共同研究・競争的資金等の研究 - HARA EMILIO SATOSHI
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細胞膜を基盤材料とした生体組織の修復技術の開発研究
研究課題/領域番号：JPMJFR210X 2022年04月 - 2025年03月
JST - 科学技術振興機構 創発的研究支援事業
ハラ エミリオ・サトシ
担当区分：研究代表者
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Towards the understanding and designing of a bioinspired hematopoietic stem cell niche microenvironment
研究課題/領域番号：20KK0368 2021年 - 2024年
日本学術振興会 科学研究費助成事業 国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(A)) 国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(A))
ハラ エミリオ・サトシ
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Physiologically-Integrated Wearable Devices with Mind-Body Practice for Stress Management
研究課題/領域番号：20335922 2020年11月 - 2021年03月
国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）/ The New York Academy of Sciences Interstellar Initiative（医療分野国際科学技術共同研究開発推進事業）
ハラ エミリオ・サトシ
担当区分：研究代表者
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細胞膜ナノフラグメントを核とした初期骨髄形成過程の理解とその再現および制御
研究課題/領域番号：20H04534 2020年04月 - 2024年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
ハラ エミリオ・サトシ, 松本 卓也, 大野 充昭, 長岡 紀幸, 岡田 正弘, 藤枝 俊宣
担当区分：研究代表者
配分額：17810000円 （ 直接経費：13700000円 、 間接経費：4110000円 ）
骨髄形成のメカニズムを解明することは、in vitroにて生体を模倣した骨髄組織を構築することが可能となり、骨-造血疾患のドラッグスクリーニングや再生治療の技術開発への新たな展開に繋がることが期待されるが、未だ達成されていない。我々はこれまでに、「細胞膜ナノフラグメント」が海綿骨形成に重要な役割を果たすことを発表した。また、海綿骨形成後に、間葉系幹細胞などの細胞が海綿骨の表面に定着し、骨髄を形成することが明らかとなった。つまり、「細胞膜ナノフラグメント」は海綿骨・骨髄初期形成に関与していることが示唆された。さらに、培養細胞から細胞膜ナノフラグメントを単離する手法を確立し、この細胞膜ナノフラグメントを用いることで、in vitroにて海綿骨形成を迅速に誘導することに成功した。
本研究では、海綿骨-骨髄形成過程について、生物学・材料科学的に解析する。また、リバースエンジニアリング的に骨髄初期形成過程をin vitroで模倣・構築し、その制御を試みる。そして、骨髄初期の構造と機能を精密に再現することで、細胞膜ナノフラグメントを基盤とした骨髄の初期形成メカニズムを再検討し、より深い理解を目指す。
本年度は以下の実験を実施した。
１）新生児マウス大腿骨骨端部における海綿骨の初期形成時期（生後6日目）から骨髄初期形成時期（生後12日目）の組織変化を組織学的・材料学的に解析した。また、骨髄初期の三次元的情報を得る為、新生児マウス大腿骨骨端部の骨髄初期形成時期を集束イオンビーム・走査型電子顕微鏡（FIB-SEM）を用いの三次元観察を行うための準備を行った。
２）骨髄初期形成に関与する細胞集団の遺伝子発現パターンを次世代シーケンサーを用いて解析を行った。これらの解析により、海綿骨の形態変化、ならびに海綿骨に定着し、骨髄を形成する細胞集団の遺伝子発現パターンなどの特徴を明らかにすることが期待できる。 -
研究課題/領域番号：18K17119 2018年04月 - 2020年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究 若手研究
ハラ エミリオ・サトシ
配分額：4160000円 （ 直接経費：3200000円 、 間接経費：960000円 ）
我々はこれまで、生体内（マウス大腿骨骨端部）における初期骨形成過程を材料学的に検討し、軟骨細胞膜断片（ナノフラグメント）から骨形成が開始することを見出した。また、培養細胞から単離したナノフラグメントを用いることで、わずか2日で石灰化を誘導することに成功した。本研究では、ナノフラグメントを用いた早期骨再生誘導材料の開発を目的に、ナノフラグメント作製方法の確立、ならびにナノフラグメントを用いた骨再生におけるナノフラグメント使用方法の最適化を検討した。本研究成果は、ナノフラグメント単離・精製法の確立、また事前処理したナノフラグメントを用いて早期骨再生を誘導したことである。
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二次骨化中心初期石灰化の生命科学、材料学、双方向からの解析と理解
研究課題/領域番号：16H06990 2016年08月 - 2018年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 研究活動スタート支援 研究活動スタート支援
ハラ エミリオ・サトシ
配分額：2860000円 （ 直接経費：2200000円 、 間接経費：660000円 ）
本研究では，マウス大腿骨二次石灰化現象について，軟骨内骨化の初期石灰化部位とタイミングを同定し，その部位における石灰化について，生命科学的・工学的に検討を行い，それぞれを時間空間的に比較することで，軟骨内骨化の多面的な理解を目的とした．実験の結果から，初期石灰化は生後6日目から開始することがわかった．開始点を電子顕微鏡で観察・解析した結果，細胞膜の断片（リン脂質）が石灰化の核になることがわかった．この結果から，リン脂質を基盤とした新しい無機有機ハイブリッド材料の開発に繋がる可能性があると考えられる．
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細胞膜模倣バイオマテリアルの創製と迅速骨再生への応用
研究課題/領域番号：22H03274 2022年04月 - 2026年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
松本 卓也
配分額：17420000円 （ 直接経費：13400000円 、 間接経費：4020000円 ）
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オルガノイドへの血管網導入による骨髄様組織のin vitro創製
研究課題/領域番号：22H03952 2022年04月 - 2025年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
佐々木 淳一
配分額：17290000円 （ 直接経費：13300000円 、 間接経費：3990000円 ）
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ソフト／ハードマテリアル接着界面の解析と制御
研究課題/領域番号：21H03123 2021年04月 - 2024年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
岡田 正弘, 柴田 陽, 松本 卓也, ハラ エミリオ・サトシ
担当区分：研究分担者
配分額：17290000円 （ 直接経費：13300000円 、 間接経費：3990000円 ）
我々は、医療材料として用いられる無機材料（チタンやアパタイト）に適切な表面構造を構築することで、ハイドロゲル（生体軟組織や合成ゲル）がその無機材料と瞬時に強く接着することを見出した。本研究課題では、これら無機系固体接着材とハイドロゲルの接着現象を界面科学的観点から解析する。具体的には、まず、条件を変化させて作製した固体接着材表面の化学的・物理的性質を評価する。また、各種官能基を導入した粘弾性特性の異なるハイドロゲルを作製し、固体接着材とハイドロゲルの接着強さを評価する。この際、生体内における接着安定性についても評価を行う。さらに、各種分析法を用いて固体接着材とハイドロゲル間の界面における相互作用についての情報を収集する。以上の情報を総合し、ソフト（ハイドロゲル）とハード（無機系固体接着材）間の接着現象を理解することを目的とする。
上記の目的を達成するために本年度の検討では、まず、条件を変化させて無機系固体接着材を作製してその表面性状を評価した。無機系固体接着材としてのアパタイトは湿式法によって合成し、疎水性モールドにキャスト後に焼成することでナノ多孔質体として作製した。この際の焼成条件によってアパタイトの表面性状を変化させた。チタンは薄膜状のものを準備し、酸処理によって表面処理した。これら無機材料の表面性状は、化学的観点（組成、結晶性）および物理的観点（表面粗さ、弾性率）から評価を行った。具体的には、表面形態を電子顕微鏡観察および表面粗さから評価した。また、X線回折法を用いて結晶構造を評価した。次に、組成の異なるハイドロゲルを作製し、表面性状の異なる無機材料とハイドロゲルを組み合わせて接着試験を行い、ハイドロゲルと無機系固体接着材間の接着性を定量的に評価した。以上の検討結果を取りまとめて学会発表ならびに論文発表を行った。 -
Designing of novel bone-inducing molecules by an experimental-computational approach
研究課題/領域番号：21K09963 2021年04月 - 2024年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
国吉 ニルソン, ハラ エミリオ・サトシ
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リン脂質石灰化のバイオマテリアルズインフォマティクス解析
2020年06月 - 2021年03月
令和元年度（2020）早稲田大学 各務記念材料技術研究所 共同研究
ハラ エミリオ・サトシ, 国吉 ニルソン
担当区分：研究代表者
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骨メカノトランスダクションおよび組織工学用の生体機能性電気活性ポリマーの開発
2020年04月 - 2022年03月
二国間交流事業 共同研究
担当区分：研究分担者
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間葉系幹細胞制御技術を指向した生体模倣骨組織バイオデバイスの創製
2020年04月 - 2021年03月
公益財団法人 池谷科学技術振興財団
ハラ エミリオ・サトシ
担当区分：研究代表者
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新規骨形成誘導材料の開発を指向したリン脂質石灰化のin vitro実験およびシミュレーションによる反応機構解析
2020年04月 - 2021年03月
三菱マテリアル株式会社―早稲田大学理工学術院包括協定
国吉 ニルソン, ハラ エミリオ・サトシ
担当区分：研究分担者
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リン脂質石灰化のバイオマテリアルズインフォマティクス解析
2019年06月 - 2020年03月
令和元年度（2019）早稲田大学 各務記念材料技術研究所 共同研究
ハラ エミリオ・サトシ、国吉ニルソン
担当区分：研究代表者
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基底膜構成分子の誘導制御による低侵襲角化歯肉獲得療法の確立
研究課題/領域番号：19H03841 2019年04月 - 2023年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
前川 賢治, 窪木 拓男, 冨田 秀太, ハラ エミリオ・サトシ, 大橋 俊孝, 大野 充昭
担当区分：研究分担者
配分額：17030000円 （ 直接経費：13100000円 、 間接経費：3930000円 ）
基底膜直下に存在する角化歯肉由来間葉細胞と非角化歯肉由来間葉細胞の遺伝子発現の相違を明らかにすることで，上皮細胞の角化に関わっている間葉細胞からのシグナル分子を抽出することが可能であると考える。そこで，令和元年度は，レーザーマイクロダイセクション法とRNA-Seq を組み合わせた候補因子の抽出を目的に，以下の実験を実施してきた。
間葉組織は，筋肉や脂肪など様々な組織を含むことから，マクロレベルで口蓋粘膜から間葉組織を採取すると，様々な組織を含んでしまう。基底膜直下の間葉組織の遺伝子発現解析を正確にするには，特異的に組織を採取することが可能なレーザーマイクロダイセクション法を用いる必要がある。そこで，マウスの口蓋粘膜（角化粘膜）と頬粘膜（非角化粘膜）の凍結組織切片を作製し，サンプルの厚み，固定方法，染色方法，レーザーの強度の調整等，様々な条件検討を行い，本組織において最適な条件を見出した。そして，これらのサンプルからRNAを抽出し，RNA-seqが可能な質の高いRNAが回収できていることを，TapStation (アジレント)にて確認した。
また、in vitroにおいて，角化粘膜の間葉組織に高発現している遺伝子をRNA-seq解析から抽出後，さらなる候補因子の絞り込みをin vitroにて行う予定である。そこで，令和元年度は，ヒト口腔扁平上皮癌由来の口腔粘膜上皮細胞であるTR146と，ヒト口腔粘膜細胞由来線維芽細胞を用いた三次元共培養実験モデルを構築すべく，コラーゲンゲルの種類，濃度や細胞の濃度などの条件検討を行い，正常な口腔粘膜組織に類似したin vitro モデル構築に適正な条件の絞り込みを終えた。 -
骨髄微小環境における骨形成・吸収メカニズムの分子基盤の解明と治療戦略
研究課題/領域番号：19H03842 2019年04月 - 2022年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
大野 充昭, 窪木 拓男, 宝田 剛志, ハラ エミリオ・サトシ, 渡辺 亮, 秋山 謙太郎, 淺田 騰, 枝松 緑
担当区分：研究分担者
配分額：17550000円 （ 直接経費：13500000円 、 間接経費：4050000円 ）
BMP-2は，有効な骨再生療法を提供するとして大変期待されている.一方，我々は，骨髄腔内にBMP-2を投与すると逆に，骨形成が抑制され，骨髄腔が拡大するという大変興味深い知見を得た．本申請研究では，骨髄細胞のシングルセル解析にて，BMP-2投与による骨形成抑制・骨髄腔拡大に関わっている細胞を抽出し，これら候補細胞が，BMP-2投与下で骨髄ニッチや骨髄腔の維持にどの様にして関わっているのかを解析する. そして，上記の解析より，骨髄ニッチや骨髄腔の維持に関わりが深い細胞や分子を抽出し，その欠損マウスを用いてBMP-2にて骨形成が誘導可能か検証し，骨髄腔の維持に関わる細胞やその分子を同定する予定である．
令和元年度は，間葉系幹細胞が可視化されたCXCL12-GFPマウス，骨芽細胞が可視化されたCol1a1-GFPマウス，破骨細胞が可視化されたTrap-Tomatoマウスを用いて，BMP-2の骨髄内投与によりこれらの細胞がどのような挙動を取るか，詳細に検討した．また，BMP-2を骨髄内に投与による骨髄細胞分画の変化をフローサイトメーターにて詳細に検討し，single cell RNA-seq解析の条件検討を行った．
また，in vitroにてBMP-2が骨芽細胞分化に与える影響をどの骨髄細胞が抑制的に制御しているかを明らかにするため，B細胞，T細胞，ミエロイド系細胞をマグネットビーズが付与された抗体を用いて分離し，骨芽細胞分化に与える影響を検討し，どの骨髄細胞が間葉系細胞の骨形成能を抑制しているか絞り込みを行った. -
材料化学実験および反応計算によるリン酸カルシウム材料の形成機構の解析
2019年04月 - 2020年03月
三菱マテリアル株式会社―早稲田大学理工学術院包括協定
国吉 ニルソン, ハラ エミリオ・サトシ
担当区分：研究分担者
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変形性関節症の発症予防を目指したWISP遺伝子の機能解析
研究課題/領域番号：18K09682 2018年04月 - 2021年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
前田 あずさ, 窪木 拓男, 大野 充昭, ハラ エミリオ・サトシ, 吉岡 裕也
担当区分：研究分担者
配分額：4420000円 （ 直接経費：3400000円 、 間接経費：1020000円 ）
本研究では，国民が要支援となる最大の原因となっている変形性関節症 (OA) の原因遺伝子のひとつであると考えられているWISP1に着目し，OAの発症メカニズムを解明することで治療法ならびに予防法を確立することを目的としているが，前年度までに3種類のOAモデルマウス，すなわち ①加齢モデル，②機械的負荷モデル，③炎症誘発モデル の作製に成功した．
野生型とWISP1遺伝子欠損マウスを用いて機械的負荷モデルと炎症誘発モデルマウスを作製後，回収した膝関節から作製した組織切片をサフラニンO染色した後に，OA重症度の半定量的評価 (OARSIスコア) を行ったところ，野生型と比較してWISP1遺伝子欠損マウスではOARSIスコアが低い値を示しており，WISP1遺伝子が欠損することでOA誘発に伴う関節軟骨の破壊が抑制されていることが確認された．そこで，WISP1遺伝子欠損マウスでのOA重症化抑制に関わる因子を調べるため，膝関節腔内にコラゲナーゼを注射することでOAを誘発する炎症誘発モデルを3か月齢の野生型ならびにWISP1遺伝子欠損マウスを用いて作製し，7日後に回収した滑膜組織からRNAを抽出，リアルタイムRT-PCRを行い，軟骨基質破壊に関連する遺伝子の発現レベルを調べた．その結果，細胞外マトリックスの分解に関わるmmp3, mmp9, adamts4, adamts5の遺伝子発現量がWISP1遺伝子欠損マウスで低下していた．
以上より，WISP1がMMPやADAMTSといった細胞外マトリックス分解酵素の分泌を促進することで，OAを悪化させている可能性が示唆された． -
iPS干渉法を応用した歯胚発生メカニズムの理解と歯の再生技術への応用
研究課題/領域番号：18H02991 2018年04月 - 2021年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
窪木 拓男, 大野 充昭, 辻 孝, 渡辺 亮, 宝田 剛志, ハラ エミリオ・サトシ
担当区分：研究分担者
配分額：17550000円 （ 直接経費：13500000円 、 間接経費：4050000円 ）
本申請研究は，歯科医学において未達成の重要な研究課題である「エナメル芽細胞・象牙芽細胞のマスター遺伝子」を同定し，それを利用して生理機能を有した 臓器としての歯の再生法を開発することを目的としている.具体的には，1器官原基法を応用した発生学的アプローチ，2レーザーマイクロダイセクションを応 用した組織学的アプローチ，3既知の重要な転写因子を利用した絞り込み等の技術を総動員してエナメル芽細胞・象牙芽細胞分化時におけるマスター遺伝子の絞 り込みを行い，iPS細胞樹立技術を逆手に取ったマスター遺伝子同定法(iPS干渉法)やゲノム編集技術を駆使してエナメル芽細胞・象牙芽細胞のマスター遺伝子を同定する.
2018年度に，発生過程の歯胚から定期的に組織を回収し，RNA-Seq解析データ，ヒト歯乳頭由来間葉系幹細胞 (以下, hSCAP)，ヒト骨髄由来間葉系幹細胞，ヒト成人皮膚由来線維芽細胞 (以下, hADF)のRNA-Seq解析データを照らし合わせ，幹細胞の象牙芽細胞への分化や象牙芽細胞自身の分化に関わっている可能性がある転写因子を抽出した.
2019年度は，hSCAPに山中4因子と上記で抽出された転写因子を一つずつ入れ，どの転写因子が山中4因子の導入によるiPS細胞への誘導を阻害するのか検討した．その結果，13転写因子がiPS細胞への誘導を阻害することが明らかとなった．現在この13転写因子をhADFに遺伝子導入し，hADFがhSCAPにdirect reprogramingされていないか様々な方法で検討を行っている． -
三次元骨組織迅速作製技術の構築を指向したリン脂質ナノフラグメント作製法の確立
2018年04月 - 2019年03月
公益財団法人京都技術科学センター
ハラ エミリオ・サトシ
担当区分：研究代表者
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Bioengineering bridges between Okayama and Sao Paulo Universities
2017年
岡山大学 H29岡山大学次世代研究コア形成支援事業・若手研究者育成支援事業
ハラ エミリオ・サトシ
担当区分：研究代表者
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合成微小環境を用いた軟骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ構築
研究課題/領域番号：14F04106 2014年04月 - 2016年03月
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特別研究員奨励費 特別研究員奨励費
松本 卓也, ハラ エミリオ・サトシ
配分額：2400000円 （ 直接経費：2400000円 ）
The purpose of this study was to identify new methods and culture conditions to enhance chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem/progenitor cells (hBMSCs) by applying chemical, physical and biological cues, including overexpression of DNA methyltransferases (DNMTs) in cells. We attempted to fabricate a chemically- and physically-controlled microenvironment using materials (e.g., hydrogels) that recapitulate native cell niche characteristics to optimally modulate the chondrogenic differentiation of BMSCs. Besides the physical and chemical stimulations, we also evaluated the chondrogenic differentiation of hBMSCs after overexpression of DNMTs that eventually induce DNA methylation at CPG rich regions of key genes. To study the effect of DNMTs on chondrogenesis of hBMSCs, we transfected overexpression vectors of DNMT3A, DNMT3B and the pcDNA control in hBMSCs, and culture the cells in a 3D micromass culture system with growth factors and glucocorticoids.
Additionally, since in vitro synthesized cartilage tissue generally undergoes through mineralization, we also attempted to understand the mechanisms involved in the chondrocyte death associated with initial mineralization process by using the secondary ossification center of mouse femur as in vivo model.