Research Projects -
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THE ELUCIDATION OF THE FUNCTION OF THE OSTEOCYTES AS CALCIUM SENSORY CELLS
Grant number：10671937 1998 - 1999
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
MIKI Yoshiki, KAMIOKA Hiroshi, HIURA Kenji, MORIYAMA Keiji
Grant amount：\2100000 （ Direct expense: \2100000 ）
Recently, a calcium-sensing receptor (CaSR) from bovine parathyroid tissue was cloned, and Northern blot analysis revealed expression of CaSR mRNA in several tissues other than the parathyroid gland. In the present study, we fractionated bone cells from 1-to 2-day-old rat calvaria by digestion with collagenase and EDTA and examined the expression of CaSR mRNA in cells of the various fractions by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis and in situ hybridization histochemistry. Fraction I cells had an elongate shape, and cells from fraction II through IV had a stellate and polygonal shape. Cells from fraction VI were small and stellate-shaped, and possessed a large number of long cytoplasmic processes. Fraction m cells expressed alkaline phosphatase (ALPase) activity and osteocalcin (Osc) mRNA, suggesting them to be osteoblasts. On the other hand, only fraction vl cells expressed CaSR mRNA ; and they displayed no ALPase activity or Osc mRNA. Furthermore, fraction VI cells responded to the elevated extracellular calcium with a rapid elevation of their cytosolic calcium. The phenomenon was independent of membrane voltage and insensitive to organic calcium channel modulators, such as BAY K 8644, nifedipine, and nicardipine. These findings strongly suggest that rat mature osteocytes express a CaSR that responds to elevated extracellular calcium.
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BIOLOGICAL CONTROL OF OSTEOCLASTS AND OSTEOBLASTS
Grant number：07557133 1995 - 1996
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (A) Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
SUMITANI Koji, HIURA Kenji
Grant amount：\7500000 （ Direct expense: \7500000 ）
In this study, we examined the biological controls of osteoblasts to osteoclasts in the activation and formation. To examine them, we used a culture system as follows,
(1) unfractionated cells obtained from mouse long bones for osteoclastic formation
(2) stromal cell free hematopoietic blast cells (mouse) for multinucleated cell formation
(3) cloned mouse osteoblastic cells (MC3T3-E1)
The results were obtained as follows,
1) The conditioned medium (CM) of MC3T3-E1 cells precultured for 3days contained only the inhibitory factor of multinucleated cell formation. On the other hand, both inhibitory factor and stimulatory factor were found in the CM of MC3T3-E1 cells precultured for 60days. No such effectors were found in the CM of fibroblasts.
2) The production of inhibitory and stimulatory factors were depressed by indomethacin and cycloheximide, respectively.
3) The media of MC3T3-E1 cells precultured for 3 and 60days contained prostaglandin E2 which inhibited multinucleated cell formation.
4) 1alpha, 25 (OH)_2D_3 was essential for stimulation of MNC formation by both MC3T3-E1 cells derived stimulatory factor and GM-CSF.
These results suggest that the inhibitory factor is prostaglandin E2 and the stimulatory factor is GM-CSF like protein.
5) Although TGF-beta1 has potent inhibitory effect on osteoclastic bone resorption, in the presence of 1alpha, 25 (OH)_2D_3, TGF-beta1 stimulated the formation of osteoclast.
6) TGF-beta1 inhibited multinucleated cell formation induced by 1alpha, 25 (OH)_2D_3, but the conditioned medium of TGF-beta1-treated MC3T3-E1 cells stimulated such formation.
7) Both bafilomycin A_1 (H^+-ATPase inhibitor) and acetazolamide (carbonic anhydorase II inhibitor) inhibited osteoclastic bone resorption stimulated by parathyroid hormone.
On the other hand, bafilomycin A1 did not affect procathepsin L secretion while acetazolamide inhibited the secretion.
These findings suggest that osteoblasts have the effect on osteoclastic formation through calcium regulating factors such as prostaglandin E2, GM-CSF and TGF-beta1. -
THE EFFECTS OF BONE MATRIX PROTEINS ON OSTEOCLAST FORMATION
Grant number：06454584 1994 - 1995
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for General Scientific Research (B) Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
HIURA Kenji, KONDO Kahori, KAMIOKA Hiroshi, SUMITANI Koji
Grant amount：\800000 （ Direct expense: \800000 ）
Osteoclasts are multinucleated cells derived from hematopoietic precursors that have the unique ability to excavate bone matrix. In cultured rat marrow cells with bone particles (100mug/cm^2 ; 20-53mum), osteoclast-like cell number and bone resorbing activity increased by 1.5- and 30-fold, respectively. Recent observations on mice engineered to have targeted knockout of the c-src gene resulted in a phenotype bearing a recessive form of osteopetrosis, a consequence of a decrease in osteoclast function. since osteoclasts were still present in the homozygous src-mutants, it was postulated that the defect could be with the osteoclast itself. Therefore, we have used Chicken osteoclasts as a model system to study of signal transduction. Activation of osteoclasts by bone particles results in elevated tyrosine phosphorylation of three proteins, p200, p130, and p85. By immunoprecipitation and western blotting technique, we demonstrated that p85 was identified with Cortactin. This tyrosine phosphoprotein is a previously characterized cytoskeletal substrate for c-src in transformed cells. The data suggested that Cortactin was one of the members for src dependent signal transduction in activated osteoclast.
Furthermore, we demonstrated that cytosolic calcium elevation that occurred in osteocytes on exposure to elevated extracellular calcium was independent of membrane voltage and was insensitive to modulation by organic calcium channel modulators, namely, BAY K 8644, nicardipine, and nifedipine. However, an intracellular calcium antagonist such as TMB-8 affected the cytosolic calcium level, suggesting that the cytosolic calcium elevation was due to mobilization of this cation from an intracellular store. -
PARTICIPATION OF CATHEPSIN L ON ORTHODONTIC TOOTH
Grant number：06672056 1994 - 1995
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for General Scientific Research (C) Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
SUMITANI Koji, TAGAMI Kahori, HIURA Kenji
Grant amount：\2200000 （ Direct expense: \2200000 ）
Osteoclasts are multinucleated giant cells responsible for the resorption of the calcified extracellular bone matrix. The degradation of the bone matrix protein including type I collagen is a key process for osteoclastic bone resorption. It has been suggested that lysosomal cysteine proteinase in osteoclasts is essential to degrade bone collagen, but the proteinase(s) for this collagenolysis have not been identified.
In this study, the participation of cathepsin L on osteoclastic bone resorption was investigated and the results obtained were as follows.
1) In cultured rat bone marrow cells, parathyroid hormone (PTH)-stimulated bone resorption was markedly suppressed by all of specific and non-specific inhibitors of cathepsin L tested but not by a specific inhibitor (CA-074) of cathepsin B.
2) In rats with bone resorption stimulated by a low calcium diet, serum calcium level was decreased by an intraperitoneal injection of cathepsin Linhibitors but not by CA-074.
3) Activities of cathepsin L and B were shown to be more than 80% of total proteinase activity in the culture medium of rat bone marrow cells.
4) In bone marrow cells cultured on bone slices, PTH increased both bone resorption and cathepsin L activity in the medium and these increases were suppressed by calcitonin.
5) The cultured bone marrow cells secreted cathepsin L as 39kD molecule and the secretion was suppressed by calcitonin.
6) The 39kD cathepsin L purified from rat long bones was converted to 25kD cathepsin L under acidic condition.
7) Rat long bone-derived 25kD cathepsin L as well as purified cathepsin L of rat liver degraded type I collagen at pH 4.05.0.
These results suggested that cathepsin L secreted from osteoclast plays a crucial role in the degradation of bone matrix proteins including type I collagen during bone resorption. -
骨細胞のカルシウムの取り込みについて
Grant number：06772009 1994
日本学術振興会 科学研究費助成事業 奨励研究(A) 奨励研究(A)
上岡 寛
Grant amount：\900000 （ Direct expense: \900000 ）
矯正的歯牙移動に伴う骨リモデリングは、破骨細胞による骨吸収および骨芽細胞による骨形成によってなされている。しかし、成熟した骨組織中には、これら細胞の約10倍もの骨細胞が占めている。しかし、骨細胞は回りを硬組織にとり囲まれているため単離ができず、その機能については、いまだ明らかにされていない。
最近、我々は、ニワトリ胚頭頂骨より非常に高純度で(95%)で、多量(1匹当たり10,000個)の骨細胞を単離することができた(Isolation Method of Osteoidosteocytes .J Bone Miner Res:S202.1993)。この骨細胞を用いて、骨リモデリングにおける骨細胞の役割を探っていくことは、意義のあることと思われる。
【結果】 骨リモデリング時に骨吸収側では、細胞外カルシウム濃度が生理的濃度の約20倍の40mMにも上昇することが報告されているが、この高濃度のカルシウムに骨細胞が応答し、骨細胞が骨代謝を調節するメカニズムついて検討を行うために以下の実験を行った。
1)本学にあるACAS570 WORK STATIONをもちいて、まず単離した骨細胞の細胞内カルシウムの変化を指標として、細胞外カルシウムに対する骨細胞の応答を観察した。その結果、骨細胞は細胞外液のカルシウムに濃度依存的に応答することがわかった。
2)骨細胞内のカルシウムの上昇がどのような機序によってなされているかを検討するために、膜電位依存性カルシウムチャンネルアゴニストおよびアンタゴニストを用いて細胞内カルシウムの変動を追った。アゴニストであるBAY K8644は細胞内カルシウムを上昇することはなかった。また、アンタゴニストであるnicardipine,nifedipineは細胞外カルシウムによって惹起される細胞内カルシウムの上昇を抑制することができなかった。
3)また、二価の陽イオンであるニッケルおよびカドミウムは、カルシウムによって惹起される骨細胞の反応と競合し、外液カルシウム非存在下でも単独に細胞内カルシウムを上昇することがわかった。
これらのことから骨細胞は細胞外液にカルシウムチャンネル以外の経路を介して応答していることが示唆された。 -
矯正力を作用した骨細胞が骨芽細胞の増殖および機能に及ぼす影響について
Grant number：05454556 1993
日本学術振興会 科学研究費助成事業 一般研究(B) 一般研究(B)
河田 照茂, 石川 啓詞, 上岡 寛, 住谷 光治
Grant amount：\6900000 （ Direct expense: \6900000 ）
矯正力の作用機序を解明する上で、骨細胞に対する矯正力の影響を検討することは有用であると思われる。そこで、培養した骨細胞を用いて以下の実験を行った。
実験方法
閉鎖培養皿(ローズチャンバー)上に骨細胞を培養し静水圧を負荷し、矯正力を加えた骨細胞のモデル型を想定した。静水圧の調整はローズチャンバーに連結した点滴の高さを調整することにより行った。0, 25,100g/cm^2の各圧で24時間0.1%BSA含有α-MEMで培養された培養上清を回収し骨芽細胞培養系(MC3T3-E1細胞)に添加した。
結果及び考察
1.矯正力を負荷した骨細胞の培養上清が骨芽細胞の増殖に与える影響
Meyer J.E.& Grundman H.の方法により、MC3T3-E1細胞中のDNA量を測定したところ、矯正力を負荷した骨細胞の培養上清は、骨芽細胞数の多少の増加を促すものの有意差は認められなかった。
2.矯正力を負荷した骨細胞の培養上清が骨芽細胞のALP活性に与える影響
ALP活性は、100g/cm^2の培養上清において未処理対照に比べ増加傾向がみられた
以上の結果より矯正力を受けた骨細胞からは骨芽細胞の分化を促すような液性因子が産生されている可能性が示唆された。 -
矯正力が骨の細胞の接着機構に与える影響について
Grant number：05671712 1993
日本学術振興会 科学研究費助成事業 一般研究(C) 一般研究(C)
住谷 光治, 石川 啓詞, 上岡 寛, 河田 照茂
Grant amount：\2000000 （ Direct expense: \2000000 ）
破骨細胞は骨基質に存在するArg-Gly-Aspの3つの連続するアミノ酸を認識して骨基質へ接着するインテグリンが存在することが知られている。我々の興味の対象はメカニカルストレスを負荷された骨の細胞が破骨細胞の基質への接着に与える影響である。本研究は、これによって歯科矯正学的な歯の移動のメカニズムの一端を知ろうというものである。
1. マウス骨芽細胞株MC3T3E-1細胞とニワトリ卵より採取した骨細胞を各々培養し、静水圧(10-20g/cm^2)および培養面が軟膜でできた培養皿を変形させて物理的圧刺激(メカニカルストレス)を加えた。
(1)24時間静水圧を負荷した場合には、MC3T3E-1細胞および骨細胞ともにおおきな形態変化は見られなかった。48時間負荷によってMC3T3E-1細胞はコントロール群と比較して星形から多少、紡錘形に変化した。
(2)圧刺激を加えたMC3T3E-1細胞培養上清中に明らかにプロスタグランディンE_2が産生されていた。プロスタグランディンE_2を外因性に骨細胞に作用させると形態が比較的速やかに変化した。
(3)(2)の培養上清を2次元電気泳動で展開すると明らかに静水圧、物理的圧刺激負荷群でコントロール群と比較して新しい蛋白性産生物が見られた。
2. 24時間静水圧を負荷したMC3T3E-1細胞の培養上清を濃縮し、プラスチックディッシュ上のラット由来単離破骨細胞に与えても形態や剥離に対する影響は見られなかった。
以上より、矯正力によって骨芽細胞や骨芽細胞影響を受けプロスタグランディンE_2以外の蛋白性物質を産生促進させるが、それが破骨細胞のインテグリンに直接は影響してはいないことが分かった。