    配分額:4420000円 ( 直接経費:3400000円 、 間接経費:1020000円 )

    移植型、局所投与型骨形成促進剤の利点を併せ持つ新規骨形成促進材料を開発すべく検討を行った。昨年度までにデキストラン(Dex)を主骨格とする局所硬化ゲル(Dexゲル)にbFGFを含有させることでマウス骨折モデルにおける骨形成を促進できることを示した。しかし、難治性骨折モデルに対する効果は十分ではなかった。本年度はヒアルロン酸(HA)を主骨格とする局所硬化ゲルとBMP2の併用による骨形成促進効果を検討した。マウス難治性骨折モデルを作製後、骨折群(control群)、局所硬化ヒアルロン酸ゲル投与群(HA群)、BMP-2含有局所硬化ヒアルロン酸ゲル投与群(HA+BMP-2群)を作成した。骨折後4週で屠殺して大腿骨を採取後micro CTを撮影し、骨折部における新生骨量(BV)、骨塩量(BMC)を測定した。また、骨折部の骨癒合率を評価した。また、新生仮骨を採取し、real time PCR法にてalkaline phosphatase、osterix、osteocalcinの発現量を検討したほか、組織学的にも評価した。control群、HA群と比較し、HA+BMP-2群で4週におけるBV、BMCの高値を認めた。HA+BMP-2群では、micro CT画像および組織切片標本において新生仮骨による骨折部の架橋を認め、骨癒合率も有意に高かった。新生仮骨におけるアルカリホスファターゼ、オステリックス、オステオカルシンの発現量もHA+BMP-2群で有意に高かった。BMP-2含有局所硬化ヒアルロン酸ゲル剤は、難治性骨折モデルにおいて骨癒合を促進することが可能であった。本方法はBMP-2の局所送達による新規難治性骨折治療法として有用である可能性が示唆された。

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  • 高齢者脊椎固定術において確実な骨癒合を実現する機能性間葉系幹細胞シートの創生

    研究課題/領域番号:17K10982  2017年04月 - 2020年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    井上 玄, 内田 健太郎, 馬渕 洋, 宮城 正行, 松下 治

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    配分額:4680000円 ( 直接経費:3600000円 、 間接経費:1080000円 )

    超高齢社会を迎えた我が国において、高齢者の脊椎固定術が確実に増加している。間葉系幹細胞分離技術と細胞積層技術、成長因子アンカーリング技術を用いて機能性間葉系幹細胞(MSCs)シートを作製した。マウス後側方固定術(PLF)モデルに移植し、骨癒合促進能を検討した。積層細胞では単層培養細胞に比べ有意にBMP2,TGFB,VEGFの発現が高かった。特にBMP2発現は単層細胞に比べ60倍高かった。コラーゲン結合型bFGF(CB-bFGF)およびBMP-2を結合、吸着させた積層細胞シートは高い骨形成能を有していた。CB-bFGF/BMP-2/hMSCs複合体は脊椎固定術における骨癒合に有用かもしれない。

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  • ボツリヌス毒素の疼痛抑制効果の分子基盤解明と応用的研究

    研究課題/領域番号:26350499  2014年04月 - 2017年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    山本 由弥子, 松下 治, 小熊 惠二, 松香 芳三, 小出 隆規, 丸濱 功太郎

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    配分額:4810000円 ( 直接経費:3700000円 、 間接経費:1110000円 )

    ボツリヌス毒素(BoNT)の疼痛抑制効果の分子機構を解析するために、BoNTの活性測定系の開発と蛍光標識全長BoNTの作製を行った。また、4種の抗SNAP-25ペプチド抗体を作製して、三叉神経節培養細胞においてBoNT/AまたはBoNT/Eの投与によりSNAP-25が切断されることを示した。このことから、神経障害性疼痛に対するBoNTの疼痛抑制効果は、末梢に投与されたBoNTが知覚神経節でSNAREタンパク質を切断して神経伝達物質の遊離を減少させることにより得られることが示唆された。

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  • 細菌分子による宿主細胞外マトリックスの認識機構の解明と薬物シーズの探索・顕在化

    研究課題/領域番号:26460527  2014年04月 - 2017年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    松下 治, 内田 健太郎, 美間 健彦

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    配分額:4940000円 ( 直接経費:3800000円 、 間接経費:1140000円 )

    人喰いバクテリアと呼ばれる細菌は、膠原線維を水解するコラゲナーゼを産生して組織を侵襲する。本酵素は触媒ドメインの他にPKDドメインとコラーゲン結合ドメインを持つ。PKDはコラーゲンへの結合に関与しており、線維芽細胞成長因子をPKD-CBDを用いてコラーゲン基剤にアンカリングした骨新生誘導用の新規複合剤について特許を取得した。また、PKDの立体構造を決定してコラーゲン結合に関する分子基盤を解明した。

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  • 成長因子固相化技術を応用した革新的骨軟骨移植法の確立

    研究課題/領域番号:26462277  2014年04月 - 2017年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    小沼 賢治, 松下 治, 内田 健太郎, 齋藤 亘, 井上 玄, 占部 憲

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    配分額:4810000円 ( 直接経費:3700000円 、 間接経費:1110000円 )

    同種骨軟骨移植の成績向上を目的に、成長因子固相化同種骨軟骨移植を行った。実験1)ラット大腿骨顆部を用いて、成長因子固相化の至適条件(浸漬時間)を検討した。実験2)ウサギ大腿骨顆部から採取した円柱状の骨軟骨組織を、保存液中で1週間保存後、成長因子(bFGF)を固相化し、ウサギ骨軟骨欠損モデルに移植した。移植後4および8週間後の組織をμCTおよび組織標本にて評価した。成長因子固相化をしなかった標本をコントロールとした。結果:実験1)15 分の反応で、軟骨組織表層にbFGF-CBDが結合した。実験2)bFGFを固相化した標本はコントロールと比較して、μCTおよび組織学的には明らかな差は認めなかった。

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  • コラーゲン結合型VEGF-Cによる効果的なリンパ管新生の研究

    研究課題/領域番号:26462731  2014年04月 - 2017年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    松本 洋, 松下 治, 杉山 成史, 美間 健彦

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    配分額:4810000円 ( 直接経費:3700000円 、 間接経費:1110000円 )

    リンパ浮腫に対する新たなる治療法開発を目指し、コラーゲン接着型VEGF-Cの生産とその効果の検証を試みた。ガス壊疽菌の毒素の一部であるコラーゲン結合ドメインとリンパ管新生因子VEGF-Cの融合タンパクを作成し、昆虫細胞を用いた融合タンパクの生産系を確立した。コラーゲン接着試験により、コラーゲン結合能を確認した。しかし、リンパ管内皮細胞に対する増殖活性等が確認出来ず、MAPKシグナル伝達でもリン酸化シグナルが検出出来なかった。原因としては分泌経路を辿っていないため生理活性を有していない可能性が考えられた。シグナルペプチドを付加したタンパクを設計し生産を試みたが、生産には至らなかった。

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  • 成長因子アンカーリング型運動器再生シーズの顕在化・育成研究

    研究課題/領域番号:26293341  2014年04月 - 2017年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(B)  基盤研究(B)

    高相 晶士, 内田 健太郎, 松下 治, 大鳥 精司, 井上 玄

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    配分額:11960000円 ( 直接経費:9200000円 、 間接経費:2760000円 )

    本研究では、骨再生シーズの実用化と軟骨再生、末梢神経再生への応用を目指して検討を行った。コラーゲン結合型塩基性線維芽細胞増殖因子(CB-bFGF)の臨床応用に向けてタンパク質をコードする遺伝子のコドン最適化を行い、CB-bFGFのbFGF活性を損なうことなく、タンパク質の産生効率を向上させることに成功した。細胞配行性コラーゲンチューブ(OCT)にbFGFを結合させることで早期に末梢神経組織の再生、運動機能の回復が可能であった。産学連携で作製した新規高密度コラーゲン材料は既存のコラーゲン材料に比べ、強度、軟骨再生能に優れていた。これらのマテリアルは運動器再生に有用であると考えられた。

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  • 機能性人工骨膜組織の創生と難治性骨折治療への応用

    研究課題/領域番号:25670659  2013年04月 - 2015年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 挑戦的萌芽研究  挑戦的萌芽研究

    高相 晶士, 内田 健太郎, 松下 治, 馬渕 洋, 井上 玄

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    配分額:3770000円 ( 直接経費:2900000円 、 間接経費:870000円 )

    本研究では骨間葉系幹細胞分離技術と成長因子アンカーリング技術を駆使した機能性人工骨膜組織の創世と難治性骨折治療法の確立を目指し検討を行った。コラーゲン膜状に間葉系幹細胞を積層し、人工骨膜組織を作製した。その結果、2日間で高い栄養因子産生を有する人工骨膜組織を作製することが可能であった。さらに、CB-bFGF と人工骨膜組織を反応させることで機能性人工骨膜組織の作製が可能であった。ラット大腿骨膜上に移植した所、機能性人工骨膜組織偽手術群、間葉系幹細胞積層シートのみ移植した群に比して比べ高い骨形成促進作用を有していた。機能性人工骨膜組織は難治性骨折治療法として有用である可能性が示唆された。

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  • 細菌分子によるマトリックス・アンカーリングの機構解明と実用化を目指した前臨床研究

    研究課題/領域番号:23590516  2011年 - 2013年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    松下 治, 安達 栄治郎, 井上 浄, 森 望, 内田 健太郎, 美間 健彦, 宮下 武憲

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    配分額:5330000円 ( 直接経費:4100000円 、 間接経費:1230000円 )

    人喰いバクテリアと呼ばれる細菌は、組織のコラーゲンを水解する酵素であるコラゲナーゼを産生する。本酵素の一部であるコラーゲン結合ドメイン(CBD)は、安定な小分子であり、サンドイッチ様構造をとってコラーゲン分子のらせんが緩んだ部分に結合した。細胞増殖を促進するタンパク質である成長因子とCBDを連結し、組織の膠原線維、脱灰骨、コラーゲン基剤に結合させることで、骨新生や血管新生を誘導することができた。

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  • コラーゲン細線維の積層と細胞成長因子の固相化による人工組織の実用化に関する研究

    研究課題/領域番号:22300167  2010年 - 2012年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(B)  基盤研究(B)

    安達 栄治郎, 赤池 敏宏, 田川 陽一, 西山 敏夫, 松下 治, 服部 雅一

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    配分額:17290000円 ( 直接経費:13300000円 、 間接経費:3990000円 )

    コラーゲン溶液から結合組織を再構成するリアクターと細胞成長因子を用いることにより様々な人工組織を作り上げることが出来る。この手法により3層からなる人工肝臓を作成することが出来た。実験動物に移植をすると人工肝臓には毛細血管が侵入しやすいことが明らかになった。同じ手法を円筒形の織布について適応するとその内面に結合組織と血管表皮細胞の2層を再構成することが出来た。肝臓などの実質臓器と血管などの管腔組織を再構成できることが明らかになった。

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  • 融合タンパク質とナノワイヤー加工を用いた新しい人工股関節再置換術の基礎技術研究

    研究課題/領域番号:21591923  2009年 - 2011年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    成瀬 康治, 糸満 盛憲, 占部 憲, 松下 治

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    配分額:4680000円 ( 直接経費:3600000円 、 間接経費:1080000円 )

    人工股関節再置換、再々置換術の際に生じる広範囲骨欠損に対する新しい再建術技術の開発を目指し、その基礎研究を実施した。分子生物学的ツールとしてコラーゲン結合型ホルモンや成長因子を、医用工学的ツールとして金属表面ナノワイヤー加工技術を用いて、これまでの保存同種骨/人工関節複合体を用いた関節機能再建術の大幅な改善を試みた。その結果、コラーゲン結合型塩基性線維芽細胞増殖因子が有用であることが明らかになった。

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  • 細菌性コラゲナーゼの基質結合ドメインを用いた薬物送達システムの開発型研究

    研究課題/領域番号:20590452  2008年 - 2010年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    松下 治, 小出 隆規, 玉井 栄治, 宮田 茂, 南 純三朗

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    配分額:4810000円 ( 直接経費:3700000円 、 間接経費:1110000円 )

    「人喰いバクテリア」が産生するコラーゲン分解酵素は、コラーゲン細線維に結合する領域(CBD)をもつ。まずCBDの中で結合に直接関与する部位を明らかにした。次にCBDはコラーゲン分子の三重らせん構造が緩んだ部位を志向して一定の向きに結合することを示した。さらに、CBDの接続部はカルシウムを結合して構造が変わり、CBDの安定性と結合能が向上することを示した。最後に、CBDを用いて種々の生理活性物質を組織に結合させる新規の技術が種々の再生医療に応用できることを示した。

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  • イプシロン毒素遺伝子における新規Bent DNAの転写調節機構について

    研究課題/領域番号:18590428  2006年 - 2007年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    岡部 昭延, 宮田 茂, 成谷 宏文, 松下 治, 玉井 栄治

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    配分額:3860000円 ( 直接経費:3500000円 、 間接経費:360000円 )

    イプシロン毒素遺伝子のBent DNAはプロモーターから下流にかけて存在し、さらに構造遺伝子内にも第2の弱いBent DNAを含む領域があり、上流とともに発現制御に関与することが明らかとなった。この領域をPCRにより増幅してプラスミドに組み込み、大腸菌からプラスミドを回収したところ、下流のBent DNAの中の8つのadenineからなるA-tractの最後のadenineが欠失していた。この特殊なBent構造は、プラスミドを不安定にすると考えられた。ウエルシュ菌のLrpCとHis-tag付きのLrpCの遺伝子を、発現ベクターpFFに組み込み、ウエルシュ菌のstrain 13,SM101株を形質転換した。形質転換株での産生量は、ともにわずかであり、この系による精製は困難であった。精製を困難にする理由の一つは、精製の際にプロテアーゼの混入により分解が起きることである。活性の強いチオール・プロテアーゼの欠失変異株を構築したので、この菌を用いて精製を試みている。野生株と形質転換株の性状を比較検討したところ、枯草菌と同様に、LrpCの芽胞形成への関与が示され、その機能を確認した。イプシロン毒素遺伝子のBent DNAを含むDNA断片をPCRで増幅して、LrpCとの結合性を検討した。強制発現した形質転換株と野生株の菌体破砕物(細胞質画分)を用いて、gel retardationを行ったところ、特異的な反応を証明する結果は得られなかった。His-tagを持つLrpCも機能性を有することが示唆されるたので、大量培養の菌体からNi-Chelating Sepharoseを用いて精製することを進めている。一方、枯草菌と同様に、大腸菌系での発現が可能であると考えられるので、その精製を進めている。その一方で、菌体の破砕物を用いた実験を行うために、LrpCのノックアウト株を構築した。現在その変異株と野生株からの菌体破砕物を用いてgel retardation assayを行っている。

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  • 細菌性コラゲナーゼのカルシウム依存性コンフォメーション変換に係る学際的研究

    研究課題/領域番号:18590429  2006年 - 2007年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    松下 治, 宮田 茂

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    配分額:3930000円 ( 直接経費:3600000円 、 間接経費:330000円 )

    クロストリジウム属細菌が産生するコラゲナーゼのC末端にはコラーゲン結合ドメイン(CBD)が存在する。前に本ドメインを生理活性物質と融合し薬物送達システム(DDS)に活用できることを示した。また、DDSに適した新規分子をデザインするため、X線結晶学的にドメイン構造を決定し、アラニン・スキャンにより結合に重要な残基を決定した。本ドメインはβサンドイッチ構造をとり、1)側面のβストランドと直角に、2)1)と同様だが逆向きに、3)斜めに、基質が結合するモデル、計三種が示された。今回、結合様式を確定するため、コラーゲン様ペプチドを用いてNMRによるPerturbationassayを行った。15N標識CBDのHSQC解析を行い、10残基を残してピークを帰属できた。基質アナログ(Pro-Hyp-Gly)10の添加によりピークのシフト/消失が起こる残基を特定し、CBDの構造モデルにプロットしたところ、これらはβストランドと直行した位置にあり、モデル3が否定された。さらにN末端をスピン標識した基質アナログを用いて同様の実験を行ったところ、特定の残基(V87)が追加的に消失した。したがって、V87の近傍に基質のN末端が結合するモデル1が結合様式を反映していると考えられた。次に、実用性の高いDDSを例示するため、副甲状腺ホルモン(PTH)とCBDの融合タンパク(PTH-CBD)を作製し,PTHの骨形成効果が持続的に作用するか否かを検討した。八週齢のマウスの腹腔内にPTHまたはPTH-CBDを80ug/kg/dose(PTH当量)を週1回8週間投与し、骨密度をDXA法で測定したところ、PTH-CBDでは対照に比し有意な骨密度の上昇が認められた。また、月1回の投与とした場合でも4か月後から骨密度に有意差が認められた。CBDの構造を利用したDDSの骨粗鬆症に対する応用の可能性が示された。

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  • 細菌性コラゲナーゼによる宿主細胞外マトリックスの分子認識にかかる学際的研究

    研究課題/領域番号:16590363  2004年 - 2005年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    松下 治, 小出 隆規

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    配分額:3600000円 ( 直接経費:3600000円 )

    Clostridium属細菌のコラゲナーゼ(CloCols)のC末端には、細胞外マトリックスの主成分である不溶性コラーゲンに結合するためのドメイン(CBD)が存在する。昨年度の本研究により、遺伝子進化の過程でCBD領域の複製・欠失が繰り返されたことが明らかとなった。CBDの起源を探るため、生命情報科学的検索を行ったところ、Proteobacteria由来の金属プロテアーゼCloColsと同様のドメイン構成を見いだした。そのC末端に存在するPPCドメインはCBDと構造的に類似していたが、CBDに共通に存在するN末端リンカーと基質結合性残基を欠いていた。PPCと共通の起源を有する単純なドメインがコラーゲン結合に必要な構造を獲得し、CBDに進化したと考えられた。(平成18年3月3日J Bacteriol誌に投稿)N末端側リンカーによるCBDとCa^<2+>の結合を等温滴定型熱量計を用いて解析したところ、CBD 1molあたりCa^<2+> 2molの結合が見られた。解離定数は2.13μMおよび4.63μMであり、細胞内外のCa^<2+>濃度の中間であった。Ca^<2+>の有無とドメインの安定性を熱変性により検討したところ、Ca^<2+>非存在時は48℃で変性が始まったが、Ca^<2+>存在下ではドメイン構造は82℃まで安定であった。CloColsが細胞外に分泌された後、CBDはN末端リンカーによりCa^<2+>を結合してドメインを安定化することが確認できた。種々の二価カチオンの存在下でCBDの結晶化を試みたところ、Co^<2+>の存在下でN末端側リンカーが新たなコンフォメーションをとることが見いだされた。(投稿準備中)水溶液中でのコンフォメーション変換過程を詳細に検討するため、^<15>N,^<13>C標識したCBDを作製してNMR解析を進めており、現在主鎖の約70%のシグナルの帰属が完了したところである。

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  • ベントDNAによる低温依存性転写促進機構の構造生物学的研究

    研究課題/領域番号:15590404  2003年 - 2004年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    片山 誠一, 松下 治

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    配分額:3600000円 ( 直接経費:3600000円 )

    本研究の目的は、ウェルシュ菌α毒素(ホスホリパーゼC)遺伝子プロモーター上流のベントDNA (phased A-tracts)とRNAポリメラーゼ(RNAP)αサブユニット(315aa)がそのC末端ドメイン(αCTD,79aa)を介してどのように結合しているのか立体構造を明らかにすることである。そのためには、phased A-tracts DNA断片(33bp)とRNAPαサブユニットまたはαCTDとの共結晶が必要となる。まずウェルシュ菌RNAPαサブユニットとαCTDのN末端にHis-tagを付加し、大腸菌内で大量合成させ、His-tagを用いて精製した。両タンパク質とも結晶化できるほど精製できたが、最終精製量は、1リットル当たり数mgと少なく、結晶化に必要な50mgには及ばなかった。Joshua Sakon博士(米国:University of Arkansas)らとの討論で、phased A-tracts DNAとαサブユニットまたはαCTDの結合体が共結晶化できるほど低温(25℃)で安定した構造を保っているか調べる必要があることを指摘された。この問題点の解消や大量精製系の確立が進まず残念ながら結晶化までは至らなかった。Phased A-tractsとαCTDとの相互作用に関与するアミノ酸の同定するために、RNAP(α2、β、β'、σ)の再構成系の確立を試みた。封入体となったβ、β'サブユニットを尿素で、σ因子を塩酸グアニジンで可溶化し再構成すると、わずかながら転写活性がある標品が得られた。αサブユニットN末端ドメインを用いた時にも同様の活性が認められた。このことは、αCTDにアミノ酸置換を施した場合でも再構成が可能であることを示唆している。このRNAPの再構成法により、αCTDを介した転写調節メカニズムの研究が飛躍的に進展することが期待される。

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  • ウェルシュ菌ε毒素、α毒素の作用機構に関するラフトロジー的解析

    研究課題/領域番号:15390144  2003年 - 2004年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(B)  基盤研究(B)

    岡部 昭延, 松下 治, 宮田 茂, 玉井 栄治, 小林 良二, 徳田 雅明

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    配分額:15400000円 ( 直接経費:15400000円 )

    ウエルシュ菌による家畜類の腸性毒素血症の原因毒素であるε毒素、およびヒトガス壊疽の原因毒素であるα毒素について、毒素作用の分子機構を明らかにすることを目的に研究を行った。ε毒素は、神経細胞の脂質ラフトに親和性を示し、7量体を形成し、膜透過孔を形成する。本研究では、ラフトの脂質環境の変化がε毒素のラフトへの結合や7量体形成にどのように影響を及ぼすかについて検討した。ラフトの主要構成脂質であるコレステロールの除去、合成阻害はε毒素の7量体形成を阻害するが、他の主要脂質であるスフィンゴ脂質の合成を、フモニシンB1で阻害した場合、MDCK細胞の毒素感受性が増加した。RDMPでスフィンゴ糖脂質の合成を阻害した場合でも同様な結果であった。他方、スフィンゴミエリンを合成阻害した場合は、毒素感受性が減少した。ガングリオシドGM1を添加した場合、毒素の結合、7量体形成、毒素感受性は減少した。MDCK細胞の培養時間の延長に伴いガングリオシドが増加し、毒素感受性が低下すること、本菌が産生するシアリダーゼで処理すると、毒素感受性が増加したことから、ガングリオシドの増加は、シアル酸増加を導き、その結果毒素の結合を阻害すると結論した。次に、ガス壊疽の主要な原因と考えられているα毒素による血小板凝集と、ラフト及びその脂質環境の関係性について検討した。ホスホリパーゼCとスフィンゴミエリナーゼ活性を有するα毒素は、血小板のラフトに高い親和性を示し、かつラフトに濃縮されたスフィンゴミエリンを分解しセラミドを産生すること、変異毒素はラフトへの結合性を示すが血小板凝集を示さないこと、α毒素は脂質ラフトを凝集すること、抗セラミド抗体は血小板凝集を抑制することを明らかにした。このことから、α毒素のスフィンゴミエリナーゼ活性により産生されるセラミドの作用により、ラフトのクラスター化が惹起され、血小板凝集のシグナル伝達が導かれると結論した。

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  • 特殊ベント・プロモーターを利用した新規高発現ベクターの構築

    研究課題/領域番号:14657069  2002年 - 2003年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 萌芽研究  萌芽研究

    岡部 昭延, 玉井 栄治, 宮田 茂, 松下 治

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    配分額:3400000円 ( 直接経費:3400000円 )

    ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)のフェレドキシン遺伝子のプロモーターの上流域からプロモーター内部にかけて存在する5つの連続するPhased A-tractsは、新しいタイプのBent DNAであり、その折れ曲がり角度は110°と強い。上流3つのA-tractsと下流2つのA-tractsの相乗作用によりフェレドキシンのプロモーターを活性化することを明らかにした。この特殊なベント・プロモーターをC.perfringens/Escherichia coliのシャトル・ベクター兼プロモーター選択ベクターであるpPSVにクローン化し、高発現ベクターpFFを構築した。C.perfringens/pFF系の有用性を調べるために、C.perfringensの75kDaのシアリダーゼ(NanI)の構造遺伝子とpFFをTranscriptional fusionし、pFFNを構築した。対照として、nanI遺伝子の全領域を組み込んだベクターpPSVNを構築した。さらにAT-rich遺伝子の高発現系として開発されたE.coli BL21(DE3)CodonPlus-RILにおけるNanI産生能と比較するために、pUC19にnanIをクローン化した。C.perfringes/pFFNは、C.perfringens/pPSVNの60倍、大腸菌系の約15倍の産生を示した。培養液100mlから2段階精製法で約3mgの高純度のNanIが精製された。以上のことから、C.perfringens/pFF系はシアリダーゼの高発現系に有用であることが明らかとなった。pFFの有用性について、120kDaのコラゲナーゼ遺伝子についても同様に検討したところ、発現量の改善は見られたが、C.perfringens菌そのものを培養した時と同様に、分解産物も認められた。コラゲナーゼ産生のためには、今後Protease欠損の変異株の利用や培養条件などについて検討する必要があることが明らかとなった。

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  • コラーゲン・アンカーリング機能を付与した新規ワクチンに関する基盤研究

    研究課題/領域番号:14570239  2002年 - 2003年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    松下 治

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    配分額:3600000円 ( 直接経費:3600000円 )

    X線回折によりClostridium histolyticumクラスIコラゲナーゼのコラーゲン結合ドメイン(CBD)の立体構造を決定したところ、10本のβストランドからなるサンドイッチ構造を有することが明らかになった。コラーゲン結合部位を明らかにするため、タンパク質表面の残基に網羅的に部位特異的変異を導入し、変異タンパク質のコラーゲン結合能(Kd)を、mini-Collagen分子,Gly-(Pro-Pro-Gly)_8を固相化したセンサー・チップを用いた表面プラズモン共鳴法(BIACORE)により定量した。変異導入により結合能が大きく低下した残基は、サンドイッチの片側にある疎水性シートの中央部に集中していた。CBDはこのホット・スポット領域により基質に結合すると示唆された。
    CBDはCa^<2+>依存的に不溶性コラーゲンに結合する。X線回折により、2つのCa^<2+>イオンがサンドイッチ側面に全く新しい様式で結合していることが見いだされた。Ca^<2+>の結合に伴って、CBDのN末端側リンカーはαヘリックスからβストランドへコンフォメーションを変えることも示された。この変化により、CBDのタンパク変性剤(尿素)に対する耐性が増加するとともに、基質への結合能が向上していた。
    新たに3菌種のClostridium由来のコラゲナーゼを精製し、6菌種のコラゲナーゼ遺伝子を決定したところ、これらの酵素のドメイン構成は多様であることが示された。これは、CBDが遺伝子進化の途上で重複を繰り返したためと考えられる。
    触媒ドメイン(CD)の構造と機能について解析するため、これらの新たに決定したコラゲナーゼ遺伝子に由来するCDをGST融合タンパク質として大量精製することに成功した。C.histolyticumクラスIIコラゲナーゼについては、針状結晶が得られたので、結晶条件の最適化を行っているところである。

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  • ウェルシュ菌イプシロン毒素の構造生物学的ならびに分子病理学的研究

    研究課題/領域番号:13470060  2001年 - 2002年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(B)  基盤研究(B)

    岡部 昭延, 小林 良二, 宮田 茂, 松下 治, 徳田 雅明, 徳光 浩

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    配分額:10300000円 ( 直接経費:10300000円 )

    Clostridium perfringensのε毒素(N末端にFactor Xa siteを導入し、His-tag付加したもの)をSeleno-methionine置換し、その結晶構造を解析した。Twin crystalのコンピュター解析を行ったが、構造決定には至っていない。ε毒素のHeptameric poreの形成は脂質ラフトに依存することを明らかにした。さらにラフトの脂質組成が膜孔形成に及ぼす影響について検討した。ラフト脂質の主要成分であるコレステロールの除去はヘプタマーの形成を阻害し、ガングリオシドの合成阻害はヘプタマー形成を促進した。このことからラフト膜の脂質環境が毒素分子の集合や膜挿入に影響を与える可能性が示唆された。分子病理学的な検討を行うために、マウスに^<35>S_-標識毒素を投与し、Whole body autoradiographyを行い、全身の臓器への分布を調べた。腎臓、脳、脊髄ならびに鼻粘膜に毒素の集積が見られた。最も集積の著しい腎臓の組織内分布を調べるために、免疫染色を行ったところ、糸球体、毛細血管への顕著な分布が認められ、遠位尿細管、集合管にも多量の毒素が検出された。腎臓の病理学的変化としては、糸球体の収縮と集合管上皮の軽度の変性・脱落が見られた。しかし脳の変化(血管周囲の浮腫、神経細胞変性)に比し軽微であった。腎臓における毒素蓄積の生物学的意義を明らかにするため、腎摘出マウスを用いてε毒素投与後の死亡時間を計測した。非摘出マウスに比し、死亡時間が顕著に短縮した。α毒素、ボツリヌス毒素では腎摘出は死亡時間を短縮させず、ε毒素の腎臓への集積は、中枢神経系に対する致死的な毒素作用を軽減するための生体防御であると結論した。Yeast two hybrid systemを用いてレセプター蛋白を構成するペプチドと考えられる遺伝子を単離し、その解析を進める一方、毒素耐性MDCK細胞を用いて、レセプターの同定と毒素作用の分子機構について解析を進めている。

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  • 水素ガス産生用ウエルシュ菌バイオリアクター開発のための基礎研究

    研究課題/領域番号:12877048  2000年 - 2001年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 萌芽的研究  萌芽的研究

    岡部 昭延, 宮田 茂, 松下 治, 片山 誠一

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    配分額:1800000円 ( 直接経費:1800000円 )

    ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)を用いた水素ガス産生用バイオリアクター開発のための基礎研究として、培養条件とヒドロゲナーゼ関連の遺伝子改変の影響について検討した。C. perfringens NCTC8237株をTYG培地で培養し、水素ガス産生に対する培地のpHの影響を調べた。pHを調整しない場合、増殖とともにpHは低下し、水素ガスは60%であるのに対し、pHを7.4に維持した場合、90%に改善された。ガス成分比では大きく改善されたが、水素ガス量は改善されなかった。pH未調整の場合も、培養の初期においては水素ガスの成分比は高く、培養が進むにしたがって低下した。C. perfringens strain 13からクローニングしたビドロゲナーゼ遺伝子(hydA)をpJIR418をベクターとして遺伝子投与し、水素ガス産生性を調べた。ガス成分比、水素ガスの産生量において、非投与菌との間に有意な差は見られなかった。hydAの発現量は増加していることから、ヒドロゲナーゼの活性が水素ガス産生の律速ではないことが明らかとなった。本菌の主要な発酵経路である酢酸発酵、酪酸発酵はヒドロゲナーゼへの電子の供給と競合すると考えられるが、上記のpH調製時の場合と同様、遺伝子投与の場合もこれら発酵産物の産生は影響を受けなかった。hydA遺伝子の下流に位置するbutylate kinase(buk)の遺伝子破壊により酪酸発酵への電子の供給を遮断することを試みた。しかし変異菌は得られず、本遺伝子は必須と考えられた。ヒドロゲナーゼに電子を供給するフェレドキシン(Fdx)の菌体内の濃度を高めることにより、水素ガスの産生が増加することを期待し、すでに決定されたゲノムの塩基配列を基に、fdx遺伝子のクローニングを行った。本遺伝子には独特のベント構造と鉄制御に関係する配列を有していることが明らかとなった。本遺伝子の投与と鉄添加により水素ガス産生能の改善の可能性が示唆された。

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  • 細菌性コラゲナーゼのコラーゲン結合ドメインに基づく機能性薬物の設計と応用-細菌性毒素の新しい応用を目指して-

    研究課題/領域番号:12670258  2000年 - 2001年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    松下 治, 西 望, 片山 誠一

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    配分額:3300000円 ( 直接経費:3300000円 )

    Clostridium histolyticum クラスIコラゲナーゼのC末端には二つのコラーゲン結合ドメイン(CBD)が存在する。Caイオンの存在下、非存在下でC末端側ドメインのX線回折による構造決定を行った。Caイオンの結合によりN末側リンカーの構造がαヘリックスからβシートに変化し、βサンドイッチ構造の安定化と基質結合能の向上に寄与する事が明らかとなった。(米国University of Arkansas, Joshua Sakon博士らとの共同研究)基質への結合様式を推定するため、ドメイン表面に配向する種々のアミノ酸残基の部位特異的変異体を得た。コラーゲン様ペプチドを固相化したセンサー・チップを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて、基質結合能(Kd)を測定したところ、サンドイッチの片面に基質結合性残基が集中している事が明らかとなった。
    I型以外のコラーゲンを豊富に含む腎臓・軟骨・動脈壁などの組織を固定・包埋後、ポスト法によりCBDを結合させ、免疫組織染色を行って、光顕的、電顕的にCBDの結合を検討した。CBDは種々の組織に結合し、結合には周期性が認められなかった。またin vitroでCBDは種々の型のコラーゲンに結合した。以上よりCBDは基質の三重螺旋構造を認識して結合することが示唆された。
    3種のゼラチン分解性Clostridium属細菌からコラゲナーゼを精製し、その構造遺伝子をクローン化して塩基配列を決定した。予想一次構造の比較から、これらは互いに異なるセグメント構造を有していることが明らかとなった。CBDの一次構造の比較から、CBDは歴史的に重複を繰り返してきたことが示された。

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  • 神経細胞に特異的なカルシウム結合蛋白質calbrainは記憶の形成に関与する

    研究課題/領域番号:11694284  1999年 - 2000年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(B)  基盤研究(B)

    徳田 雅明, 岡部 昭延, 杉本 勝良, 小林 良二, 竹内 義喜, 山口 文徳, 松下 治

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    配分額:3800000円 ( 直接経費:3800000円 )

    神経細胞においては細胞内カルシウムイオンの濃度変化によりさまざまな機能制御がなされている。我々の発見したcalbrainというEFハンド構造を持つカルシウム結合蛋白質は、このカルシウムイオンの変化を仲介するセンサーとして働いていることが推察された。その結果、以下の結果を得た。
    1.Calbrainは2個のEF-hand構造を有し、calmodulin(CaM)と高い相同性を有する。calbrainはCaM kinaseIIへのCaMの結合と競合し、そのKiは129mMであった。またCaM kinaseIIの活性及び自己リン酸化はcalbrainにより阻害された。
    2.Calbrainは海馬のスライスを用いたlong-tem potentiation(LTP)実験で、LTP成立後に急速にダウンレギュレートされることが判明した。この結果はLTP時に海馬スライスにおいてCaM kinase IIの活性化が起こることをよく説明している。
    3.CaM kinase Iが海馬の神経細胞において主として細胞質に存在し、LTP形成後に発現量が増加すること、また一部のCaM kinase Iは核に移行することが判明した。LTP形成のメカニズムのひとつと考えられた。
    4.虚血後の海馬神経細胞死は低体温法によりある程度抑制できるが、NMDA receptorの発現は細胞体周辺に多く、樹状突起にはむしろ減少していることが判明した。またLTP形成能も低体温1週間後には悪くなっていた。
    5.6%アルコールを慢性的に投与したアルコール依存症マウス脳において、グリア細胞の変化をGFAPにより解析したところ、視索上核の背腹側部において急激なグリア細胞の増生が起こっていた。
    6.S100A12の機能を解析すべく大腸菌において発現し大量に精製することに成功した。

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  • ウェルシュ菌イプシロン毒素の向神経性と神経細胞障害の分子機構に関する研究

    研究課題/領域番号:11470069  1999年 - 2000年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(B)  基盤研究(B)

    岡部 昭延, 宮田 茂, 片山 誠一, 松下 治, 徳田 雅明, 小林 良二

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    配分額:14300000円 ( 直接経費:14300000円 )

    ウェルシュ菌のε毒素のレセプター分布について、^<125>I標識の活性型毒素をマウスの静脈内に投与しwhole body autoradiographyを行った。脳と腎臓以外に、甲状腺、胃、唾液腺などにも集積していた。Iodolysisが考えられたので、^<14>C標識毒素で同様の実験を行った。この場合、脳脊髄と腎臓に特異的な集積が認められた。組織切片の免疫染色では、海馬を中心とする脳の広範な部分と、腎臓では糸球体に主に結合が見られた。毒素のaffinity chromatographyで精製した一次抗体を用いたが、非特異的な染色が見られた。組織成分中にこの抗体と反応する蛋白が存在しており、それぞれの組織成分で吸収した抗体、モノクローン抗体での免疫染色を試みている。シナプトソーム膜に対する毒素の作用機構を^<125>I標識毒素を用いて検討した。膜にはモノマー状態の活性型毒素が検出されるが、インキュベーションとともに、毒素複合体が形成されること、毒素複合体は7量体であることが明らかとなった。不活性の前駆体毒素(C末端のプロペプチドを持つ)は複合体を形成しないが、活性型毒素による複合体形成を濃度依存的に阻害する。したがってC末端プロペプチドはおそらくレセプター結合部位ならびに膜との相互作用に影響を与えないが、複合体形成に必要な領域をマスクしていると考えられた。数種類の神経培養細胞の毒素感受性を調べたが、分化誘導の有無に関わらず、感受性を示さなかった。レセプターの分離同定のためのシステムとして、大量のシナプトソーム膜の調製法(アルカリ処理)と分別可溶化法を考案し、さらに高感度の免疫学的検出方法(毒素との結合性を抗毒素抗体で検出-slot blotとwestern blot)と、毒素affinity chromatographyを確立した。現在、45kDaの蛋白を主要成分とする数種類の蛋白にまで精製され、最後の同定を試みている。腎臓からの単離も同様なレベルで進行している。

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  • ウェルシュ菌α毒素遺伝子のプロモーター上流に存在するベント構造の機能解析

    研究課題/領域番号:10670260  1998年 - 1999年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    片山 誠一, 松下 治, 岡部 昭延, 南 純三朗

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    配分額:3200000円 ( 直接経費:3200000円 )

    ウェルシュ菌ホスホリパーゼC遺伝子(plc)のプロモーター上流には3つのphased A-tracts(-66〜-40)が存在する。この領域は折れ曲がり(ベント)構造を形成し、プロモーターとRNA polymerase(RNAP)との接触領域の拡張により転写開始複合体の形成を容易にする。面白いことにこのベントDNAの折れ曲がりの度合いが増強される低温ほど、下流のplcプロモーターの転写促進が顕著に観察された。このことはphased A-tractsによる転写促進が低温依存的であることを示している。(Katayama,S.et al.1999.EMBO J.18(12):3442-3450.)
    3つのphased A-tractsがRNAPのどの部位と結合するのかを明らかにすることはベントDNAの転写促進の分子機構を解明するために重要である。これまでの大腸菌RNAPに関する知見から、phased A-tractsはRNAPαサブユニットと結合する可能性が高いと考えられる。このことを示すために、まずウェルシュ菌RNAPαサブユニットの遺伝子(rpoA)を含む領域1.6kbをPCRで増幅し、その全塩基配列を決定した。このrpoA遺伝子の塩基配列から予測されたアミノ酸配列は、精製したウェルシュ菌RNAPαサブユニットのN末端配列と一致した。rpoAのcoding regionをpET11-aに挿入後、大腸菌内で大量発現させ、αサブユニット(α-WT,315aa)を精製した。同様の方法でαサブユニットのN末端ドメイン(α-NTD,228aa)、C末端ドメイン(α-CTD,79aa)をそれぞれ精製した。
    3つのphased A-tractsとplcプロモーターを持つDNA断片(3AP)と精製α-WT、α-NTD、α-CTDを25℃で共存させ、gelretardation assayを行った。α-WTとα-CTDは3Apに結合したが、α-NTDは結合できなかった。この結果から、phased A-tractsにRNAPのαCTDが結合する可能性が示された。現在、3Apとα-WT、α-CTDの接触領域を明確にするため、ヒドロキシルラジカルフットプリンティングを用いた解析を進めている。

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  • ウエルシュ菌ε-毒素の活性化および作用機序の解析

    研究課題/領域番号:09670286  1997年 - 1999年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    松下 治, 南 純三朗, 片山 誠一, 岡部 昭延, 松下 治

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    配分額:3300000円 ( 直接経費:3300000円 )

    1.ウエルシュ菌のε-毒素は不活性な前駆体として産生される。λ-毒素、トリプシン、およびキモトリプシンによるε-毒素前駆体の活性化の機序について検討した。λ-毒素、トリプシンおよびトリプシンとキモトリプシンを作用させたときの活性化毒素のマウスに対するLD50はそれぞれ110ng/kg体重、320ng/kg体重、65ng/kg体重であった。ε-毒素前駆体はλ-毒素によってN末端側より10アミノ酸残基が、C末端側より29アミノ酸残基が切断除去されて活性化された。トリプシンではN末端側より13アミノ酸残基が、C末端側より22アミノ酸残基が切断除去されて活性化された。トリプシン作用後さらにキモトリプシンを作用させるとC末端アミノ酸がさらに7残基切断除去され、毒素活性が上昇した。以上の結果から、N-末端およびC-末端両側での切断がε-毒素の活性化に必要であると思われる。
    2.ウエルシュ菌のε-毒素が脳の神経細胞、とくに海馬の神経細胞を傷害することを明らかにした。ε-毒素(50ng/kg)をラットに静注したのち、脳の神経細胞への影響を調べたところ、主に海馬の神経細胞に核濃縮を伴う細胞の変形が認められた。次に、海馬の神経細胞傷害を抗MAP2抗体による免疫染色によって観察した。ε-毒素非投与時に比較して明らかな神経細胞核周囲部や樹状突起における染色性が欠落しており、細胞骨格にも傷害が及んでいるていることが明らかとなった。また、海馬のTimm法による亜鉛染色をおこなったところ、ε-毒素投与後における染色性の相違が認められた。さらに、グルタミン酸レセプターの拮抗剤、および前シナプスからのグルタミン酸放出の阻害剤によってε-毒素投与時における海馬の神経細胞傷害が抑えられたことより、ε-毒素が海馬におけるグルタミン酸作動系を異常に亢進させ、神経細胞に傷害を与えることが示唆された。

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  • コラーゲン結合ドメインによるガス壊疸の発症予防

    研究課題/領域番号:09770184  1997年 - 1998年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 奨励研究(A)  奨励研究(A)

    松下 治

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    配分額:1900000円 ( 直接経費:1900000円 )

    ガス壊疸菌群によるガス壊疸感染巣の成立と周辺組織への浸潤には、起因菌の産生するコラゲナーゼが重要な役割を演じると考えられる。本酵素の構造活性相関を明らかにし、その知見を予防に応用することが本研究の課題である。
    平成9年度は、本酵素群のうちの一つ(C.histolyticum ColH,クラスI酵素)が、N末側の水解活性ドメインとC末側のコラーゲン結合ドメイン(CBD)により構成されていることを明らかにした(Matsushita et al.,J.Biol.Chem.273:3643-3648,1998)。ついで2種類の酵素(C.histolyticum ColGおよびColH)から種々の長さのC末端領域を生産し、そのコラーゲン結合能を測定したところ、クラスI酵素(CoIG)ではデュプリケートして、クラスII酵素(ColH)では単独で存在するC末端領域(約120アミノ酸残基)がCBDの最小構成単位であることが明らかとなった。
    平成10年度は、まず、これらの酵素の遺伝子がC.histolyticumの染色体上に独立した転写単位として存在していること、本菌はこれら以外にはコラゲナーゼ遺伝子を有していないことを明らかにした(Matsushita et al.,J.Bacteriol.181:923-933,1999)。これらの基礎的知見に基づき、クラスI酵素(ColG)のC末側のCBDを精製し、家兎を免役して抗体画分を精製した。現在、得られた抗体をもちいてマウスを受動免役し、これがC.histolyticumのマウス致死活性に影響を与えるか否かを検討しているところである。さらに、この領域でよく保存されているアミノ酸残基を順次アラニンに部位特異的に置換し、変異CBDを有する融合タンパク質を生産した。現在、これらの変異ペプチドの基質結合能を測定し、基質と直接相互作用している部位の特定を試みている。

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  • ウエルシュ菌のホスホリパーゼC遺伝子結合蛋白の機能解析

    研究課題/領域番号:08670308  1996年 - 1997年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    岡部 昭延, 片山 誠一, 松下 治, 南 純三朗

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    配分額:2500000円 ( 直接経費:2500000円 )

    ガス壊疽の原因菌であるウェルシュ菌の主要な病原因子は、α毒素(ホスホリパーゼC)である。ホスホリパーゼCの遺伝子(plc)の発現は、プロモーター上流の折れ曲がりDNAと、コーディング領域へのDNA結合タンパクの結合による二重の調節を受けている。この調節の機構を明らかにすることは、ガス壊疽の病態を解明するために重要である。plc遺伝子結合タンパクの性状を明らかにするために、結合領域を含むDNA断片を用いたゲルシフト・アッセイを指標に、部分精製を行った。最終標品をSDS-PAGEで分画し、4種のペプチドをゲルから抽出し、各々についてDNA結合活性を調べたところ、56Kのペプチドが結合タンパクであることが明らかとなった。そのN末端アミノ酸配列を決定し、混合プライマーを合成し、ウェルシュ菌の染色体DNAを鋳型にPCRを行い、94bpのDNA断片を得た。これをプローブにして、6kbのEcoRI断片をクローニングした。塩基配列を決定したところ、N末端アミノ酸配列に一致する部位が確認された。この領域は54kのペプチドをコードしており、類似性検索により、この遺伝子はhemD-cysGCであることが判明した。この遺伝子をシャトル・ベクターにクローン化して、結合タンパクを欠損するstrain13に形質転換し、そのextractを用いて、plc遺伝子結合活性を調べたところ、そのような活性は認められなかった。この遺伝子の発現が不十分であったか、あるいはクローニングした56Kのタンパクが目的の結合タンパクではなく、偶然同一の分子量を持つヘム合成タンパクが混在したためと考えられる。なお、折れ曲がりDNAについては、温度感受性の制御に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。

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  • ウェルシュ菌MSCLチャンネルによる病原遺伝子発現制御に関する研究

    研究課題/領域番号:08770193  1996年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 奨励研究(A)  奨励研究(A)

    松下 治

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    配分額:1100000円 ( 直接経費:1100000円 )

    mscL遺伝子の前後で相同組換えを行うことにより、mscLウエルシュ菌の作製を試みた。
    まず、mscL遺伝子が薬剤耐性遺伝子により分断された組換え用DNA断片を作製した。colAから下流約5kbを含むpKY3134プラスミドにコードされたmscL遺伝子内のHincII部位に、pJIR418シャトル・ベクターより単離したクロラムフェニコール耐性遺伝子(Cm^r)断片(1331 bp)の挿入を試みたが、大腸菌中で組換え体を得ることができなかった。そこで、mscL下流側の約0.3kb断片を含むpKY3136プラスミドにCm^rとmscL下流側の約1.8kb断片を順次連結し、組換え用DNA断片を含むpKJ3プラスミドを作製した。各段階の正確な連結は、塩基配列を決定して確認した。
    次に、pKJ3プラスミドをSmaI切断し、10μgの線状DANを用いてC.perfringens strain 13の形質転換を試みたところ、3株のクロラムフェニコール耐性を得ることができた。これらの株の染色体DNAを調製し、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片をプローブとしてサザン・ハイブリダイゼーションを行ったところ、予想された長さの断片一つのみが検出された。ところが、pKJ3プラスミドのベクター・プラスミドであるpUCプラスミドをプローブとしたハイブリダイゼーションでもシグナルが検出された。このことから、これらの株は菌体内で再環状化したpKJ3プラスミドが、一回の相同組換えにより染色体上に挿入された変異株であると考えられた。
    そこで、pKJ3プラスミドを二つの異なる制限酵素(SacI,SphI)で切断し、再環状化不可能な線状の組換え用DNAを得た。現在、このDNAによるstrain13の相同組換えを試みている。

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  • ガス壊疽菌プロテアーゼのプロ領域ペプチドの機能解析

    研究課題/領域番号:06770202  1994年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 奨励研究(A)  奨励研究(A)

    松下 治

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    配分額:900000円 ( 直接経費:900000円 )

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  • Clostridium perfringensのα毒素遺伝子結合蛋白の機能解析

    研究課題/領域番号:05670259  1993年 - 1994年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 一般研究(C)  一般研究(C)

    岡部 昭延, 松下 治, 南 純三朗, 片山 誠一

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    配分額:2200000円 ( 直接経費:2200000円 )

    Clostridium perfringensのα毒素遺伝子(plc)の調節の機構を明らかにすることを目的に研究を行った。plcに対する結合蛋白の遺伝子クローニングを試みた。pUC19上のplc遺伝子のcoding region内にクロラムフェニ-コル(Cm)耐性遺伝子(catp)のリボゾーム結合配列から転写のタ-ミネーターまでを含む領域を挿入したプラスミドを作製した。このプラスミドを用いて、C.perfringens Strain 13を形質転換した。得られたCm耐性菌を調べたところhomologous recombinationにより、catpは染色体上のplc geneと融合しており、reporterとなりうることを確認した。この菌を受容菌とする形質転換の条件では100μg/mlのCmで微小コロニーを形成した。type A NCTC 8237株のDNA libraryをpJIR418と上記の変異株を受容菌として作製した後、200μg/mlのCmを含む培地で生育するtransformantの選択を試みた。すなわちplc遺伝子に結合するtrans-acting factorはcatp遺伝子の発現を高め、その結果耐性度を高めるとの想定に基づくものである。しかし、そのようなクローンは得られなかった。その原因として高濃度のCm存在下でcatP遺伝子が改変したためか、あるいはコピー数の多いプラスミドを用いてDNA結合蛋白をクローニングしようとしたために細胞にとって有害となり目的の菌が得られなかった可能性がある。
    C.perfringensからRNA polymeraseを精製し、またPlc高度産生菌のtype A NCTC8237からDNA結合蛋白を部分精製した。これにより plc geneの転写を結合蛋白の存在、非存在下で試験管内で調べるための系を確立した。上流のDNA結合蛋白の結合する領域に存在するbent DNAはplc遺伝子の転写を促進する、またその効果は低温で著しいという重要な知見を得た。

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  • ガス壊疽菌コラゲナーゼの反応機構の解析

    研究課題/領域番号:05770193  1993年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 奨励研究(A)  奨励研究(A)

    松下 治

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    配分額:900000円 ( 直接経費:900000円 )

    1.性状の解析
    本酵素の性状をアゾコール分解活性を指標に解析した。活性はpH4.5〜9.0の広い範囲で認められ、至適pHはホウ酸バッファーで7.2、リン酸バッファーで7.0であった。至適温度は42°Cであった。10mM CaCl_2存在下で1mMのo-phenanthrolineの添加により完全に阻害された。これらの結果から、本酵素はNeutral metalloproteaseである事が示唆された。酵素標品中の2価金属イオンを、5mM過剰のEDTA添加とSephadex G-10カラムによって除去した後、種々の2価金属イオンを再添加して、金属イオン要求性を調べた。30muMnoZn^<2+>添加によって酵素活性が最も回復したのにたいし、Ca^<2+>では1mM以上の濃度が活性の回復(90%)に必要であった。また、Mg^<2+>では約30%の回復しか得られなかった。以上より、本酵素はZn-proteaseであると結論された。
    2.産生系の確立
    本酵素の金属結合部位を特定するためには、部位特異適突然変異導入による解析が有効である。その前段階として、本酵素の大腸菌中での発現系を得る事を試みた。本酵素構造遺伝子をプラスミド上でT3 promorterの下流に連結し、え.coli BL21(pTG119)にtransformした。本菌では、IPTG添加によりT3 RNA polymeraseの発現が誘導され、その結果collagenaseの大量生産が可能なはずである。ところが実際には、IPTGを添加すると菌の増殖が停止し、collagenase活性の誘導は僅かであった。ペリプラスム画分からImmunoblottingによりcollagenase関連抗原を検出を試みると、authentic proteinと同じ分子量の抗原は僅かであり、分子量の小さい抗原が多種多量に観察された。転写または翻訳レベルでの酵素産生の中絶が示唆された。
    以上の問題を解決するため、本来の宿主であるC.perfringensの持つcollagenase遺伝子(colA)をgene targettingにより除去し、colAを持つplasmidをC.perfringens colA変異株に形質転換する事により、本酵素の構造活性相関に関する詳細な解析を進める予定である。

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  • 分子生物学的手法による酸耐性セルロース分解菌の作成と,反芻獣肥育事故防止への応用

    研究課題/領域番号:03770237  1991年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 奨励研究(A)  奨励研究(A)

    松下 治

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    配分額:800000円 ( 直接経費:800000円 )

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  • マイコプラズマ肺炎の発症早期迅速診断のための抗原検出法の開発と確立

    研究課題/領域番号:02557023  1990年 - 1991年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 試験研究(B)  試験研究(B)

    金政 泰弘, 浅野 真理, 松下 治, 小谷 信行, 国富 泰二, 平井 義一

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    配分額:5700000円 ( 直接経費:5700000円 )

    我々はマイコプラズマ肺炎の発症早期迅速診断のための臨床検査診断法として咽頭よりMycoplasma peumoniaeを迅速に検出する間接蛍光抗体法(IF)とラテックス凝集反応(LAT)を確立し臨床検体(咽頭ぬぐい液)で検討を加えた。又同様の方法としてDNAーprobe法(DP)が市販されているため、IFとLATの2法とDPとの比較検討を行った。
    まずウサギにてM.pneumoniaeに対する抗体を作成した。この抗体はM.pneumoniaeのみではなく多種のマイコプラズマに対して反応した。しかし、培地成分である馬血清および酵母抽出液と反応する画分を抗体より吸収・除去するとM.genitalium以外のマイコプラズマに対する交差反応はすベて消失した。吸収・除去後の抗体はM.genitaliumと反応したが、この反応はM.pneumoniaeに対するものに比べ弱くまたM.genitaliumは泌尿生殖器の棲息菌であるため、咽頭からのM.pneumoniae検出には問題ないと考えられた。このM.genitaliumとの交叉反応はDPでも同様の状況である。
    最高検出菌数(感度)はIF:約2×10^5CFU/ml、LAT:2×10^5CFU/ml、DP:5×10^4CFU/mlであり、DPが最も優れていた。一方実際の臨床検体(咽頭ぬぐい液)では血中抗体価上昇によりM.pneumoniae感染と確定した患者よりの検体中IF陽性は85.7%であった。培養陽性の検体中ではIF陽性73.3%、LAT陽性63.3%、DP陽性26.6%、であり、感度において最も優れていたDPが臨床検体での陽性率では最も低値であった。
    M.pneumoniae菌液を37℃で保温しておき、これより経時的に菌液を取りだしLATおよびDPにて測定した。LATでは測定値(凝集陽性最高希釈倍率)は三日間変化しなかったが、DPでは測定値(検出cpm)は時間単位で激減した。従ってLATおよびIFの検出する抗原は安定で咽頭にて集積効果が期待できるのに対し、DPの検出するリボゾ-ムRNAはすみやかに分解されることが判明した。臨床検体でのDP陽性率が低いのはこのことが一因と考えられる。
    最終的に我々が検討した3方法(IF,LAT,DP)ではIFが最も臨床検体で検出率が高いが、この方法は判定にある程度の習熟をする必要があることなど問題点もある。一方LATは非常に簡便で、臨床検査室で容易に行い得る。又検体処理法の改善で感度上昇の余地があり、このLATの実用化に向けさらに努力したい。

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担当授業科目

  • 医学セミナー(テュートリアル) (2021年度) 第1学期  - 火2~3

  • 医学セミナー(チュートリアル) (2021年度) 第1学期  - 火2~3

  • 医歯科学概論 (2021年度) 集中  - その他

  • 基礎病態演習 (2021年度) 特別  - その他

  • 心筋梗塞特論 (2021年度) 特別  - その他

  • 感染症と戦う (2021年度) 第2学期  - 木1~2

  • 生体防御医学演習 (2021年度) 特別  - その他

  • 病原細菌学I(演習・実習) (2021年度) 特別  - その他

  • 病原細菌学I(講義・演習) (2021年度) 特別  - その他

  • 病原細菌学II(演習・実習) (2021年度) 特別  - その他

  • 病原細菌学II(講義・演習) (2021年度) 特別  - その他

  • 社会医歯科学 (2021年度) 集中  - その他

  • 細菌学 (2021年度) 特別  - その他

  • 細菌学実習 (2021年度) 特別  - その他

  • 医学セミナー(テュートリアル) (2020年度) 第1学期  - 火2,火3

  • 医学セミナー(チュートリアル) (2020年度) 第1学期  - 火2,火3

  • 医学教育実習 (2020年度) 特別  - その他

  • 医歯科学概論 (2020年度) 集中  - その他

  • 医科学実習 (2020年度) 特別  - その他

  • 医科学実習Ⅰ (2020年度) 通年  - その他

  • 医科学実習Ⅱ (2020年度) 通年  - その他

  • 医科学演習 (2020年度) 通年  - その他

  • 基礎病態演習 (2020年度) 特別  - その他

  • 心筋梗塞特論 (2020年度) 特別  - その他

  • 感染症と戦う (2020年度) 第2学期  - 木1,木2

  • 歯科学実習 (2020年度) 通年  - その他

  • 歯科学実習Ⅰ (2020年度) 通年  - その他

  • 歯科学実習Ⅱ (2020年度) 通年  - その他

  • 歯科学演習 (2020年度) 通年  - その他

  • 生体防御医学演習 (2020年度) 通年  - その他

  • 生体防御医学総論 (2020年度) 通年  - その他

  • 病原細菌学I(演習・実習) (2020年度) 特別  - その他

  • 病原細菌学I(講義・演習) (2020年度) 特別  - その他

  • 病原細菌学II(演習・実習) (2020年度) 特別  - その他

  • 病原細菌学II(講義・演習) (2020年度) 特別  - その他

  • 細菌学 (2020年度) 特別  - その他

  • 細菌学実習 (2020年度) 特別  - その他

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学術貢献活動

  • 第94回日本細菌学会総会

    役割:企画立案・運営等

    日本細菌学会  2021年3月23日 - 2021年3月25日

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    種別:学会・研究会等 

    添付ファイル: jsb2021-poster.pdf

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  • 第68回日本細菌学会中国・四国支部総会

    役割:企画立案・運営等

    日本細菌学会中国・四国支部  2015年10月3日 - 2015年10月4日

     詳細を見る

    種別:学会・研究会等 

    添付ファイル: のぼりa1.pdf

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