Research Projects -
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小胞輸送障害の定量的・網羅的解析法の確立によるアルツハイマー病治療薬の探索
Grant number：20K07014 2020.04 - 2023.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
高杉 展正
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
アルツハイマー病（AD）は進行性の認知機能の低下を主訴とする神経変性疾患である．近年，患者脳に蓄積するアミロイドβ（Aβ）を標的とした抗体療法が米国で承認されるなど，AD患者脳でAβが蓄積し毒性を持つことがAD発症原因であるとする「アミロイド仮説」が強く支持され創薬研究が進められている．
一方，Aβ蓄積とは独立した発症機序の存在も示唆されており，病態はより複雑であると考えられ，単一の標的に特化した既知の治療薬の薬効発現は確認しづらく，抗Aβ抗体療法も根本的治療法としてはまだ確立されていないのが現状である．そこでAD病態を正確に把握するため，アミロイド仮説を補完する発症メカニズムの解明と薬物標的の同定が必要とされている．
これまでにADの最初期の病態である輸送小胞（エンドソーム）の機能異常とその肥大化に注目し，小胞輸送障害がAD発症の端緒であるとする「交通渋滞仮説」が提唱されていたが，そのメカニズムは不明であった．そこで当研究グループはAD関連遺伝子APPの病的代謝物でありAβの前駆体でもあるβCTFに注目した．βCTFは小胞輸送障害を誘導することが知られており，我々はその輸送小胞内での結合パートナーとしてTMEM30Aを同定していた．
TMEM30Aは脂質二重膜内での脂質輸送に関与し，小胞輸送を制御するリピッドフリッパーゼの構成成分である．本年度は動物・細胞をもちいたAD病態モデルにおいてβCTFの蓄積がリピッドフリッパーゼの形成・活性を低下させることを明らかにした．さらにTMEM30Aに由来するβCTF結合性のペプチドT-RAPを同定し，本ペプチドが小胞輸送障害を改善できることを示し，科学誌に発表した．
本研究成果からAD発症機構の解明，及び新たな治療標的の同定につながることが期待される． -
GPCR-Amyloid precursor protein supercomplex regulate neural function
Grant number：20K07765 2020.04 - 2023.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
上窪 裕二, 高杉 展正
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
膜タンパク質を標的とした構造と機能解析技術の進歩に伴い、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)をはじめとする細胞膜タンパク質間の複合体形成と機能的な相互作用が明らかとなりつつある。膜タンパク質が形成する巨大な複合体は、膜タンパク質の本質であり、その実態を理解することは生命科学の発展に大きく寄与すると考えられる。本研究では多種類の膜タンパク質からなる巨大な複合体(超複合体)の形成とその機能を明らかにするため、アルツハイマー病(AD)の原因の1つであるアミロイドベータ(Aβ)の前駆タンパク質 (Amyloid precursor protein; APP)と神経伝達に関わるGPCR複合体が形成する複合体に注目する。
先行研究によってAPPの細胞外ドメインの一部が異種GPCR複合体を形成するB型ガンマアミノ酪酸(GABA)受容体(GABAB受容体)と相互作用することが報告された。代表者らはGABAB受容体をはじめとする神経伝達に関わるGPCRを発現する細胞株を作製し、APPおよび部分ペプチドとGPCRの相互作用について検討を行った。検討の結果、GABAB受容体をテトラサイクリン誘導性に発現する細胞株ではAPPとの相互作用は確認できなかった。そこで研究代表者らは、これらの相互作用を安定して評価するためにGABAB受容体を恒常的に発現する細胞株を作製した。さらに、ウイルスベクターによる遺伝子発現方法を改良し、細胞内カルシウムとcAMPをライブセル・イメージングにて評価できる測定系を確立した。申請者らはAPPと他のGPCRの複合体形成についてさらに解析を進め、蛍光ライブセル・イメージングによる評価を行った。 -
APP-BACE1結合仲介分子によるアミロイドβ産生制御機構の解明
Grant number：19K06929 2019.04 - 2022.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
樫山 拓, 高杉 展正
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
アルツハイマー病の病理に中心的役割を果たすアミロイドβ（Aβ）は前駆体タンパク質（APP）がBACE1・γセクレターゼによる2段階切断を受けて産生される。Aβ凝集体からなる老人斑の近傍では、神経突起における小胞輸送障害により変性神経突起が形成される。輸送障害部位ではAPP・BACE1の蓄積が起こり、悪循環的にAβ産生亢進、凝集体の形成促進、変性神経突起形成・神経機能障害が進行すると考えられている。 我々がAPP結合タンパク質として見出したタンパク質Xが老人班周囲に集積することを報告しているが、さらにタンパク質XがBACE1とも結合することを発見した。以上のことから、このタンパク質XがAPPとBACE1の集積を促し、Aβ産生を亢進しているというのではないかという仮説を立てた。タンパク質Xの機能を修飾することでAβ産生を抑制できれば新たなアルツハイマー病治療薬の標的となることが期待される。 アルツハイマー病モデルマウス脳スライス固定標本の免疫染色によりアミロイドプラーク周辺におけるBACE1およびタンパク質Xの集積を確認した。BACE1とタンパク質Xの同時染色に必要な抗体が無いため、抗BACE1-VHH抗体を利用し共局在を検討したが、感度が不十分なため改善が必要である。
タンパク質XとBACE1の結合部位を明らかにするため、それぞれについて部分欠損変異体を作製し、株化細胞を用いて免疫沈降、および蛍光顕微鏡による共局在を指標に結合を評価した。少なくとも互いの膜貫通ドメイン同士の結合が確認され、加えて細胞外ドメインの複数の結合部位が存在することが示唆された。タンパク質XはBACE1以外に他のタンパク質と複合体を形成することが示されていることから、3者が存在するときの結合様式や振る舞いをさらに検討する必要がある。 -
Lipid flippase is the novel therapeutic target for the Alzheimer disease, which correlate with endocytic traffic impairment.
Grant number：17K08272 2017.04 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
TAKASUGI NOBUMASA
Grant amount：\4810000 （ Direct expense: \3700000 、 Indirect expense：\1110000 ）
Although Amyloid beta (Aβ) peptide, which accumulates in Alzheimer disease (AD) brain, is focused attention as a therapeutic target, most clinical trials are failed. Interestingly, endocytic dysfunction is the early pathogenic event by the accumulation of Aβ precursor protein (APP) metabolites, β-carboxyl-terminal fragment (βCTF). We identified TMEM30A, a subcomponent of lipid flippase, as a candidate partner for βCTF. Moreover, stably overexpression of β-site APP cleaving enzyme 1 (BACE1) accumulated βCTF to increase the complex with TMEM30A. Intriguingly, upregulated BACE1 activity reduced both the lipid flippase formation and activity, which was accompanied by the abnormally enlarged endosomes. We confirmed the complex formation of TMEM30A and βCTF, and lipid flippase dysfunction in AD model mice before Aβ deposition. Our results shed light on the unidentified correlation between βCTF and lipid flippase activity and suggest a novel therapeutic strategy for AD.
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Simultaneous control of the production and degradation of Amyloid be-ta by Sphingosine kinase/sphingosine-1-phosphate signaling
Grant number：26430059 2014.04 - 2017.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
TAKASUGI NOBUMASA, TOMITA Taisuke
Grant amount：\5200000 （ Direct expense: \4000000 、 Indirect expense：\1200000 ）
Alzheimer disease (AD)is a progressive neurodegenerative disease. The over-production and aggregation of Amyloid beta (Aβ) peptides in brains are considered to be the major pathogenic event for AD. We identified Sphingosine kinase 2 (SphK2) activity is upregulated in AD, and caused to increase the level of Aβ. These results strongly suggest SphK2 and its product sphingosine-1-phosphate are the therapeutic target for AD.
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Microdomain-dependent acceleration mechanisms for amyloidogenic processing of amyloid precursor protein induced by endocytic membrane traffic impairment
Grant number：23300128 2011.04 - 2015.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
SAKURAI Takashi, NUKINA Nobuyuki, MURAYAMA Takashi, KASHIYAMA Taku, ARAYA Runa, KAMIKUBO Yuji, TAKASUGI Nobumasa
Grant amount：\19760000 （ Direct expense: \15200000 、 Indirect expense：\4560000 ）
Aggregation and deposition of amyloid β peptide (Aβ) in the brain is considered central to the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). Aβ is produced through a sequential cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by β- and γ-secretases. Increasing evidence indicates that membrane microdomains play an important role as a platform for the vesicular transport of APP in the secretory and endocytic pathways and in the amyloidogenic processing of APP. Recently, accumulation of β-secretase-cleaved C-terminal fragment of APP (βCTF), which is the direct precursor of Aβ, was found to cause endosome dysfunction during the early phase of AD that could drive Aβ overproduction. To gain insight into the underlying molecular mechanisms, we examined the functions of endosomal proteins in the APP-containing microdomains. We identified a candidate protein that causes impairment of endocytic membrane traffic through its interactions with βCTF.
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SPHK/S1Pシグナリングによるβセクレターゼ制御機構の解析
Grant number：21790061 2009 - 2010
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B) 若手研究(B)
高杉 展正
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
高齢化社会を迎え、アルツハイマー病(AD)は大きな社会問題となっている。その発症機序には、β及びγセクレターゼによる2段階の切断によりAmyloid precursor protein (APP)から生じるAβ分子の患者脳内での蓄積が深く関与している。申請者らは脂質セカンドメッセンジャーとして機能することが知られるSphingosine-1-phoaphate (S1P)の産生酵素であるSphingosine kinase (SPHK)がβセクレターゼを介してAβ産生機構影響を与えることを見出していた。本年度は細胞内S1Pの量が実際にβセクレターゼ活性に影響して、AD発症に寄与する可能性があるか検討することを主眼として以下の研究を進めた。
1.S1P代謝酵素によるβセクレターゼ活性制御機構に対する影響の解析
2.SPHKの過剰発現がAβ産生機構に与える影響の解析
結果として分子機構の異なるS1P代謝酵素であるSGPL1、SGPP1の発現によりヒト由来のAβおよびβセクレターゼ産物であるβCTFの産生が有意に抑制されることを見出した。またSPHKの一つであるSPHK2の発現は酵素活性依存的にAβ、βCTF産生を増加させることが明らかになった
これらの結果から、これまでに明らかでなかったSPHK/S1Pシグナル、特に細胞内S1Pの量が神経細胞におけるβセクレターゼの活性を制御していることが示唆された。S1P量は免疫応答、神経細胞へのストレスなどにより影響をうける可能性があることから、AD発症機構に関与していることも考えられる。
本研究成果から、今後SPHKおよびS1P代謝酵素をターゲットとしたAD根本治療薬の創薬につながることが期待される。 -
Substrate specific modulation of the ....secretase activity by vesicular trafficking
Grant number：19790049 2007 - 2008
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Young Scientists (B) Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
TAKASUGI Nobumasa
Grant amount：\3690000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\390000 ）
アルツハイマー病(AD)患者脳に蓄積するアミロイドβ(Aβ)蛋白質を産生する責任酵素であるγセクレターゼは、AD の根本的治療法のターゲットとして注目されている。しかしその単純な阻害はNotch などのシグナルの阻害による副作用を誘発する。我々はショウジョウバエ細胞を用い、Notch、Aβ産生を特異的に制御する遺伝子をRNAi 法によるスクリーニングをおこない、候補遺伝子について個々に解析を進めた。本研究成果は副作用のないAD 治療薬の開発・および生体内シグナルの重要な因子であるNotch の制御機構の解析に道筋をつける研究であると考えている。
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Drosophilaを用いたパーキンソン病、アルツハイマー病の病態に関する研究
Grant number：02J61410 2002 - 2003
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特別研究員奨励費 特別研究員奨励費
高杉 展正
Grant amount：\1000000 （ Direct expense: \1000000 ）
家族性アルツハイマー病(FAD)病因遺伝子presenilin(PS)の変異によりADが発症する機序として、アミロイドとして蓄積性の高いAβ42ペプチドの産生亢進が報告され、ADの根本的治療法の創薬ターゲットとして注目されている。PSの正常機能については不明な点が多いが、PSはβアミロイド前駆体蛋白(βAPP)や細胞分化に重要な役割を果たすNotch受容体の膜内配列切断を行う新規アスパルチルプロテアーゼγ-secretaseの活性サブユニットである可能性が示唆されている。
これまでに我々は、断片化したPSは安定化され、高分子量複合体を形成すること、この複合体が活性型γ-secretaseの本態であることを明らかにしてきた。私はγ-secretaseの分子的実態を明らかにすることを目的として、分子遺伝学的解析法の確立されているショウジョウバエを実験系として用い、ショウジョウバエプレセニリン(Psn)の解析を行った。ショウジョウバエ由来シュナイダー(S2)細胞において内因性Psnは断片化、安定化を受け高分子量複合体を形成しており、S2細胞にβAPPのC末端断片(C100)を発現させるとAβが産生され、Psnがγ-secretaseとしての活性を持つことを明らかにした。一方マウス由来N2a細胞にPsnを発現させた場合にも、哺乳類PSと同様に安定化、高分子量複合体を形成し、γ-secretase活性を示した。これらの結果はPSの安定化、高分子量複合体形成機構が遺伝的に保存されており、S2細胞及びショウジョウバエPsnを用いた系がγ-secretase活性を評価するモデルとして有用であることを示している。現在このS2細胞を利用した実験系により、γ-セクレターゼの新たな構成因子候補として同定されたNicastrin、Aph-1、Pen-2について解析している。