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転座型がん遺伝子の新規核酸医薬品の探索
Grant number：23nk0101669h0001 2023.10 - 2025.03
国立研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED) 創薬支援推進事業・創薬総合支援事業
大内田守、伊藤佐智夫
Authorship：Coinvestigator(s)
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肺がんにおける癌関連遺伝子MYNNとp53の相互制御機構の解明
Grant number：21K08668 2021.04 - 2024.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
伊藤 佐智夫, 堺 明子, 大内田 守
Grant amount：\4160000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\960000 ）
これまでに申請者は、マウス尾静脈接種実験を行い、MYNN過剰発現細胞では肺への癌細胞の浸潤および定着が亢進すること、MYNN発現抑制細胞では浸潤および定着が抑制されることを発見した。またMYNNとp53が直接結合していること、DNA損傷刺激によるp53の活性化でMYNNタンパク質量が減少すること、MYNN過剰発現でp53およびp21が減少すること、MYNN抗体を用いたクロマチン免疫沈降 (ChIP)でMYNNがいくつかのp53標的遺伝子の調節領域に結合することを発見した。
まずp53によるMYNNの発現調節機構を転写制御および転写後抑制から検証した。p53の過剰発現に伴いMYNN mRNAは僅かながら減少がみられたため、MYNNの調節領域・遺伝子領域に存在するp53レスポンスエレメント (p53RE)を同定し、それらp53REをルシフェラーゼレポータープラスミドにクローニングする。p53-wtをもつA549・H460ヒト肺腺癌細胞に構築したルシフェラーゼレポータープラスミドを導入し、エトポシド等のDNA切断型抗がん剤でp53を活性化させた後、ルシフェラーゼ活性を計測した。その結果では有意差は確認されなかったが引き続き検証を行う。また、p53活性化に伴い発現誘導されるmicroRNA (miRNA)が報告されており、申請者は、これらmiRNAの標的配列をMYNN mRNA-3’UTR上で確認している。p53活性化後、miRNAの発現亢進をTaqMan miRNAアッセイで、MYNNタンパク質発現低下をウェスタンブロット法で検証した。miRNA発現ベクターとMYNN-3’UTRの標的配列（wt/mut）をもつルシフェラーゼレポータープラスミドをそれぞれ構築してルシフェラーゼ活性を計測した。その結果、1つのmiRNAによる転写後抑制が確認された。 -
CDH17多型とそれに伴うスプライシング変異による短鎖タンパク質の機能解明
Grant number：20K08308 2020.04 - 2023.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
堺 明子, 伊藤 佐智夫, 笹井 香織
Grant amount：\4030000 （ Direct expense: \3100000 、 Indirect expense：\930000 ）
カドヘリン17（CDH17）の短鎖型タンパク質は、肝がんの腫瘍部において特異的発現がみられ、患者の生命予後と関連することが報告されている（Wang, XQ et al., Clin. Cancer Res., 2005 and 2006）。肝がんにおけるCDH17の発現はそもそも異所性であることに加え、短鎖型CDH17は、遺伝子内の特定のSNPによってスプライシング変異が誘発され、早期停止コドンが出現することによるものである。膵がんにおいても上記SNPと発症との間に相関がみられることから、我々は、膵がんにおける短鎖型CDH17タンパク質の機能解析解明を試み、１）膵がん細胞におけるRNAおよびタンパク質レベルの発現を確認し、２）膜結合部位の欠損に伴い、短鎖型CDH17が培地中に遊離して分泌型タンパク質として機能しうることを明らかにした。３）作製したオーダーメイド抗体は、期待通り、短鎖型CDH17のみを検出した。４）短鎖型CDH17の発現実験では、明らかながん化促進能はみられなかったことから、５）膵がんではとくに重要である間質細胞の膵星細胞株hPSC-14を入手し、膵がん細胞との共培養条件での短鎖型CDH17の機能評価を試みた。
以上のように、短鎖型CDH17は、膵がん細胞で発現し、培地中に放出されることにより、膵がん発症のオッズ比を高めると考えられる。同タンパク質の間質細胞への影響を詳細に評価し、当初の目的に沿って、抗体アレイ解析によるシグナル経路の解明を予定していたが、申請者の退職により、本研究は2021年度で廃止となった。 -
転写制御破綻によるトリプルネガティブ乳癌発症メカニズムの解明と新規治療標的の探索
Grant number：18K08596 2018.04 - 2022.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
笹井 香織, 伊藤 佐智夫, 片山 博志
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
トリプルネガティブ乳癌（TNBC）は進行がはやく極めて予後が悪い。しかしながら、明確な治療標的が存在しないため効果的な治療法が確立されていない。代表者は、細胞分裂期に染色体均等分配を調節するオーロラAの過剰発現マウスがTNBC様の癌を発症すること、オーロラAがTNBCの遺伝子発現プロファイル異常の一因である転写因子Xと核内で相互作用することを見出した。本研究では、TNBC特異的な遺伝子発現異常におけるオーロラA / 転写因子Xパスウェイの全貌を明らかにし、TNBCが抱えるトランスレーショナルリサーチの問題克服を目指す。
オーロラAは転写因子Xをリン酸化することでオーロラAを含む転写因子複合体の安定化を誘導し、標的遺伝子のプロモーター領域に結合することを突き止めた。このことは細胞周期のG 2 / M期進行に関与する遺伝子の発現調節にオーロラAの活性が関与していることを示唆した。転写因子Xの擬似リン酸化変異体発現細胞は、コントロールおよび非リン酸化変異体発現細胞と比較して、G 2 / M期遺伝子の発現増加と細胞増殖速度の増加を示した。より詳細に解析するため、同定した転写因子Xのリン酸化部位を特異的に認識する抗リン酸化抗体の作製を行った。
また、2種のヒストンアセチル化酵素YとZがオーロラAと結合し、アセチル化依存的なオーロラAの活性化とアセチル化非依存的なタンパク質安定化の両方を促すことを突き止めた。さらに、オーロラAのアセチル化部位の一部を特定し、抗アセチル化特異的抗体の作製を行った。 -
Role of Aurora kinase in RNA metabolism
Grant number：17K08762 2017.04 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Katayama Hiroshi
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
Here, we report for the first time the essential role of Aurora-A-hnRNP interaction in Aurora-B transcriptional regulation. The results can be summarized as follows: (1) hnRNP controlled Aurora-B mRNA decay by direct binding and transactivated Aurora-B promoter by indirectly affecting CHR region in the promoter. (2) Aurora-A phosphorylated hnRNP on at least two serine residues in vivo. (3) Aurora-A phosphorylation of hnRNP upregulated hnRNP’ transactivation activity to Aurora-B promoter. (4) Both hnRNP loss or overexpression overrode Taxol induced spindle checkpoint arrest and resulted in the production of polyploidy cells, resembling to the phenotypes observed by gain or loss of function of Aurora-B. (5) Both hnRNP loss or overexpression enhances cell motility. These results indicate that Aurora-A/hnRNP play an important role in chromosome stability by regulating Aurora-B RNA metabolism and the deregulation of this complex would promote tumorigenesis and metastasis.
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Grant number：16K10460 2016.04 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Ito Sachio
Grant amount：\4810000 （ Direct expense: \3700000 、 Indirect expense：\1110000 ）
The novel oncogene Myoneurin (MYNN) belongs to the BTB / POZ-Zinc Finger protein family. MYNN has a high frequency of gene amplification in lung cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, breast cancer, etc. Amplification of the MYNN-encoded chromosome 3q26 region has been confirmed in many cancers, and in recent years, the Cancer driver gene has been actively identified from this region. Since MYNN has strong transcription repressing ability, tumorigenicity, and p53 binding ability, it was considered that functional analysis of MYNN is very important for understanding carcinogenesis.
In this study, we have presented new findings on the functional interaction between MYNN and p53. -
Grant number：26293338 2014.04 - 2017.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
HIROHATA SATOSHI, NINOMIYA Yoshifumi
Grant amount：\16250000 （ Direct expense: \12500000 、 Indirect expense：\3750000 ）
Aggrecan is a major proteoglycan in cartilage and is degraded by aggrecanase. Aggrecanases plays a role in the early stage of osteoarthritis. This research aimed the integrated analysis of microRNAs whose targets are the aggrecanase mRNAs and extracellular matrix proteins. We try to examine how aggrecanases are regulated by microRNAs.
In this study, we first stimulated chondrocytic cells by cytokine as well as mechanical stress. We then compared the change of microRNA expression between two different stimulations. By using several database, we identified the target gene for microRNAs of interest. Then we added another stimulation condition and selected the microRNA of interest. We next examined the effect of inhibitor of microRNA and confirmed that inhibitor abolished the effect of microRNA. Finally, we confirmed that the target of microRNA is actually proteases that induced in osteoarthritis. In conclusion, we identified the novel microRNA that may play a role in osteoarthritis. -
Epigenetic abnormalities during onset and progression of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATL)
Grant number：25460437 2013.04 - 2016.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Oka Takashi, ITO SACHIO, OUCHIDA MAMORU, YOSHINO TADASHI
Grant amount：\5200000 （ Direct expense: \4000000 、 Indirect expense：\1200000 ）
We investigated the epigenetic mechanism of onset and progression of non-Hodgikin lymphoma as well as adult T-cell leukemia/lymphoma (ATL). We found that epigenetic abnormalities including unbalanced expression of Polycomb Repressive Complex (PRC) molecules, aberrant expression of miRNA and mRNA and also aberrant DNA methylation are playing the important role in the pathogenesis of ATL. Ezh2 was strongly expressed and polycomb repressive complex PRC1.4 dominates over PRC1.2 in aggressive lymphoma variants as well as ATL. Tax protein expression induced epigenetic heterogeneity with expanding the global DNA methylation profile to generate various epigenetic clones, suggesting that Tax-mediated epigenetic clonal heterogeneity and diversity may contribute to induce leukemic transformation and more aggressive clonal progression.
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Direct target genes of miRNAs involved in lung cancer
Grant number：24591905 2012.04 - 2016.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Ouchida Mamoru, OKA Takashi, ITO Sachio
Grant amount：\5330000 （ Direct expense: \4100000 、 Indirect expense：\1230000 ）
Lately, miR-17-92, which is highly expressed in malignant lung cancer cells, is considered the key miRNA for tumorigenesis. However, its direct targets remain under reported. We identified the FOXP1, TP53INP1, TNFAIP3, and TUSC2 genes as miR-19a targets, using luciferase, pull-down, and western blot assays. The four miR-19a target cDNA expression vectors suppressed cell viability, colony formation, migration, and invasion of lung cancer cells.
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Grant number：22591433 2010 - 2012
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
ITO Sachio, OKA Takashi, OUCHIDA Mamoru
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
In order to identify possible predictive markers, We performed the identification of miRNA related to the degree of differentiation-grade and malignancy by the profiling of esophageal cancer cell lines and esophageal cancer clinical specimens. In poorly differentiated cells, miR-29a and let-7b were overexpressed. We identified target genes of these miRNAs using in vitro pull-down method, and found some candidates of target genes related to tumor suppressor and apoptosis. Our results suggest that these miRNAs are involved in esophageal cancer progression.
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Grant number：22300346 2010 - 2012
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
SHIMIZU Kenji, SHINAGAWA Katuji, TOYOOKA Shinichi, OUCHIDA Mamoru, SAKAI Akiko, ITO Sachio
Grant amount：\17160000 （ Direct expense: \13200000 、 Indirect expense：\3960000 ）
We have aimed to clarify the nature of genetic predisposition for sporadic cancers, influenced by genetic polymorphisms, such as single-nucleotide polymorphism (SNP). By analyzing about 8,000 specimens, we found 53 SNP are related with at least one of 17 major cancers in Japan. Stratification of the data of the multiplied OR of overlapping SNP for each cancer and each individual revealed that about 15% and 1% of the Japanese represent the high- and the highest risk-group for most cancers, respectively. Other major findings are, about half of the SNPs at risk were replicated between two case/control data sets on 4 kinds of cancers, Risk-SNP combinations were largely different between genders, some SNPs were identified as those closely associated with cancer-progression or occurrence of specific gene alterations.
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Grant number：19790920 2007 - 2008
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Young Scientists (B) Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
ITO Sachio
Grant amount：\3380000 （ Direct expense: \3200000 、 Indirect expense：\180000 ）
本研究では食道癌におけるmicroRNA(miRNA)の発現パターンを解析し、発癌または癌抑制に関与するmiRNAの同定を試み、死亡率の低減を目指すための予防や早期発見法への応用に貢献できることを目的とした。食道癌臨床検体と食道癌細胞株についてマイクロアレイを用いて787種のmiRNAのスクリーニングを行った。その結果、腫瘍特異的または腫瘍分化度特異的に発現レベルの異なるいくつかのmiRNAを同定することができた。
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がん発症前高リスクに関わるがん体質遺伝素因の実体解明と試行的コホート解析
Grant number：18014017 2006 - 2007
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究 特定領域研究
清水 憲二, 大内田 守, 松原 長秀, 小出 典男, 堺 明子, 伊藤 佐智夫
Grant amount：\11100000 （ Direct expense: \11100000 ）
本研究は、日本人の肺癌、頭頸部癌、大腸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌における「発がんのリスク関わる遺伝子多型」を広汎に検索したものである。これまでに計225遺伝子、約270 SNPを解析した結果、有意差をもって上記の癌の発癌リスクに関わるミスセンスSNPを42遺伝子で計47種発見した(高リスク:34種、保護的SNP:13種)。42遺伝子にはDNA修復遺伝子、癌抑制遺伝子、物質代謝遺伝子、染色体分配遺伝子、細胞接着遺伝子等が含まれる。これらのms-SNPの多くは複数種の癌に関係し、多いものでは約8割の癌種に影響していた。上記のうち38 SNPの発癌リスクとの相関は、本研究で初めて示されたものである。
特筆すべきことは、本研究では対照健常人(約450検体)、癌患者(約1,300検体)共にほぼ全てのSNPを解析し、それらの重複のデータを得たことである。上記のうち、99%信頼区間も有意であった20遺伝子の24 SNPについて、癌種毎に関係する4〜7 SNPの個人別重複を数値化したところ、高リズクSNP数から保護的SNP数を差し引いた数値が上位20%に属する個人の割合は健常人で約4〜20%、癌患者で20〜60%を占めた。統計学的には、肺癌、大腸癌、食道癌についてはいずれもP値が10^<-10>〜10^<-16>、その他の癌では10^<-5>〜10^<-6>を示し、高い信頼性を示した。これらのグループの集団内発癌寄与率(PAR)は平均50%を占め、遺伝的リスクの過半を説明できることが判明した。さらに、我々は日本人の癌の約7割を占める肺癌、頭頸部癌、大腸癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌の各々について、約75%の低リスク群、25%の高リスク群、0.5-1.5%の超高リスク群を分別できる系を構築した。今後この系を前向きコホート研究で実証できれば、癌の予防と早期発見に革新的進展が実現できると期待される。 -
がん発症前高リスクに関わるがん体質遺伝素因の実体解明と試行的コホート解析
Grant number：17015030 2005
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特定領域研究 特定領域研究
清水 憲二, 大内田 守, 松原 長秀, 小出 典男, 堺 明子, 伊藤 佐智夫
Grant amount：\6900000 （ Direct expense: \6900000 ）
本研究では「がん体質遺伝」の実体に迫るために、がん関連候補遺伝子のミスセンス1塩基多型(ms-SNP)を広汎に検索してきた。これまでに計135遺伝子で205箇所のms-SNP候補を見出し、担がん患者(計344名)及び対照健常人集団におけるアレル分布を解析した。本年度は対照健常人検体数を約2倍に増やして(計202名)再検討した結果、昨年度までの19種と新規に8種のms-SNPが統計学的に有意なリスクを示した。この27種の内訳は、肺、頭頸部、大腸、食道、乳腺などのがんで高リスクSNPが21種(オッズ比;1.62〜14.2)と保護的SNPが6種(オッズ比;0.12〜0.61)を占め、DNAの修復/複製(7)、がん抑制(5)、染色体分配(5)、細胞周期制御(3)及びその他の機能(3)に関与する23遺伝子群であった。また27種のうち20種は複数種のがんに影響し、うち22種は本研究による新発見である。検体毎にms-SNPの重複(累積オッズ比:COR)を検討した結果、肺腺がんのリスクに関わる13種のms-SNP遺伝子型が重複し、CORが30以上を示す人は、健常人では5%で、肺腺がん患者では30%に達した(P=6.7x10^<-8>,OR=8.33)。同じく肺扁平上皮がんのリスク因子11種でCORが20以上の人は、健常人7.9%、肺扁平上皮がん患者59%であった(P=6.9x10^<-1>1,OR=16.6)。同様の傾向は頭頸部、大腸、食道などのがんでも認められ、健常人と患者群の平均CORは3〜15倍の差があった。このように、本研究で明らかになったms-SNP27種は、実際に発がんリスクの遺伝的背景となっていることが強く示唆された。以上の結果を協力病院の通院非がん患者246名について適用したところ、計34名で各種のがん発症リスクが特に高いことが判明したため、主治医による継続的フォローを開始した。
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胃癌における遺伝的発癌高リスクグループの遺伝的素因に関する研究
Grant number：14770643 2002 - 2003
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B) 若手研究(B)
伊藤 佐智夫
Grant amount：\3400000 （ Direct expense: \3400000 ）
胃における多段階発癌は、正常細胞から早期癌、進行癌に至る過程に、様々な遺伝的変異ならびに後成的な変化が蓄積している。胃癌は組織学的に高分化型と低分化型に大別されるが、これらの遺伝子異常の中には両方に共通するものとそれぞれに特異的なものがある。取り分け前者は癌の発生、後者は進展に関わるとされている。発癌に関する遺伝的要因は世界規模で研究がなされ、顕著な癌家系に関する研究はめざましく進展してきたが、一般的な発癌の高リスク群の遺伝的要因に関する知見は殆どない状況である。
本研究計画では胃癌においての遺伝的発癌の高感受性を遺伝子レベルで解析することにより、新しい癌関連遺伝子を検出・解析することを目的とした。
癌の体質遺伝に関与すると考えられる遺伝子をすべて同時に解析することは困難であるため、これまでに明確な報告がない遺伝子に焦点をおき、胃癌77検体を既知の癌関連遺伝子群(p53,RB,APC,PTEN,DPC2,DMBT1等)について8種のMSマーカーでLOH解析を行った。データベース上で遺伝性腫瘍との関連が示唆される染色体領域に位置するものについても9種のMSマーカーでスクリーニングを行った。その結果、既報のp53,RB,APCのLOHは高頻度であったが、他の癌遺伝子では20-40%程度であった。また候補群では2q24,4p15.3,17q21で40%程度であったが、その他のMSマーカーでは20%以下と胃癌における優位なLOHは検出することは出来なかった。
現在は新たな癌抑制遺伝子候補群マーカーでスクリーニングを開始しており、中程度のLOHが確認された2q24,4p15.3,17q21の領域については遺伝性腫瘍関連遺伝子候補としてエキソン・イントロン構造の解析を進めている。またMS-RDA法によりメチル化領域のことなる遺伝子を同定など新たな試みを検討している。 -
Studies on the Genetic Factors Influencing Predisposition to Cancer in High-risk Groups.
Grant number：12213084 2000 - 2004
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
SHIMIZU Kenji, OUCHIDA Mamoru, MATSUBARA Nagahide, SAKAI Akiko, ITO Sachio
Grant amount：\54500000 （ Direct expense: \54500000 ）
To explore the molecular nature of "Cancer Predisposition", we have performed comprehensive analyses on the differential distribution of missense-single nucleotide polymorphism (ms-SNP) of cancer-related genes between cases and healthy controls. Since 1999, we have done case-control studies on 103 ms-SNP in 335 cancer cases and 110 healthy controls and we found that 22 SNP significantly associated with cancer-risk including lung adenocarcinoma (LAD), lung squamous cell carcinoma (LSC), head and neck cancer (HNSC), colorectal cancer (CRC) and esophageal cancer (ECC). These risk-related 22 SNP included 3 SNP previously reported (in genes ADH1B, ALDH2 and TP53) and 19 SNP thus far undescribed in the literature and distributed among 20 genes consisting of 6 DNA-repair genes, 5 tumor suppressor genes, 5 chromosome-segregation genes and 4 others. Of these 22 SNP, 16 were of high-risk (SNP-H) with odds ratio (OR) 1.87-18.0 and 6 were protective SNP (SNP-L) with OR 0.18-0.54. In respect to each cancer-type, number of the affecting SNP including common ones were follows; LAD (8 SNP-H and 4 SNP-L), LSC (7 SNP-H and 2 SNP-L), HNSC (3 SNP-H and 2 SNP-L), CRC (3 SNP-H and 3 SNP-L) and ECC (2 SNP-H). Because all analyses were performed with the same specimens, it was possible to examine individually the perfect overlapping of the genotype at risk on these 22 SNP. A cumulative odds ratio (COR) was calculated for each individual by multiplying OR of their all overlapping SNP at risk. As to the LAD risk calculated by 10 SNP, the frequency of individuals showing COR > 4.0 was 4.5% in healthy controls, whereas 39% in LAD patients (P = 5 x 10^<-9>, OR = 13.4 ). Similarly, for the LSC risk based on 7 SNP, the frequency of persons with COR > 4.0 in healthy controls was 13%, while 66% in LSC patients (P = 8.5 x 10^<-8>, OR = 12.0 ).
Thus, our results demonstrated that many ms-SNP including those with novel findings are involved in the predisposition to cancer-incidence, suggesting the hereditary cancer-predisposition is determined, at least in part, by the sum effects of many ms-SNP in cancer-related genes. Our results suggested also that each individual's cancer-risk may be predicted by calculating COR in some cases.