2024/02/07 更新

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オオハシ トシタカ
大橋 俊孝
OOHASHI Toshitaka
所属
医歯薬学域 教授
職名
教授
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プロフィール
神経特異的細胞外マトリックス(ECM)分子の発見から、その機能、神経糖鎖生物学に魅せられています。また、軟骨代謝、軟骨プロテオグリカンのイメージング、薬物送達技術にも興味をもっています。
外部リンク

学位

  • 博士(薬学) ( 岡山大学 )

研究キーワード

  • 分子生物学

  • マトリックス生物学

  • 生化学

研究分野

  • ライフサイエンス / 神経科学一般

  • ライフサイエンス / 医化学

  • ライフサイエンス / 耳鼻咽喉科学

  • ライフサイエンス / 形成外科学

  • ライフサイエンス / 生体材料学

  • ライフサイエンス / 生体医工学

  • ライフサイエンス / 整形外科学

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学歴

  • 岡山大学   Graduate School, Division of National Science and Technology  

    - 1992年

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  • 岡山大学    

    - 1992年

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    国名: 日本国

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  • 京都大学   Faculty of Pharmaceutical Science  

    - 1987年

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  • 京都大学   Faculty of Pharmaceutical Sciences  

    - 1987年

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    国名: 日本国

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経歴

  • - Professor,Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences,Okayama University

    2014年 - 現在

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  • - 岡山大学医歯薬学総合研究科 教授

    2014年 - 現在

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  • 岡山大学   学術研究院医歯薬学域   教授

    2022年4月 - 現在

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    国名:日本国

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  • Associate Professor,Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences,Okayama University

    2012年 - 2014年

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  • 岡山大学医歯薬学総合研究科 准教授

    2012年 - 2014年

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  • Max-Planck Research fellow,Max-Planck Institute of Biochemistry

    1997年2月 - 1997年9月

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  • マックスプランク 生化学研究所 マックスプランク研究員

    1997年2月 - 1997年9月

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  • Postdoctoral Fellowships of Japan Society for the Promotion of Science,Max-Planck Institute of Biochemistry

    1996年 - 1997年

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  • マックスプランク 生化学研究所 日本学術振興会特別研究員

    1996年 - 1997年

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所属学協会

  • 日本軟骨代謝学会理事

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  • 日本軟骨代謝学会 評議員

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  • 日本神経科学会

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  • 日本結合組織学会

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  • 日本マトリックス研究会

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  • 日本分子生物学会

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  • 日本生化学会

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  • The Japanese Biochemical Society

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  • 日本結合組織学会理事

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  • International Society for Matrix Biology

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委員歴

  • 日本学術振興会   専門委員  

    2023年11月 - 2024年10月   

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  • 日本結合組織学会理事   理事  

    2018年   

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    団体区分:学協会

    日本結合組織学会理事

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  • 日本軟骨代謝学会理事   理事  

    2017年   

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    団体区分:学協会

    日本軟骨代謝学会理事

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  • 日本軟骨代謝学会 評議員   評議員  

    2014年   

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    団体区分:学協会

    日本軟骨代謝学会 評議員

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  • 日本生化学会   なし  

    1987年   

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    団体区分:学協会

    日本生化学会

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論文

  • The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function. 査読 国際誌

    James W Fawcett, Toshitaka Oohashi, Tommaso Pizzorusso

    Nature reviews. Neuroscience   20 ( 8 )   451 - 465   2019年8月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Perineuronal nets (PNNs) are extracellular matrix (ECM) chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG)-containing structures that surround the soma and dendrites of various mammalian neuronal cell types. PNNs appear during development around the time that the critical periods for developmental plasticity end and are important for both their onset and closure. A similar structure - the perinodal ECM - surrounds the axonal nodes of Ranvier and appears as myelination is completed, acting as an ion-diffusion barrier that affects axonal conduction speed. Recent work has revealed the importance of PNNs in controlling plasticity in the CNS. Digestion, blocking or removal of PNNs influences functional recovery after a variety of CNS lesions. PNNs have further been shown to be involved in the regulation of memory and have been implicated in a number of psychiatric disorders.

    DOI: 10.1038/s41583-019-0196-3

    PubMed

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  • Aggrecan governs intervertebral discs development by providing critical mechanical cues of the extracellular matrix. 国際誌

    Marta Empere, Xujia Wang, Carina Prein, Anders Aspberg, Markus Moser, Toshitaka Oohashi, Hauke Clausen-Schaumann, Attila Aszodi, Paolo Alberton

    Frontiers in bioengineering and biotechnology   11   1128587 - 1128587   2023年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Aggrecan (ACAN) is localized in the intervertebral disc (IVD) in unique compartment-specific patterns where it contributes to the tissue structure and mechanical function together with collagens. The extracellular matrix (ECM) of the IVD undergoes degenerative changes during aging, misuse or trauma, which inevitably alter the biochemical and biomechanical properties of the tissue. A deeper understanding of these processes can be achieved in genetically engineered mouse models, taking into account the multifaceted aspects of IVD development. In this study, we generated aggrecan insertion mutant mice (Acan iE5/iE5 ) by interrupting exon 5 coding for the G1 domain of ACAN, and analyzed the morphological and mechanical properties of the different IVD compartments during embryonic development. Western blotting using an antibody against the total core protein failed to detect ACAN in cartilage extracts, whereas immunohistochemistry by a G1-specific antibody showed weak signals in vertebral tissues of Acan iE5/iE5 mice. Homozygous mutant mice are perinatally lethal and characterized by short snout, cleft palate and disproportionate dwarfism. Whole-mount skeletal staining and µ-CT analysis of Acan iE5/iE5 mice at embryonic day 18.5 revealed compressed vertebral bodies with accelerated mineralization compared to wild type controls. In Acan iE5/iE5 mice, histochemical staining revealed collapsed extracellular matrix with negligible sulfated glycosaminoglycan content accompanied by a high cellular density. Collagen type II deposition was not impaired in the IVD of Acan iE5/iE5 mice, as shown by immunohistochemistry. Mutant mice developed a severe IVD phenotype with deformed nucleus pulposus and thinned cartilaginous endplates accompanied by a disrupted growth plate structure in the vertebral body. Atomic force microscopy (AFM) imaging demonstrated a denser collagen network with thinner fibrils in the mutant IVD zones compared to wild type. Nanoscale AFM indentation revealed bimodal stiffness distribution attributable to the softer proteoglycan moiety and harder collagenous fibrils of the wild type IVD ECM. In Acan iE5/iE5 mice, loss of aggrecan resulted in a marked shift of the Young's modulus to higher values in all IVD zones. In conclusion, we demonstrated that aggrecan is pivotal for the determination and maintenance of the proper stiffness of IVD and vertebral tissues, which in turn could play an essential role in providing developmental biomechanical cues.

    DOI: 10.3389/fbioe.2023.1128587

    PubMed

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  • Ten-m4 plays a unique role in the establishment of binocular visual circuits. 国際誌

    Timothy R Young, Dylan Black, Hannan Mansuri, Toshitaka Oohashi, Xiao-Hong Zhou, Atomu Sawatari, Catherine A Leamey

    Developmental neurobiology   83 ( 3-4 )   104 - 124   2023年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The patterning of binocular vision requires distinct molecular pathways for inputs arising from each side of the nervous system. Recent studies have demonstrated important roles for members of the Ten-m/Odz/teneurin family in the development of ipsilateral retinal projections. Here, we further highlight the significance of this gene family in visual development by identifying a role for Ten-m4 during the formation of the ipsilateral projection in the mouse. Ten-m4 was found to be expressed in the retina, dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN), superior colliculus (SC), and primary visual cortex (V1) during development. Anterograde and retrograde tracing experiments in Ten-m4 knockout (KO) mice revealed a specific increase in ipsilateral retinal ganglion cells projecting to dLGN and SC. This increase was most prominent in regions corresponding to temporal retina. Consistent with this, EphB1 expression in the retina around the time of decussation was enhanced in this temporal region for KO mice, suggesting that the increased size of the ipsilateral population arises due to an increased number of retinal ganglion cells remaining ipsilaterally at the optic chiasm due to EphB1-mediated repulsion. The ectopic ipsilaterally targeted retinal ganglion cell projection observed in Ten-m4 KOs was associated with changes in response to ethologically relevant visual stimuli. Together, these data demonstrate a requirement for Ten-m4 in the establishment of ipsilateral projections from the retina, which likely acts in combination with other Ten-m members (Ten-m2 and Ten-m3) to promote the formation of functional binocular circuits.

    DOI: 10.1002/dneu.22912

    PubMed

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  • Cysteinyl leukotriene receptor 1 is dispensable for osteoclast differentiation and bone resorption. 国際誌

    Hirofumi Fujita, Aoi Ando, Yohei Mizusawa, Mitsuaki Ono, Takako Hattori, Munenori Habuta, Toshitaka Oohashi, Satoshi Kubota, Hideyo Ohuchi

    PloS one   17 ( 11 )   e0277307   2022年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Cysteinyl leukotriene receptor 1 (CysLTR1) is a G protein-coupled receptor for the inflammatory lipid mediators cysteinyl leukotrienes, which are involved in smooth muscle constriction, vascular permeability, and macrophage chemokine release. The Cysltr1 gene encoding CysLTR1 is expressed in the macrophage lineage, including osteoclasts, and the CysLTR1 antagonist Montelukast has been shown to suppress the formation of osteoclasts. However, it currently remains unclear whether CysLTR1 is involved in osteoclast differentiation and bone loss. Therefore, to clarify the role of CysLTR1 in osteoclastogenesis and pathological bone loss, we herein generated CysLTR1 loss-of-function mutant mice by disrupting the cysltr1 gene using the CRISPR-Cas9 system. These mutant mice had a frameshift mutation resulting in a premature stop codon (Cysltr1 KO) or an in-frame mutation causing the deletion of the first extracellular loop (Cysltr1Δ105). Bone marrow macrophages (BMM) from these mutant mice lost the intracellular flux of calcium in response to leukotriene D4, indicating that these mutants completely lost the activity of CysLTR1 without triggering genetic compensation. However, disruption of the Cysltr1 gene did not suppress the formation of osteoclasts from BMM in vitro. We also demonstrated that the CysLTR1 antagonist Montelukast suppressed the formation of osteoclasts without functional CysLTR1. On the other hand, disruption of the Cysltr1 gene partially suppressed the formation of osteoclasts stimulated by leukotriene D4 and did not inhibit that by glutathione, functioning as a substrate in the synthesis of cysteinyl leukotrienes. Disruption of the Cysltr1 gene did not affect ovariectomy-induced osteoporosis or lipopolysaccharide-induced bone resorption. Collectively, these results suggest that the CysLT-CysLTR1 axis is dispensable for osteoclast differentiation in vitro and pathological bone loss, while the leukotriene D4-CysTR1 axis is sufficient to stimulate osteoclast formation. We concluded that the effects of glutathione and Montelukast on osteoclast formation were independent of CysLTR1.

    DOI: 10.1371/journal.pone.0277307

    PubMed

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  • Suppression of Bone Necrosis around Tooth Extraction Socket in a MRONJ-like Mouse Model by E-rhBMP-2 Containing Artificial Bone Graft Administration. 査読 国際誌

    Yukie Tanaka, Kyaw Thu Aung, Mitsuaki Ono, Akihiro Mikai, Anh Tuan Dang, Emilio Satoshi Hara, Ikue Tosa, Kei Ishibashi, Aya Ono-Kimura, Kumiko Nawachi, Takuo Kuboki, Toshitaka Oohashi

    International journal of molecular sciences   22 ( 23 )   2021年11月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Medication-related osteonecrosis of the jaw (MRONJ) is related to impaired bone healing conditions in the maxillomandibular bone region as a complication of bisphosphonate intake. Although there are several hypotheses for the onset of MRONJ symptoms, one of the possible causes is the inhibition of bone turnover and blood supply leading to bone necrosis. The optimal treatment strategy for MRONJ has not been established either. BMP-2, a member of the TGF-β superfamily, is well known for regulating bone remodeling and homeostasis prenatally and postnatally. Therefore, the objectives of this study were to evaluate whether cyclophosphamide/zoledronate (CY/ZA) induces necrosis of the bone surrounding the tooth extraction socket, and to examine the therapeutic potential of BMP-2 in combination with the hard osteoinductive biomaterial, β-tricalcium phosphate (β-TCP), in the prevention and treatment of alveolar bone loss around the tooth extraction socket in MRONJ-like mice models. First, CY/ZA was intraperitoneally administered for three weeks, and alveolar bone necrosis was evaluated before and after tooth extraction. Next, the effect of BMP-2/β-TCP was investigated in both MRONJ-like prevention and treatment models. In the prevention model, CY/ZA was continuously administered for four weeks after BMP-2/β-TCP transplantation. In the treatment model, CY/ZA administration was suspended after transplantation of BMP-2/β-TCP. The results showed that CY/ZA induced a significant decrease in the number of empty lacunae, a sign of bone necrosis, in the alveolar bone around the tooth extraction socket after tooth extraction. Histological analysis showed a significant decrease in the necrotic alveolar bone around tooth extraction sockets in the BMP-2/β-TCP transplantation group compared to the non-transplanted control group in both MRONJ-like prevention and treatment models. However, bone mineral density, determined by micro-CT analysis, was significantly higher in the BMP-2/β-TCP transplanted group than in the control group in the prevention model only. These results clarified that alveolar bone necrosis around tooth extraction sockets can be induced after surgical intervention under CY/ZA administration. In addition, transplantation of BMP-2/β-TCP reduced the necrotic alveolar bone around the tooth extraction socket. Therefore, a combination of BMP-2/β-TCP could be an alternative approach for both prevention and treatment of MRONJ-like symptoms.

    DOI: 10.3390/ijms222312823

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  • Imatinib has minimal effects on inflammatory and osteopenic phenotypes in a murine cherubism model. 査読 国際誌

    Tomoyuki Mukai, Takahiko Akagi, Sumie Hiramatsu Asano, Ikue Tosa, Mitsuaki Ono, Mizuho Kittaka, Yasuyoshi Ueki, Ayano Yahagi, Masanori Iseki, Toshitaka Oohashi, Katsuhiko Ishihara, Yoshitaka Morita

    Oral diseases   29 ( 3 )   1089 - 1101   2021年11月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    OBJECTIVE: Cherubism is a genetic disorder characterised by bilateral jawbone deformation. The associated jawbone lesions regress after puberty, whereas severe cases require surgical treatment. Although several drugs have been tested, fundamental treatment strategies for cherubism have not been established. The effectiveness of imatinib has recently been reported; however, its pharmaceutical mechanism remains unclear. In this study, we tested the effects of imatinib using a cherubism mouse model. METHODS: We used Sh3bp2 P416R cherubism mutant mice, which exhibit systemic organ inflammation and osteopenia. The effects of imatinib were determined using primary bone marrow-derived macrophages. Imatinib was administered intraperitoneally to the mice, and serum tumour necrosis factor-α (TNFα), organ inflammation and bone properties were examined. RESULTS: The cherubism mutant macrophages produced higher levels of TNFα in response to lipopolysaccharide compared to wild-type macrophages, and imatinib did not significantly suppress TNFα production. Although imatinib suppressed osteoclast formation in vitro, administering it in vivo did not suppress organ inflammation and osteopenia. CONCLUSION: The in vivo administration of imatinib had a minimal therapeutic impact in cherubism mutant mice. To establish better pharmaceutical interventions, it is necessary to integrate new findings from murine models with clinical data from patients with a definitive diagnosis of cherubism.

    DOI: 10.1111/odi.14073

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  • Assessment of Possible Contributions of Hyaluronan and Proteoglycan Binding Link Protein 4 to Differential Perineuronal Net Formation at the Calyx of Held. 査読 国際誌

    Kojiro Nojima, Haruko Miyazaki, Tetsuya Hori, Lydia Vargova, Toshitaka Oohashi

    Frontiers in cell and developmental biology   9   730550 - 730550   2021年9月

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    担当区分:最終著者, 責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The calyx of Held is a giant nerve terminal mediating high-frequency excitatory input to principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body (MNTB). MNTB principal neurons are enwrapped by densely organized extracellular matrix structures, known as perineuronal nets (PNNs). Emerging evidence indicates the importance of PNNs in synaptic transmission at the calyx of Held. Previously, a unique differential expression of aggrecan and brevican has been reported at this calyceal synapse. However, the role of hyaluronan and proteoglycan binding link proteins (HAPLNs) in PNN formation and synaptic transmission at this synapse remains elusive. This study aimed to assess immunohistochemical evidence for the effect of HAPLN4 on differential PNN formation at the calyx of Held. Genetic deletion of Hapln4 exhibited a clear ectopic shift of brevican localization from the perisynaptic space between the calyx of Held terminals and principal neurons to the neuropil surrounding the whole calyx of Held terminals. In contrast, aggrecan expression showed a consistent localization at the surrounding neuropil, together with HAPLN1 and tenascin-R, in both gene knockout (KO) and wild-type (WT) mice. An in situ proximity ligation assay demonstrated the molecular association of brevican with HAPLN4 in WT and HAPLN1 in gene KO mice. Further elucidation of the roles of HAPLN4 may highlight the developmental and physiological importance of PNN formation in the calyx of Held.

    DOI: 10.3389/fcell.2021.730550

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  • Preclinical bioequivalence study of E.coli-derived rhBMP-2/β-TCP and autogenous bone in a canine guided-bone regeneration model. 査読

    Shuji Nosho, Mitsuaki Ono, Taishi Komori, Akihiro Mikai, Ikue Tosa, Kei Ishibashi, Yukie Tanaka, Aya Kimura-Ono, Emilio S Hara, Toshitaka Oohashi, Takuo Kuboki

    Journal of prosthodontic research   66 ( 1 )   124 - 130   2021年6月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    PURPOSE: Bone morphogenetic protein (BMP)-2 is a potent growth factor that is widely used in the orthopedic and dental fields for bone regeneration.However, recombinant human BMP-2 (rhBMP-2) products have not been legally approved in Japan. Recently, our research group succeeded in producing GMP-grade rhBMP-2 using the E. coli system (E-rhBMP-2) at the industrial level and developed E-rhBMP-2 adsorbed onto β-TCP (E-rhBMP-2/β-TCP) as an alternative material to autogenous bone grafts. Previous studies on the toxicity, pharmacokinetics, and optimal doses of E-rhBMP-2 have confirmed its safety and efficiency. However, comparative studies with standard treatment therapies are still necessary before clinical application in humans. Therefore, in this preclinical study, we compared the bone regeneration ability of E-rhBMP-2/β-TCP and autogenous bone grafts in a canine guided-bone regeneration model. METHODS: Following extraction of the maxillary third premolar, box-type bone defects (10 mmL × 4 mmW × 9 mmH) were created in the extraction socket area and transplanted with E-rhBMP-2/β-TCP or autogenous bone graft in a canine. After 8 weeks, micro-CT and histological analyses were performed. RESULTS: Transplantation of both E-rhBMP-2/β-TCP and autogenous bone graft significantly promoted bone formation compared to the non-transplantation control group. The bone formation ability of E-rhBMP-2/β-TCP was equal to that of the autogenous bone graft. Histological analysis showed that excessive infiltration of inflammatory cells and residual β-TCP particles mostly were not observed in the E-rhBMP-2/β-TCP transplantation group. CONCLUSIONS: This preclinical study demonstrated that E-rhBMP-2/β-TCP and autogenous bone have equal potential to promote bone regeneration.

    DOI: 10.2186/jpr.JPR_D_20_00226

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  • Lack of collagen α6(IV) chain in mice does not cause severe-to-profound hearing loss or cochlear malformation, a distinct phenotype from nonsyndromic hearing loss with COL4A6 missense mutation. 査読 国際誌

    Shaoying Tang, Tomoko Yonezawa, Yukihide Maeda, Mitsuaki Ono, Takahiro Maeba, Toru Miyoshi, Ryusuke Momota, Yasuko Tomono, Toshitaka Oohashi

    PloS one   16 ( 4 )   e0249909   2021年4月

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    担当区分:最終著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Congenital hearing loss affects 1 in every 1000 births, with genetic mutations contributing to more than 50% of all cases. X-linked nonsyndromic hereditary hearing loss is associated with six loci (DFNX1-6) and five genes. Recently, the missense mutation (c.1771G>A, p.Gly591Ser) in COL4A6, encoding the basement membrane (BM) collagen α6(IV) chain, was shown to be associated with X-linked congenital nonsyndromic hearing loss with cochlear malformation. However, the mechanism by which the COL4A6 mutation impacts hereditary hearing loss has not yet been elucidated. Herein, we investigated Col4a6 knockout (KO) effects on hearing function and cochlear formation in mice. Immunohistochemistry showed that the collagen α6(IV) chain was distributed throughout the mouse cochlea within subepithelial BMs underlying the interdental cells, inner sulcus cells, basilar membrane, outer sulcus cells, root cells, Reissner's membrane, and perivascular BMs in the spiral limbus, spiral ligament, and stria vascularis. However, the click-evoked auditory brainstem response analysis did not show significant changes in the hearing threshold of Col4a6 KO mice compared with wild-type (WT) mice with the same genetic background. In addition, the cochlear structures of Col4a6 KO mice did not exhibit morphological alterations, according to the results of high-resolution micro-computed tomography and histology. Hence, loss of Col4a6 gene expression in mice showed normal click ABR thresholds and normal cochlear formation, which differs from humans with the COL4A6 missense mutation c.1771G>A, p.Gly591Ser. Therefore, the deleterious effects in the auditory system caused by the missense mutation in COL4A6 are likely due to the dominant-negative effects of the α6(IV) chain and/or α5α6α5(IV) heterotrimer with an aberrant structure that would not occur in cases with loss of gene expression.

    DOI: 10.1371/journal.pone.0249909

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  • Distinct Osteogenic Potentials of BMP-2 and FGF-2 in Extramedullary and Medullary Microenvironments. 査読 国際誌

    Shuji Nosho, Ikue Tosa, Mitsuaki Ono, Emilio Satoshi Hara, Kei Ishibashi, Akihiro Mikai, Yukie Tanaka, Aya Kimura-Ono, Taishi Komori, Kenji Maekawa, Takuo Kuboki, Toshitaka Oohashi

    International journal of molecular sciences   21 ( 21 )   2020年10月

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    担当区分:最終著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and fibroblast growth factor-2 (FGF-2) have been regarded as the major cytokines promoting bone formation, however, several studies have reported unexpected results with failure of bone formation or bone resorption of these growth factors. In this study, BMP-2 and FGF-2 adsorbed into atellocollagen sponges were transplanted into bone defects in the bone marrow-scarce calvaria (extramedullary environment) and bone marrow-abundant femur (medullary environment) for analysis of their in vivo effects not only on osteoblasts, osteoclasts but also on bone marrow cells. The results showed that BMP-2 induced high bone formation in the bone marrow-scarce calvaria, but induced bone resorption in the bone marrow-abundant femurs. On the other hand, FGF-2 showed opposite effects compared to those of BMP-2. Analysis of cellular dynamics revealed numerous osteoblasts and osteoclasts present in the newly-formed bone induced by BMP-2 in calvaria, but none were seen in either control or FGF-2-transplanted groups. On the other hand, in the femur, numerous osteoclasts were observed in the vicinity of the BMP-2 pellet, while a great number of osteoblasts were seen near the FGF-2 pellets or in the control group. Of note, FCM analysis showed that both BMP-2 and FGF-2 administrated in the femur did not significantly affect the hematopoietic cell population, indicating a relatively safe application of the two growth factors. Together, these results indicate that BMP-2 could be suitable for application in extramedullary bone regeneration, whereas FGF-2 could be suitable for application in medullary bone regeneration.

    DOI: 10.3390/ijms21217967

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  • BMP-2/β-TCP Local Delivery for Bone Regeneration in MRONJ-Like Mouse Model. 査読 国際誌

    Mikai A, Ono M, Tosa I, Nguyen HTT, Hara ES, Nosho S, Kimura-Ono A, Nawachi K, Takarada T, Kuboki T, Oohashi T

    Int J Mol Sci.   21 ( 19 )   E7028   2020年9月

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    担当区分:最終著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Medication-related osteonecrosis of the jaw (MRONJ) is a severe pathological condition associated mainly with the long-term administration of bone resorption inhibitors, which are known to induce suppression of osteoclast activity and bone remodeling. Bone Morphogenetic Protein (BMP)-2 is known to be a strong inducer of bone remodeling, by directly regulating osteoblast differentiation and osteoclast activity. This study aimed to evaluate the effects of BMP-2 adsorbed onto beta-tricalcium phosphate (β-TCP), which is an osteoinductive bioceramic material and allows space retention, on the prevention and treatment of MRONJ in mice. Tooth extraction was performed after 3 weeks of zoledronate (ZA) and cyclophosphamide (CY) administration. For prevention studies, BMP-2/β-TCP was transplanted immediately after tooth extraction, and the mice were administered ZA and CY for an additional 4 weeks. The results showed that while the tooth extraction socket was mainly filled with a sparse tissue in the control group, bone formation was observed at the apex of the tooth extraction socket and was filled with a dense connective tissue rich in cellular components in the BMP-2/β-TCP transplanted group. For treatment studies, BMP-2/β-TCP was transplanted 2 weeks after tooth extraction, and bone formation was followed up for the subsequent 4 weeks under ZA and CY suspension. The results showed that although the tooth extraction socket was mainly filled with soft tissue in the control group, transplantation of BMP-2/β-TCP could significantly accelerate bone formation, as shown by immunohistochemical analysis for osteopontin, and reduce the bone necrosis in tooth extraction sockets. These data suggest that the combination of BMP-2/β-TCP could become a suitable therapy for the management of MRONJ.

    DOI: 10.3390/ijms21197028

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  • The Effect of Hapln4 Link Protein Deficiency on Extracellular Space Diffusion Parameters and Perineuronal Nets in the Auditory System During Aging. 査読 国際誌

    Petra Sucha, Martina Chmelova, Monika Kamenicka, Marcel Bochin, Toshitaka Oohashi, Lydia Vargova

    Neurochemical research   45 ( 1 )   68 - 82   2020年1月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Hapln4 is a link protein which stabilizes the binding between lecticans and hyaluronan in perineuronal nets (PNNs) in specific brain regions, including the medial nucleus of the trapezoid body (MNTB). The aim of this study was: (1) to reveal possible age-related alterations in the extracellular matrix composition in the MNTB and inferior colliculus, which was devoid of Hapln4 and served as a negative control, (2) to determine the impact of the Hapln4 deletion on the values of the ECS diffusion parameters in young and aged animals and (3) to verify that PNNs moderate age-related changes in the ECS diffusion, and that Hapln4-brevican complex is indispensable for the correct protective function of the PNNs. To achieve this, we evaluated the ECS diffusion parameters using the real-time iontophoretic method in the selected region in young adult (3 to 6-months-old) and aged (12 to 18-months-old) wild type and Hapln4 knock-out (KO) mice. The results were correlated with an immunohistochemical analysis of the ECM composition and astrocyte morphology. We report that the ECM composition is altered in the aged MNTB and aging is a critical point, revealing the effect of Hapln4 deficiency on the ECS diffusion. All of our findings support the hypothesis that the ECM changes in the MNTB of aged KO animals affect the ECS parameters indirectly, via morphological changes of astrocytes, which are in direct contact with synapses and can be influenced by the ongoing synaptic transmission altered by shifts in the ECM composition.

    DOI: 10.1007/s11064-019-02894-2

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  • Mechanical strain attenuates cytokine-induced ADAMTS9 expression via transient receptor potential vanilloid type 1. 査読 国際誌

    Takashi Ohtsuki, Akira Shinaoka, Kanae Kumagishi-Shinaoka, Keiichi Asano, Omer Faruk Hatipoglu, Junko Inagaki, Ken Takahashi, Toshitaka Oohashi, Keiichiro Nishida, Keiji Naruse, Satoshi Hirohata

    Experimental cell research   383 ( 2 )   111556 - 111556   2019年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The synovial fluids of patients with osteoarthritis (OA) contain elevated levels of inflammatory cytokines, which induce the expression of a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) and of the matrix metalloproteinase (MMP) in chondrocytes. Mechanical strain has varying effects on organisms depending on the strength, cycle, and duration of the stressor; however, it is unclear under inflammatory stimulation how mechanical strain act on. Here, we show that mechanical strain attenuates inflammatory cytokine-induced expression of matrix-degrading enzymes. Cyclic tensile strain (CTS), as a mechanical stressor, attenuated interleukin (IL)-1β and tumor necrosis factor (TNF)-α-induced mRNA expression of ADAMTS4, ADAMTS9, and MMP-13 in normal chondrocytes (NHAC-kn) and in a chondrocytic cell line (OUMS-27). This effect was abolished by treating cells with mechano-gated channel inhibitors, such as gadolinium, transient receptor potential (TRP) family inhibitor, ruthenium red, and with pharmacological and small interfering RNA-mediated TRPV1 inhibition. Furthermore, nuclear factor κB (NF-κB) translocation from the cytoplasm to the nucleus resulting from cytokine stimulation was also abolished by CTS. These findings suggest that mechanosensors such as the TRPV protein are potential therapeutic targets in treating OA.

    DOI: 10.1016/j.yexcr.2019.111556

    Web of Science

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  • Type XVIII Collagen Modulates Keratohyalin Granule Formation and Keratinization in Oral Mucosa. 査読 国際誌

    Ha Thi Thu Nguyen, Mitsuaki Ono, Emilio Satoshi Hara, Taishi Komori, Midori Edamatsu, Tomoko Yonezawa, Aya Kimura-Ono, Kenji Maekawa, Takuo Kuboki, Toshitaka Oohashi

    International journal of molecular sciences   20 ( 19 )   2019年9月

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    担当区分:最終著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Epithelial keratinization involves complex cellular modifications that provide protection against pathogens and chemical and mechanical injuries. In the oral cavity, keratinized mucosa is also crucial to maintain healthy periodontal or peri-implant tissues. In this study, we investigated the roles of type XVIII collagen, a collagen-glycosaminoglycan featuring an extracellular matrix component present in the basement membrane, in oral mucosal keratinization. Histological analysis of keratinized and non-keratinized oral mucosa showed that type XVIII collagen was highly expressed in keratinized mucosa. Additionally, a 3D culture system using human squamous carcinoma cells (TR146) was used to evaluate and correlate the changes in the expression of type XVIII collagen gene, COL18A1, and epithelial keratinization-related markers, e.g., keratin 1 (KRT1) and 10 (KRT10). The results showed that the increase in COL18A1 expression followed the increase in KRT1 and KRT10 mRNA levels. Additionally, loss-of-function analyses using silencing RNA targeting COL18A1 mRNA and a Col18-knockout (KO) mouse revealed that the absence of type XVIII collagen induces a dramatic decrease in KRT10 expression as well as in the number and size of keratohyalin granules. Together, the results of this study demonstrate the importance of type XVIII collagen in oral mucosal keratinization.

    DOI: 10.3390/ijms20194739

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  • Postnatal Runx2 deletion leads to low bone mass and adipocyte accumulation in mice bone tissues. 査読 国際誌

    Ikue Tosa, Daisuke Yamada, Misa Yasumatsu, Eiichi Hinoi, Mitsuaki Ono, Toshitaka Oohashi, Takuo Kuboki, Takeshi Takarada

    Biochemical and biophysical research communications   516 ( 4 )   1229 - 1233   2019年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Global gene deletion studies have established that Runt-related transcription factor-2 (Runx2) is essential during skeletogenesis for osteoblastic differentiation in both intramembranous and endochondral ossification processes. However, the postnatal significance of Runx2 in vivo is poorly understood because a global Runx2 deletion causes perinatal lethality. In this study, we generated tamoxifen-induced Runx2 global deficient mice by crossing Runx2flox mice with ROSA26-CreERT2 mice (Rosa26-CreERT2; Runx2flox/flox). Four-week-old mice were intraperitoneally treated with tamoxifen for five consecutive days, sacrificed, and analyzed six weeks after tamoxifen administration. Deletion of Runx2 led to low bone mass, which is associated with decreased bone formation and bone resorption as well as excessive bone marrow adiposity. Collectively, postnatal Runx2 absolutely plays an important role in maintaining the homeostasis of bone tissues not only in bone mass, but also in the bone marrow environment.

    DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.07.014

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  • Collagen XVIII Deposition in the Basement Membrane Zone beneath the Newly Forming Epidermis during Wound Healing in Mice. 査読

    Takahiro Maeba, Tomoko Yonezawa, Mitsuaki Ono, Yasuko Tomono, Ritva Heljasvaara, Taina Pihlajaniemi, Kiichi Inagawa, Toshitaka Oohashi

    Acta medica Okayama   73 ( 2 )   135 - 146   2019年4月

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    担当区分:最終著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The basement membrane (BM) is composed of various extracellular molecules and regulates tissue regeneration and maintenance. Here, we demonstrate that collagen XVIII was spatiotemporally expressed in the BM during skin wound healing in a mouse excisional wound-splinting model. Re-epithelialization was detected at days 3 and 6 post-wounding. The ultrastructure of epidermal BM was discontinuous at day 3, whereas on day 6 a continuous BM was observed in the region proximal to the wound edge. Immunohistochemistry demonstrated that collagen XVIII was deposited in the BM zone beneath newly forming epidermis in day 3 and 6 wounds. Laminin-332, known to be the earliest BM component appearing in wounds, was colocalized with collagen XVIII in the epidermal BM zone at days 3 and 6. The deposition of α1(IV) collagen and nidogen-1 in the epidermal BM zone occurred later than that of collagen XVIII. We also observed the short isoform of collagen XVIII in the epidermal BM zone at day 3 post-wounding. Collectively, our results suggested that collagen XVIII plays a role in the formation of the dermal-epidermal junction during re-epithelialization, and that it is the short isoform that is involved in the early phase of re-epithelialization.

    DOI: 10.18926/AMO/56649

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  • Acidic Pre-Conditioning Enhances the Stem Cell Phenotype of Human Bone Marrow Stem/Progenitor Cells. 査読 国際誌

    Yuri Hazehara-Kunitomo, Emilio Satoshi Hara, Mitsuaki Ono, Kyaw Thu Aung, Keiko Komi, Hai Thanh Pham, Kentaro Akiyama, Masahiro Okada, Toshitaka Oohashi, Takuya Matsumoto, Takuo Kuboki

    International journal of molecular sciences   20 ( 5 )   2019年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    A deeper understanding of the detailed mechanism of in vivo tissue healing is necessary for the development of novel regenerative therapies. Among several external factors, environmental pH is one of the crucial parameters that greatly affects enzyme activity and cellular biochemical reactions involving tissue repair and homeostasis. In this study, in order to analyze the microenvironmental conditions during bone healing, we first measured the pH in vivo at the bone healing site using a high-resolution fiber optic pH microsensor directly in femur defects and tooth extraction sockets. The pH was shown to decrease from physiological 7.4 to 6.8 during the initial two days of healing (inflammatory phase). In the same initial stages of the inflammatory phase of the bone healing process, mesenchymal stem cells (MSCs) are known to migrate to the healing site to contribute to tissue repair. Therefore, we investigated the effect of a short-term acidic (pH 6.8) pre-treatment on the stemness of bone marrow-derived MSCs (BMSCs). Interestingly, the results showed that pre-treatment of BMSCs with acidic pH enhances the expression of stem cell markers (OCT-4, NANOG, SSEA-4), as well as cell viability and proliferation. On the other hand, acidic pH decreased BMSC migration ability. These results indicate that acidic pH during the initial stages of bone healing is important to enhance the stem cell properties of BMSCs. These findings may enable the development of novel methods for optimization of stem cell function towards tissue engineering or regenerative medicine.

    DOI: 10.3390/ijms20051097

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  • Bone Marrow Cells Inhibit BMP-2-Induced Osteoblast Activity in the Marrow Environment. 査読 国際誌

    Ha Thi Nguyen, Mitsuaki Ono, Yasutaka Oida, Emilio Satoshi Hara, Taishi Komori, Kentaro Akiyama, Ha Thi Thu Nguyen, Kyaw Thu Aung, Hai Thanh Pham, Ikue Tosa, Takeshi Takarada, Koichi Matsuo, Toshihide Mizoguchi, Toshitaka Oohashi, Takuo Kuboki

    Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research   34 ( 2 )   327 - 332   2019年2月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is widely known as a potent growth factor that promotes bone formation. However, an increasing number of studies have demonstrated side effects of BMP-2 therapy. A deeper understanding of the effect of BMP-2 on cells other than those involved directly in bone remodeling is of fundamental importance to promote a more effective delivery of BMP-2 to patients. In this study, we aimed to investigate the effect of BMP-2 in the marrow environment. First, BMP-2 adsorbed onto titanium implants was delivered at the tooth extraction socket (marrow-absent site) or in the mandible marrow of beagle dogs. BMP-2 could induce marked bone formation around the implant at the tooth extraction socket. Surprisingly, however, no bone formation was observed in the BMP-2-coated titanium implants inserted in the mandible marrow. In C57BL/6 mice, BMP-2 adsorbed in freeze-dried collagen pellets could induce bone formation in marrow-absent calvarial bone. However, similar to the canine model, BMP-2 could not induce bone formation in the femur marrow. Analysis of osteoblast differentiation using Col1a1(2.3)-GFP transgenic mice revealed a scarce number of osteoblasts in BMP-2-treated femurs, whereas in the control group, osteoblasts were abundant. Ablation of femur marrow recovered the BMP-2 ability to induce bone formation. In vitro experiments analyzing luciferase activity of C2C12 cells with the BMP-responsive element and alkaline phosphatase activity of MC3T3-E1 osteoblasts further revealed that bone marrow cells inhibit the BMP-2 effect on osteoblasts by direct cell-cell contact. Collectively, these results showed that the effect of BMP-2 in inducing bone formation is remarkably repressed by marrow cells via direct cell-cell contact with osteoblasts; this opens new perspectives on the clarification of the side-effects associated with BMP-2 application. © 2018 American Society for Bone and Mineral Research.

    DOI: 10.1002/jbmr.3598

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  • Under the ECM Dome: The Physiological Role of the Perinodal Extracellular Matrix as an Ion Diffusion Barrier. 査読 国際誌

    Yoko Bekku, Toshitaka Oohashi

    Advances in experimental medicine and biology   1190   107 - 122   2019年

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    担当区分:最終著者, 責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Enriched Na+ channel clustering allows for rapid saltatory conduction at a specialized structure in myelinated axons, the node of Ranvier, where cations are exchanged across the axon membrane. In the extracellular matrix (ECM), highly negatively charged molecules accumulate and wrap around the nodal gaps creating an ECM dome, called the perinodal ECM. The perinodal ECM has different molecular compositions in the central nervous system (CNS) and peripheral nervous system (PNS). Chondroitin sulfate proteoglycans are abundant in the ECM at the CNS nodes, whereas heparan sulfate proteoglycans are abundant at the PNS nodes. The proteoglycans have glycosaminoglycan chains on their core proteins, which makes them electrostatically negative. They associate with other ECM molecules and form a huge stable ECM complex at the nodal gaps. The polyanionic molecular complexes have high affinity to cations and potentially contribute to preventing cation diffusion at the nodes.In this chapter, we describe the molecular composition of the perinodal ECM in the CNS and PNS, and discuss their physiological role at the node of Ranvier.

    DOI: 10.1007/978-981-32-9636-7_8

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  • Inhibition of the glutamine transporter SNAT1 confers neuroprotection in mice by modulating the mTOR-autophagy system. 査読 国際誌

    Daisuke Yamada, Kenji Kawabe, Ikue Tosa, Shunpei Tsukamoto, Ryota Nakazato, Miki Kou, Koichi Fujikawa, Saki Nakamura, Mitsuaki Ono, Toshitaka Oohashi, Mari Kaneko, Shioi Go, Eiichi Hinoi, Yukio Yoneda, Takeshi Takarada

    Communications biology   2   346 - 346   2019年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The pathophysiological role of mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) in neurodegenerative diseases is established, but possible therapeutic targets responsible for its activation in neurons must be explored. Here we identified solute carrier family 38a member 1 (SNAT1, Slc38a1) as a positive regulator of mTORC1 in neurons. Slc38a1
    flox/flox
    and Synapsin I-Cre mice were crossed to generate mutant mice in which Slc38a1 was selectively deleted in neurons. Measurement of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) or the MAP2-negative area in a mouse model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) revealed that Slc38a1 deficiency decreased infarct size. We found a transient increase in the phosphorylation of p70S6k1 (pp70S6k1) and a suppressive effect of rapamycin on infarct size in MCAO mice. Autophagy inhibitors completely mitigated the suppressive effect of SNAT1 deficiency on neuronal cell death under in vitro stroke culture conditions. These results demonstrate that SNAT1 promoted ischemic brain damage via mTOR-autophagy system.

    DOI: 10.1038/s42003-019-0582-4

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  • DNA Methylation-Based Regulation of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem/Progenitor Cell Chondrogenic Differentiation. 査読 国際誌

    Yu Nomura, Emilio Satoshi Hara, Yuya Yoshioka, Há Thi Nguyen, Shuji Nosho, Taishi Komori, Kei Ishibashi, Toshitaka Oohashi, Mitsuaki Ono, Takuo Kuboki

    Cells, tissues, organs   207 ( 3-4 )   115 - 126   2019年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Stem cells have essential applications in in vitro tissue engineering or regenerative medicine. However, there is still a need to understand more deeply the mechanisms of stem cell differentiation and to optimize the methods to control stem cell function. In this study, we first investigated the activity of DNA methyltransferases (DNMTs) during chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem/progenitor cells (hBMSCs) and found that DNMT3A and DNMT3B were markedly upregulated during hBMSC chondrogenic differentiation. In an attempt to understand the effect of DNMT3A and DNMT3B on the chondrogenic differentiation of hBMSCs, we transiently transfected the cells with expression vectors for the two enzymes. Interestingly, DNMT3A overexpression strongly enhanced the chondrogenesis of hBMSCs, by increasing the gene expression of the mature chondrocyte marker, collagen type II, more than 200-fold. Analysis of the methylation condition in the cells revealed that DNMT3A and DNMT3B methylated the promoter sequence of early stem cell markers, NANOG and POU5F1(OCT-4). Conversely, the suppression of chondrogenic differentiation and the increase in stem cell markers of hBMSCs were obtained by chemical stimulation with the demethylating agent, 5-azacitidine. Loss-of-function assays with siRNAs targeting DNMT3A also significantly suppressed the chondrogenic differentiation of hBMSCs. Together, these results not only show the critical roles of DNMTs in regulating the chondrogenic differentiation of hBMSCs, but also suggest that manipulation of DNMT activity can be important tools to enhance the differentiation of hBMSCs towards chondrogenesis for potential application in cartilage tissue engineering or cartilage regeneration.

    DOI: 10.1159/000502885

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  • Unripe peach (Prunus persica) extract ameliorates damage from UV irradiation and improved collagen XVIII expression in 3D skin model. 査読 国際誌

    Tomoko Yonezawa, Ryusuke Momota, Hideki Iwano, Steven Zhao, Tomohiro Hakozaki, Chieko Soh, Shigetoyo Sawaki, Kazumi Toyama, Toshitaka Oohashi

    Journal of cosmetic dermatology   2018年12月

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    担当区分:最終著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    INTRODUCTION: Collagen type XVIII regulates cellular activities of adjacent cells at the dermal-epidermal junction (DEJ). To investigate its possible changes during aging, we compared its mRNA levels and protein localization in skin samples from female participants aged 20-70 years old. In addition, we evaluated the beneficial effects of unripe peach extracts in a 3D skin model. METHODS: Sun-exposed or sun-protected female skin samples were compared by DNA array or by immunohistochemistry for basement membrane components. To evaluate protective effects of fresh unripe peach extract, UV-B irradiated human 3D skin models were incubated in the presence or absence of the extract, followed by measurements of mRNA levels by real-time PCR, or by immunohistochemistry. RESULTS: In aged skin samples, COL18A1 mRNA levels were lower and the protein localization exhibited less intensive signal by anti-collagen type XVIII immunostaining. As observed in the skin tissues, collagen type XVIII exists at the DEJ in the 3D skin model. Fresh unripe peach extract significantly improved mRNA levels and partially localizations of collagen type XVIII, suggesting that fresh unripe peach extract ameliorates DEJ damages caused by UV-B irradiation. CONCLUSION: Collagen type XVIII and fresh unripe peach extract can be promising protective cosmetic strategies against skin aging.

    DOI: 10.1111/jocd.12841

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  • High molecular weight hyaluronan protects cartilage from degradation by inhibiting aggrecanase expression. 査読 国際誌

    Takashi Ohtsuki, Keiichi Asano, Junko Inagaki, Akira Shinaoka, Kanae Kumagishi-Shinaoka, Mehmet Z Cilek, Omer F Hatipoglu, Toshitaka Oohashi, Keiichiro Nishida, Issei Komatsubara, Satoshi Hirohata

    Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society   36 ( 12 )   3247 - 3255   2018年12月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Hyaluronan (HA) is an extracellular matrix (ECM) component of articular cartilage and has been used to treat patients with osteoarthritis (OA). A disintegrin and metalloproteinases with thrombospondin motifs (ADAMTSs) play an important role in cartilage degradation in OA. We have previously reported that ADAMTS4 and ADAMTS9 were induced by cytokine stimulation. However, the effect of HA on the cytokine-inducible ADAMTS9 has never been investigated. Moreover, it is unclear whether HA protects cartilage by suppressing aggrecan degradation. Here, we examined the effects of HA on ADAMTS expression in vitro and on cartilage degradation in vivo. ADAMTS9 expression was higher than that of the other aggrecanases (ADAMTS4 and 5) in human chondrocytes, chondrocytic cells, and rat cartilage. ADAMTS4 and 9 mRNA levels were upregulated in cytokine-stimulated chondrocytes and chondrocytic cells. Pre-incubation with HA significantly inhibited ADAMTS9 mRNA expression in cytokine-stimulated cells. In a rat OA model, Adamts5 and 9 mRNA levels were transiently increased after surgery; intra-articular HA injections attenuated the induction of Adamts5 and 9 mRNA. HA also blocked aggrecan cleavage by aggrecanase in OA rats in a molecular size-dependent manner. These results demonstrate that HA attenuates induced aggrecanases expression in OA and thereby protects articular cartilage degradation by this enzyme. Our findings provide insight into the molecular basis for the beneficial effects of HA in OA. © 2018 The Authors. Journal of Orthopaedic Research® Published by Wiley Periodicals, Inc. on behalf of Orthopaedic Research Society. J Orthop Res 36:3247-3255, 2018.

    DOI: 10.1002/jor.24126

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  • Hapln4/Bral2 is a selective regulator for formation and transmission of GABAergic synapses between Purkinje and deep cerebellar nuclei neurons. 査読 国際誌

    Midori Edamatsu, Rinako Miyano, Atsushi Fujikawa, Fuminari Fujii, Tetsuya Hori, Takeshi Sakaba, Toshitaka Oohashi

    Journal of neurochemistry   147 ( 6 )   748 - 763   2018年12月

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    担当区分:最終著者, 責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Purkinje cells (PCs) convey the sole output of the cerebellar cortex to the deep cerebellar nuclei (DCN). DCN neurons are enwrapped in densely organized extracellular matrix structures, known as perineuronal nets (PNNs). PNNs are typically found around fast-spiking GABAergic interneurons expressing parvalbumin but interestingly also exist surrounding other neurons, such as the neurons in the DCN and medial nucleus of the trapezoid body, which are the post-synaptic neurons of large axo-somatic synapses adapted for fast signaling. This characteristic localization prompted the hypothesis that PNNs might play a role in the maintenance and formation of large fast-signaling synapses. To elucidate the role of the PNN at these synapses, we investigated the electrophysiological and morphological properties of DCN synapses in hyaluronan and proteoglycan binding link protein 4 (Hapln4/Bral2) knockout (KO) mice around postnatal day (P)14. Hapln4/Bral2 is important for PNN structure, as it stabilizes the interaction between hyaluronan and proteoglycan. Here, using immunohistochemistry we show that Hapln4/Bral2 localized closely with GABAergic terminals. In DCN neurons of Hapln4/Bral2 KO mice, inhibitory synaptic strengths were reduced as compared to those in wild-type mice, whereas the properties of excitatory synapses were unaffected. The reduced IPSC amplitudes were mainly because of reduced numbers of releasable vesicles. Moreover, Hapln4/Bral2 deficiency reduced the number of PC GABAergic terminals in the DCN. These results demonstrate that Hapln4/Bral2 is a PNN component that selectively contributes to formation and transmission of PC-DCN synapses in the cerebellum. OPEN SCIENCE BADGES: This article has received a badge for *Open Materials* because it provided all relevant information to reproduce the study in the manuscript. The complete Open Science Disclosure form for this article can be found at the end of the article. More information about the Open Practices badges can be found at https://cos.io/our-services/open-science-badges/.

    DOI: 10.1111/jnc.14571

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  • Host-produced ADAMTS4 Inhibits Early-Stage Tumor Growth. 査読

    Keiichi Asano, Midori Edamatsu, Omer F Hatipoglu, Junko Inagaki, Mitsuaki Ono, Takashi Ohtsuki, Toshitaka Oohashi, Satoshi Hirohata

    Acta medica Okayama   72 ( 3 )   257 - 266   2018年6月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Several research groups demonstrated that 'a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motifs (ADAMTS)'-family proteases play roles in cancer progression. However, the origins and contributions of these proteases are not known. Here, we demonstrate an association between host-produced ADAMTS4 and early-stage tumor growth. Murine Lewis lung carcinoma (LLC) tumors showed marked expressions of Adamts4 and Adamts5. We examined the contributions and distributions of host-derived Adamts4 and Adamts5 on tumor growth, using Adamts4LacZ/LacZ and Adamts5LacZ/LacZ knockout mice. Interestingly, the Adamts4LacZ/LacZ mice showed enhanced tumor growth compared to wild-type mice at 5-, 10- and 12-days post-inoculation, whereas the Adamts5LacZ/LacZ mice did not show significant differences in tumor growth. We next examined LacZ distribution in LLC tumor-bearing Adamts4LacZ/LacZ mice by β-galactosidase (β-gal) staining. We found that the β-gal-positive signals were strictly localized at the interior areas of the tumor at 10 days post-inoculation. Multiple staining demonstrated that most of the β-gal-positive cells were localized at the tumor vasculature in Adamts4LacZ/LacZ mice. Interestingly, β-gal-positive signals were not co-localized with biglycan after 10 days post-inoculation, excluding the biglycan cleavage by host-derived ADAMTS4. Taken together, these findings illustrate that host-derived ADAMTS4 was expressed at the tumor vessels and was associated with early-stage tumor growth.

    DOI: 10.18926/AMO/56071

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  • Physiological role of urothelial cancer-associated one long noncoding RNA in human skeletogenic cell differentiation. 査読 国際誌

    Takanori Ishikawa, Takashi Nishida, Mitsuaki Ono, Takeshi Takarada, Ha Thi Nguyen, Shinnosuke Kurihara, Takayuki Furumatsu, Yurika Murase, Masaharu Takigawa, Toshitaka Oohashi, Hiroshi Kamioka, Satoshi Kubota

    Journal of cellular physiology   233 ( 6 )   4825 - 4840   2018年6月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    A vast number of long-noncoding RNAs (lncRNA) are found expressed in human cells, which RNAs have been developed along with human evolution. However, the physiological functions of these lncRNAs remain mostly unknown. In the present study, we for the first time uncovered the fact that one of such lncRNAs plays a significant role in the differentiation of chondrocytes and, possibly, of osteoblasts differentiated from mesenchymal stem cells, which cells eventually construct the human skeleton. The urothelial cancer-associated 1 (UCA1) lncRNA is known to be associated with several human malignancies. Firstly, we confirmed that UCA1 was expressed in normal human chondrocytes, as well as in a human chondrocytic cell line; whereas it was not detected in human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs). Of note, although UCA1 expression was undetectable in hBMSCs, it was markedly induced along with the differentiation toward chondrocytes, suggesting its critical role in chondrogenesis. Consistent with this finding, silencing of the UCA1 gene significantly repressed the expression of chondrogenic genes in human chondrocytic cells. UCA1 gene silencing and hyper-expression also had a significant impact on the osteoblastic phenotype in a human cell line. Finally, forced expression of UCA1 in a murine chondrocyte precursor, which did not possess a UCA1 gene, overdrove its differentiation into chondrocytes. These results indicate a physiological and important role of this lncRNA in the skeletal development of humans, who require more sustained endochondral ossification and osteogenesis than do smaller vertebrates.

    DOI: 10.1002/jcp.26285

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  • Type IV collagen α6 chain is a regulator of keratin 10 in keratinization of oral mucosal epithelium. 査読 国際誌

    Komori T, Ono M, Hara ES, Ueda J, Nguyen HTT, Nguyen HT, Yonezawa T, Maeba T, Kimura-Ono A, Takarada T, Momota R, Maekawa K, Kuboki T, Oohashi T

    Scientific reports   8 ( 1 )   2612 - 2612   2018年2月

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    担当区分:最終著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.1038/s41598-018-21000-0

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  • A deficiency of the link protein Bral2 affects the size of the extracellular space in the thalamus of aged mice. 査読 国際誌

    Michal Cicanic, Midori Edamatsu, Yoko Bekku, Ivan Vorisek, Toshitaka Oohashi, Lydia Vargova

    Journal of neuroscience research   96 ( 2 )   313 - 327   2018年2月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Bral2 is a link protein stabilizing the binding between lecticans and hyaluronan in perineuronal nets and axonal coats (ACs) in specific brain regions. Using the real-time iontophoretic method and diffusion-weighted magnetic resonance, we determined the extracellular space (ECS) volume fraction (α), tortuosity (λ), and apparent diffusion coefficient of water (ADCW ) in the thalamic ventral posteromedial nucleus (VPM) and sensorimotor cortex of young adult (3-6 months) and aged (14-20 months) Bral2-deficient (Bral2-/- ) mice and age-matched wild-type (wt) controls. The results were correlated with an analysis of extracellular matrix composition. In the cortex, no changes between wt and Bral2-/- were detected, either in the young or aged mice. In the VPM of aged but not in young Bral2-/- mice, we observed a significant decrease in α and ADCW in comparison with age-matched controls. Bral2 deficiency led to a reduction of both aggrecan- and brevican-associated perineuronal nets and a complete disruption of brevican-based ACs in young as well as aged VPM. Our data suggest that aging is a critical point that reveals the effect of Bral2 deficiency on VPM diffusion. This effect is probably mediated through the enhanced age-related damage of neurons lacking protective ACs, or the exhausting of compensatory mechanisms maintaining unchanged diffusion parameters in young Bral2-/- animals. A decreased ECS volume in aged Bral2-/- mice may influence the diffusion of neuroactive substances, and thus extrasynaptic and also indirectly synaptic transmission in this important nucleus of the somatosensory pathway.

    DOI: 10.1002/jnr.24136

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  • Stromal Versican Regulates Tumor Growth by Promoting Angiogenesis 査読

    Keiichi Asano, Courtney M. Nelson, Sumeda Nandadasa, Noriko Aramaki-Hattori, Daniel J. Lindner, Tyler Alban, Junko Inagaki, Takashi Ohtsuki, Toshitaka Oohashi, Suneel S. Apte, Satoshi Hirohata

    SCIENTIFIC REPORTS   7   2017年12月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:NATURE PUBLISHING GROUP  

    The proteoglycan versican is implicated in growth and metastases of several cancers. Here we investigated a potential contribution of stromal versican to tumor growth and angiogenesis. We initially determined versican expression by several cancer cell lines. Among these, MDA-MB231 and B16F10 had none to minimal expression in contrast to Lewis lung carcinoma (LLC). Notably, tumors arising from these cell lines had higher versican levels than the cell lines themselves suggesting a contribution from the host-derived tumor stroma. In LLC-derived tumors, both the tumor and stroma expressed versican at high levels. Thus, tumor stroma can make a significant contribution to tumor versican content. Versican localized preferentially to the vicinity of tumor vasculature and macrophages in the tumor. However, an ADAMTS protease-generated versican fragment uniquely localized to vascular endothelium. To specifically determine the impact of host/stroma-derived versican we therefore compared growth of tumors from B16F10 cells, which produced littleversican, in Vcan(hdf/+) mice and wild-type littermates. Tumors in Vcan(hdf/+) mice had reduced growth with a lower capillary density and accumulation of capillaries at the tumor periphery. These findings illustrate the variability of tumor cell line expression of versican, and demonstrate that versican is consistently contributed by the stromal tissue, where it contributes to tumor angiogenesis.

    DOI: 10.1038/s41598-017-17613-6

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  • Monoclonal Suncus Antibodies: Generation of Fusion Partners to Produce Suncus-Suncus Hybridomas. 査読

    Yoshikazu Sado, Satoko Inoue, Yasuko Tomono, Makoto Matsuyama, Masaki Fukushima, Toshitaka Oohashi, Takamichi Jogahara, Sen-Ichi Oda

    Acta histochemica et cytochemica   50 ( 2 )   71 - 84   2017年4月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    We used suncus (Suncus murinus; house musk shrew) to generate partner cells for cell fusion to produce suncus monoclonal antibodies. Suncus are insectivores that are genetically distant to rodents, and recognize antigens and epitopes that are not immunogenic in mice and rats, which are the animals most commonly used in basic life science research and from which monoclonal antibodies are usually produced. To date, monoclonal antibodies from suncus have not been generated due to the lack of a plasmacytoma fusion partner. To obtain suncus plasmacytoma cell lines suitable as a cell fusion partner, we injected suncus at both sides of the tail base with antigen emulsion, collected the lymph nodes and spleens, and cultured the cells to obtain immortalized lymphoid cell lines visually resembling mouse SP2/0-Ag14 myeloma cells. Three suncus immunized with the antigen provided 4 cell lines of suncus plasmacytoma, but they did not secrete immunoglobulins. Antibody-producing hybrid cells were generated from these cell lines using a cell fusion technique. Using one of the cell lines as a fusion partner, we obtained six lines of immunoglobulin-producing hybrid cells which secreted an unidentified monoclonal IgG. When these 6 lines were used as new fusion partners, we obtained several hybrid cell lines which secreted immunogen-specific monoclonal antibodies. These hybrid cells can be cloned and cryopreserved. We also obtained another good fusion partner which initially secreted antibody but later stopped doing so. These suncus-suncus hybrid cell lines will be useful for the production of suncus monoclonal antibodies.

    DOI: 10.1267/ahc.17007

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  • Modifications of perineuronal nets and remodelling of excitatory and inhibitory afferents during vestibular compensation in the adult mouse. 査読 国際誌

    Alessio Faralli, Federico Dagna, Andrea Albera, Yoko Bekku, Toshitaka Oohashi, Roberto Albera, Ferdinando Rossi, Daniela Carulli

    Brain structure & function   221 ( 6 )   3193 - 209   2016年7月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Perineuronal nets (PNNs) are aggregates of extracellular matrix molecules surrounding several types of neurons in the adult CNS, which contribute to stabilising neuronal connections. Interestingly, a reduction of PNN number and staining intensity has been observed in conditions associated with plasticity in the adult brain. However, it is not known whether spontaneous PNN changes are functional to plasticity and repair after injury. To address this issue, we investigated PNN expression in the vestibular nuclei of the adult mouse during vestibular compensation, namely the resolution of motor deficits resulting from a unilateral peripheral vestibular lesion. After unilateral labyrinthectomy, we found that PNN number and staining intensity were strongly attenuated in the lateral vestibular nucleus on both sides, in parallel with remodelling of excitatory and inhibitory afferents. Moreover, PNNs were completely restored when vestibular deficits of the mice were abated. Interestingly, in mice with genetically reduced PNNs, vestibular compensation was accelerated. Overall, these results strongly suggest that temporal tuning of PNN expression may be crucial for vestibular compensation.

    DOI: 10.1007/s00429-015-1095-7

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  • COL4A6 is dispensable for autosomal recessive Alport syndrome 査読

    Tomohiro Murata, Kan Katayama, Toshitaka Oohashi, Timo Jahnukainen, Tomoko Yonezawa, Yoshikazu Sado, Eiji Ishikawa, Shinsuke Nomura, Karl Tryggvason, Masaaki Ito

    SCIENTIFIC REPORTS   6   2016年7月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:NATURE PUBLISHING GROUP  

    Alport syndrome is caused by mutations in the genes encoding alpha 3, alpha 4, or alpha 5 (IV) chains. Unlike X-linked Alport mice, alpha 5 and alpha 6 (IV) chains are detected in the glomerular basement membrane of autosomal recessive Alport mice, however, the significance of this finding remains to be investigated. We therefore generated mice lacking both alpha 3 and alpha 6 (IV) chains and compared their renal function and survival with Col4a3 knockout mice of 129 x 1/Sv background. No significant difference was observed in the renal function or survival of the two groups, or when the mice were backcrossed once to C57BL/6 background. However, the survival of backcrossed double knockout mice was significantly longer than that of the mice of 129 x 1/Sv background, which suggests that other modifier genes were involved in this phenomenon. In further studies we identified two Alport patients who had a homozygous mutation in intron 46 of COL4A4. The alpha 5 and alpha 6 (IV) chains were focally detected in the glomerular basement membrane of these patients. These findings indicate that although a5 and a6 (IV) chains are induced in the glomerular basement membrane in autosomal recessive Alport syndrome, their induction does not seem to play a major compensatory role.

    DOI: 10.1038/srep29450

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  • Human collagen XV is a prominent histopathological component of sinusoidal capillarization in hepatocellular carcinogenesis. 査読

    Kouji Kimura, Masaru Nakayama, Ichiro Naito, Takaaki Komiyama, Kouichi Ichimura, Hiroaki Asano, Kazunori Tsukuda, Aiji Ohtsuka, Toshitaka Oohashi, Shinichiro Miyoshi, Yoshifumi Ninomiya

    International journal of clinical oncology   21 ( 2 )   302 - 309   2016年4月

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    担当区分:責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    BACKGROUND: Increased expression of collagen XV has been reported in hepatocellular carcinogenesis in mice. The aim of this study was to confirm the previous murine findings in human hepatocellular carcinoma (HCC) specimens, along with the histopathological distribution of collagen XV in tumoral tissues. METHODS: Sixty-three primary HCC specimens were examined. Immunostaining of collagen XV and quantitative reverse transcriptional PCR of COL15A1, which encodes collagen XV, were performed. RESULTS: Positive staining of collagen XV was observed in all tumoral regions, regardless of differentiation level or pathological type of HCC, along the sinusoid-like endothelium, whereas collagen XV was not expressed in any non-tumoral region. The intensity score of collagen XV immunostaining and the mRNA value of COL15A1 were significantly correlated. COL15A1 expression in tumors was 3.24-fold higher than in non-tumoral regions. Multivariate analysis showed that COL15A1 expression was significantly higher in the absence of hepatitis virus and moderately differentiated HCC. CONCLUSIONS: COL15A1 mRNA was up-regulated in HCC and collagen XV was expressed along the sinusoid-like endothelium of HCC but not in non-tumoral regions, which implies that collagen XV contributes to the capillarization of HCC.

    DOI: 10.1007/s10147-015-0888-2

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  • CCN4/WISP-1 positively regulates chondrogenesis by controlling TGF-β3 function. 査読 国際誌

    Yuya Yoshioka, Mitsuaki Ono, Azusa Maeda, Tina M Kilts, Emilio Satoshi Hara, Hany Khattab, Junji Ueda, Eriko Aoyama, Toshitaka Oohashi, Masaharu Takigawa, Marian F Young, Takuo Kuboki

    Bone   83   162 - 170   2016年2月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The CCN family of proteins plays important roles in development and homeostasis of bone and cartilage. To understand the role of CCN4 in chondrogenesis, human bone marrow stromal cells (hBMSCs) were transduced with CCN4 adenovirus (adCCN4) or siRNA to CCN4 (siCCN4) in the presence or absence of transforming growth factor-β3 (TGF-β3). Overexpression of CCN4 enhanced TGF-β3-induced SMAD2/3 phosphorylation and chondrogenesis of hBMSCs in an in vitro assay using a micromass culture model. On the other hand, knockdown of CCN4 inhibited the TGF-β3-induced SMAD2/3 phosphorylation and synthesis of cartilage matrix in micromass cultures of hBMSCs. Immunoprecipitation-western blot analysis revealed that CCN4 bound to TGF-β3 and regulated the ability of TGF-β3 to bind to hBMSCs. In vivo analysis confirmed there was a significant decrease in the gene expression levels of chondrocyte markers in cartilage samples from Ccn4-knock out (KO) mice, compared to those from wild type (WT) control. In order to investigate the regenerative properties of the articular cartilage in Ccn4-KO mice, articular cartilage defects were surgically performed in the knee joints of young mice, and the results showed that the cartilage was partially repaired in WT mice, but not in Ccn4-KO mice. In conclusion, these results show, for the first time, that CCN4 has a positive influence on chondrogenic differentiation by modulating the effects of TGF-β3.

    DOI: 10.1016/j.bone.2015.11.007

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  • The hyaluronan and proteoglycan link proteins: Organizers of the brain extracellular matrix and key molecules for neuronal function and plasticity. 査読 国際誌

    Toshitaka Oohashi, Midori Edamatsu, Yoko Bekku, Daniela Carulli

    Experimental neurology   274 ( Pt B )   134 - 44   2015年12月

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    担当区分:筆頭著者, 責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The hyaluronan and proteoglycanbinding link protein (Hapln) is a key molecule in the formation and control of hyaluronan-based condensed perineuronal matrix in the adult brain. This review summarizes the recent advances in understanding the role of Haplns in the formation and control of two distinct types of perineuronal matrices, one for "classical" PNN and the other for the specialized extracellular matrix (ECM) at the node of Ranvier in the central nervous system (CNS). We introduce the structural components of each ECM organization including the basic concept of supramolecular structure named "HLT model". We furthermore summarize the developmental and physiological role of perineuronal ECMs from the studies of Haplns and related molecules. Finally, we also discuss the potential mechanism modulating PNNs in the adult CNS. This layer of organized matrices may exert a direct effect via core protein or sugar moiety from the structure or by acting as a binding site for biologically active molecules, which are important for neuronal plasticity and saltatory conduction.

    DOI: 10.1016/j.expneurol.2015.09.010

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  • [Formation and roles of perineuronal extracellular matrices in the adult brain]. 査読

    Toshitaka Oohashi, Midori Edamatsu, Yoko Bekku

    Seikagaku. The Journal of Japanese Biochemical Society   87 ( 3 )   393 - 6   2015年6月

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    担当区分:筆頭著者, 責任著者   記述言語:日本語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

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  • RXR Partial Agonist Produced by Side Chain Repositioning of Alkoxy RXR Full Agonist Retains Antitype 2 Diabetes Activity without the Adverse Effects 査読

    Kohei Kawata, Ken-ichi Morishita, Mariko Nakayama, Shoya Yamada, Toshiki Kobayashi, Yuki Furusawa, Sakae Arimoto-Kobayashi, Toshitaka Oohashi, Makoto Makishima, Hirotaka Naitou, Erika Ishitsubo, Hiroaki Tokiwa, Akihiro Tai, Hiroki Kakuta

    JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY   58 ( 2 )   912 - 926   2015年1月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:AMER CHEMICAL SOC  

    We previously reported RXR partial agonist CBt-PMN (1-(3,5,5,8,8-pentamethyl-5,6,7,8-tetrahydro-2-naphthyl)-1H-benzotriazole-5-carboxylic acid: <bold>5</bold>, EC50 = 143 nM, E-max = 75%), which showed a potent glucose-lowering effect without causing serious adverse effects. However, it remains important to elucidate the structural requirements for RXR efficacy and the glucose-lowering effect because RXR-permissive heterodimers such as PPAR/RXR or LXR/RXR are reported to be activated differently depending upon the chemical structure of RXR agonists. In this work, we show that an RXR partial agonist, NEt-4IB (6-[ethyl-(4-isobutoxy-3-isopropylphenyl)amino]pyridine-3-carboxylic acid: <bold>8b</bold>, EC50 = 169 nM, E-max = 55%), can be obtained simply by repositioning the side chains (interchanging the isobutoxy and isopropoxy groups) at the hydrophobic moiety of the RXR full agonist NEt-3IB (6-[ethyl-(3-isobutoxy-4-isopropylphenyl)amino]pyridine-3-carboxylic acid: <bold>7b</bold>, EC50 = 19 nM). NEt-4IB (<bold>8b</bold>) showed antitype 2 diabetes activity without the above side effects upon repeated oral administration to mice at 10 mg/kg/day, similarly to <bold>5</bold>.

    DOI: 10.1021/jm501863r

    Web of Science

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  • Eosinophil Cationic Protein Shows Survival Effect on H9c2 Cardiac Myoblast Cells with Enhanced Phosphorylation of ERK and Akt/GSK-3β under Oxidative Stress. 査読

    Hiroko Ishii, Shigeshi Kamikawa, Satoshi Hirohata, Akifumi Mizutani, Koji Abe, Masaharu Seno, Toshitaka Oohashi, Yoshifumi Ninomiya

    Acta medica Okayama   69 ( 3 )   145 - 53   2015年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Eosinophil cationic protein (ECP) is well known as a cationic protein contained in the basic granules of activated eosinophils. Recent studies have reported that ECP exhibits novel activities on various types of cells, including rat neonatal cardiomyocytes. Here we evaluated the effects of ECP on rat cardiac myoblast H9c2 cells. Our results showed that ECP enhanced the survival of the cells, in part by promoting the ERK and Akt/GSK-3β signaling pathways. ECP attenuated the cytotoxic effects of H2O2 on H9c2 cells as well as the production of reactive oxygen species, the number of apoptotic cells and caspase 3/7 activity in the cells. In conclusion, ECP activated the ERK and Akt/GSK-3β pathways, resulting in anti-oxidative effects on H9c2 cells that attenuated apoptosis.

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  • 肝細胞癌組織におけるXV型コラーゲン発現とその意義

    木村 紘爾, 中山 勝, 小宮山 高明, 市村 浩一, 内藤 一郎, 浅野 博昭, 佃 和憲, 大塚 愛二, 大橋 俊孝, 二宮 善文

    日本結合組織学会学術大会・マトリックス研究会大会合同学術集会プログラム・抄録集   46回・61回   84 - 84   2014年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会・マトリックス研究会  

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  • Light and electron microscopic detection of inflammation-targeting liposomes encapsulating high-density colloidal gold in arthritic mice. 査読 国際誌

    Ami Maehara, Keiichiro Nishida, Masumi Furutani, Emi Matsumoto, Aiji Ohtsuka, Yoshifumi Ninomiya, Toshitaka Oohashi

    Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]   63 ( 2 )   139 - 47   2014年2月

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    担当区分:最終著者, 責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    OBJECTIVE: We have previously demonstrated the efficient and time-dependent transvascular localization of Sialyl Lewis X (SLX)-liposomes to inflammatory sites, but the final target of the SLX-liposomes remained uncertain. The aim of this study was to identify the target cells of the liposomes within the inflamed joints of collagen antibody-induced arthritis (CAIA) model mice. METHODS: SLX-liposomes and unlabeled liposomes encapsulating high-density colloidal gold were administered intravenously into the caudal vein of CAIA mice on day 5 after induction of arthritis when the inflammatory score was maximal (n = 6 per group). Six hours or 24 h after liposome administration, animals were euthanized and hind limbs and ankles were excised without perfusion. After fixation, synovial tissues were examined by light microscopy after silver enhancement of colloidal gold or by transmission electron microscopy. RESULTS: Silver-enhanced signals were detected within the cells around E-selectin-positive blood vessels in the synovium of the SLX-liposome group. These cells were positive for the macrophage/monocyte marker F4/80 or neutrophil marker Ly-6G. Transmission electron microscopy detected the colloidal gold signals together with liposome-like structures within the phagosomes of synovial macrophages. Transmission electron microscopy and energy dispersive X-ray spectrometry could determine gold elements in the lysosomes of synovial macrophages. CONCLUSIONS: The results of the current study demonstrate that SLX-liposomes primarily targeting E-selectin in activated endothelial cells could potentially deliver their contents into inflammatory cells around synovial blood vessels in arthritic joints.

    DOI: 10.1007/s00011-013-0682-4

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  • Design, synthesis, and preliminary ex vivo and in vivo evaluation of cationic magnetic resonance contrast agent for rabbit articular cartilage imaging 査読

    Takayoshi Irie, Kazuhiro Oda, Akihiko Shiino, Mitsuhiko Kubo, Shigehiro Morikawa, Noboru Urushiyama, Shuji Aonuma, Takahide Kimura, Toshiro Inubushi, Toshitaka Oohashi, Naoki Komatsu

    MedChemComm   4 ( 11 )   1508 - 1512   2013年11月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Since early-stage diagnosis of osteoarthritis (OA) is necessary to retard the progress of the disease, magnetic resonance (MR) and computed tomography (CT) imaging agents have been applied to evaluate the integrity of the extracellular matrix (ECM) in the articular cartilage (AC). Although several negatively charged contrast agents were employed, they provided indirect images of the AC based on the coulombic repulsion with anionic glycosaminoglycans (GAGs) in the ECM. To achieve direct imaging of the ECM, positively charged contrast agents have quite recently been designed for optical and CT imaging. In this paper, we report on a positively charged MR contrast agent, DOTA-Gd-G 2R8, which was applied preliminarily to ex vivo and in vivo imaging of rabbit AC. In the ex vivo imaging, the contrast agent was accumulated in the AC in high concentration due to the strong coulombic attraction between the negative charge of the GAGs and the positive charge of the octaarginine (R8). The thickness of the AC measured in the MR image was found to be comparable to that determined by the histological staining of the slice. The AC was also observed in vivo by MR imaging with the use of DOTA-Gd-G2R8. © 2013 The Royal Society of Chemistry.

    DOI: 10.1039/c3md00229b

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  • Ten-m2 is required for the generation of binocular visual circuits. 査読 国際誌

    Timothy R Young, Michael Bourke, Xiaohong Zhou, Toshitaka Oohashi, Atomu Sawatari, Reinhard Fässler, Catherine A Leamey

    The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience   33 ( 30 )   12490 - 509   2013年7月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Functional binocular vision requires that inputs arising from the two retinae are integrated and precisely organized within central visual areas. Previous studies have demonstrated an important role for one member of the Ten-m/Odz/teneurin family, Ten-m3, in the mapping of ipsilateral retinal projections. Here, we have identified a distinct role for another closely related family member, Ten-m2, in the formation of the ipsilateral projection in the mouse visual system. Ten-m2 expression was observed in the retina, dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN), superior colliculus (SC), and primary visual cortex (V1) of the developing mouse. Anterograde and retrograde tracing experiments in Ten-m2 knock-out (KO) mice revealed a specific decrease in ipsilateral retinal ganglion cells projecting to dLGN and SC. This reduction was most prominent in regions corresponding to ventral retina. No change in the topography of ipsilateral or contralateral projections was observed. While expression of a critical ipsilateral fate determinant, Zic2, appeared unaltered, a notable reduction in one of its downstream targets, EphB1, was observed in ventral retina, suggesting that Ten-m2 may interact with this molecular pathway. Immunohistochemistry for c-fos, a neural activity marker, revealed that the area of V1 driven by ipsilateral inputs was reduced in KOs, while the ratio of ipsilateral-to-contralateral responses contributing to binocular activation during visually evoked potential recordings was also diminished. Finally, a novel two-alternative swim task revealed specific deficits associated with dorsal visual field. These data demonstrate a requirement for Ten-m2 in the establishment of ipsilateral projections, and thus the generation of binocular circuits, critical for mammalian visual function.

    DOI: 10.1523/JNEUROSCI.4708-12.2013

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  • Three mechanisms assemble central nervous system nodes of Ranvier. 査読 国際誌

    Keiichiro Susuki, Kae-Jiun Chang, Daniel R Zollinger, Yanhong Liu, Yasuhiro Ogawa, Yael Eshed-Eisenbach, María T Dours-Zimmermann, Juan A Oses-Prieto, Alma L Burlingame, Constanze I Seidenbecher, Dieter R Zimmermann, Toshitaka Oohashi, Elior Peles, Matthew N Rasband

    Neuron   78 ( 3 )   469 - 82   2013年5月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Rapid action potential propagation in myelinated axons requires Na⁺ channel clustering at nodes of Ranvier. However, the mechanism of clustering at CNS nodes remains poorly understood. Here, we show that the assembly of nodes of Ranvier in the CNS involves three mechanisms: a glia-derived extracellular matrix (ECM) complex containing proteoglycans and adhesion molecules that cluster NF186, paranodal axoglial junctions that function as barriers to restrict the position of nodal proteins, and axonal cytoskeletal scaffolds (CSs) that stabilize nodal Na⁺ channels. We show that while mice with a single disrupted mechanism had mostly normal nodes, disruptions of the ECM and paranodal barrier, the ECM and CS, or the paranodal barrier and CS all lead to juvenile lethality, profound motor dysfunction, and significantly reduced Na⁺ channel clustering. Our results demonstrate that ECM, paranodal, and axonal cytoskeletal mechanisms ensure robust CNS nodal Na⁺ channel clustering.

    DOI: 10.1016/j.neuron.2013.03.005

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  • Bral2 is indispensable for the proper localization of brevican and the structural integrity of the perineuronal net in the brainstem and cerebellum. 査読 国際誌

    Yoko Bekku, Mai Saito, Markus Moser, Maki Fuchigami, Ami Maehara, Masaru Nakayama, Shozo Kusachi, Yoshifumi Ninomiya, Toshitaka Oohashi

    The Journal of comparative neurology   520 ( 8 )   1721 - 36   2012年6月

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    担当区分:最終著者, 責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Perineuronal nets (PNNs) are pericellular coats of condensed matrix that enwrap the cell bodies and dendrites of many adult central nervous system (CNS) neurons. These extracellular matrices (ECMs) play a structural role as well as instructive roles in the control of CNS plasticity and the termination of critical periods. The cartilage link protein Crtl1/Hapln1 was reported to be a trigger for the formation of PNNs in the visual cortex. Bral2/Hapln4 is another link protein that is expressed in PNNs, mainly in the brainstem and cerebellum. To assess the role of Bral2 in PNN formation, we examined the expression of PNN components in targeted mouse mutants lacking Bral2. We show here that Bral2-deficient mice have attenuated PNNs, but the overall levels of chondroitin sulfate proteoglycans, lecticans, are unchanged with the exception of neurocan. Bral2 deficiency markedly affected the localization of brevican in all of the nuclei tested, and neurocan concomitant with Crtl1 in some of the nuclei, whereas no effect was seen on aggrecan even with the attenuation of Crtl1. Bral2 may have a role in the organization of the PNN, in association with brevican, that is independent of aggrecan binding. There was a heterogenous attenuation of PNN components, including glycosaminoglycans, indicating the elaborate molecular organization of the PNN components. Strikingly, a slight decrease in the number of synapses in deep cerebellar nuclei neurons was found. Taken together, these results imply that Bral2-brevican interaction may play a key role in synaptic stabilization and the structural integrity of the PNN.

    DOI: 10.1002/cne.23009

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  • RXR Partial Agonist CBt-PMN Exerts Therapeutic Effects on Type 2 Diabetes without the Side Effects of RXR Full Agonists. 査読 国際誌

    Hiroki Kakuta, Nobumasa Yakushiji, Ryosuke Shinozaki, Fuminori Ohsawa, Shoya Yamada, Yui Ohta, Kohei Kawata, Mariko Nakayama, Manabu Hagaya, Chisa Fujiwara, Makoto Makishima, Shigeyuki Uno, Akihiro Tai, Ami Maehara, Masaru Nakayama, Toshitaka Oohashi, Hiroyuki Yasui, Yutaka Yoshikawa

    ACS medicinal chemistry letters   3 ( 5 )   427 - 32   2012年5月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:AMER CHEMICAL SOC  

    Treating insulin resistance and type 2 diabetes in rodents, currently known retinoid X receptor (RXR) agonists induce significant adverse effects. Here we introduce a novel RXR partial agonist CBt-PMN (11b), which shows a potent glucose-lowering effect and improvements of insulin secretion and glucose tolerance without the serious adverse effects caused by RXR full agonists. We suggest that RXR partial agonists may be a new class of antitype 2 diabetes drug candidates.

    DOI: 10.1021/ml300055n

    Web of Science

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  • Mechanical stretch enhances COL2A1 expression on chromatin by inducing SOX9 nuclear translocalization in inner meniscus cells. 査読 国際誌

    Tomoko Kanazawa, Takayuki Furumatsu, Motomi Hachioji, Toshitaka Oohashi, Yoshifumi Ninomiya, Toshifumi Ozaki

    Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society   30 ( 3 )   468 - 74   2012年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:WILEY-BLACKWELL  

    The meniscus plays an important role in controlling the biomechanics of the knee. However, the mechanical stress-related response in meniscus cells remains unclear. We investigated mechanical stretch-regulated gene expression in human meniscus cells. Human inner and outer meniscus cells were prepared from the inner and outer halves of the lateral meniscus. The gene expressions of Sry-type HMG box (SOX) 9 and α1(II) collagen (COL2A1) were assessed by real-time PCR analyses after cyclic tensile strain (CTS) treatment (0.5 Hz, 5% stretch). The localization and phosphorylation of SOX9 were evaluated by immunohistochemical and Western blot (WB) analyses. Chromatin immunoprecipitation (IP) analysis was performed to assess the stretch-related protein-DNA complex formation between SOX9 and the COL2A1 enhancer on chromatin. Type II collagen deposition and SOX9 production were detected only in inner menisci. CTS treatments increased expression of the COL2A1 and SOX9 genes in inner meniscus cells, but not in outer meniscus cells. In addition, CTS treatments stimulated nuclear translocalization and phosphorylation of SOX9 in inner meniscus cells. Chromatin IP analyses revealed that CTS increased the association between SOX9 and its DNA-binding site, included in the COL2A1 enhancer, on chromatin. Our results indicate that inner and outer meniscus cells have different properties in mechanical stretch-induced COL2A1 expression. In inner meniscus cells, mechanical stretch may have an essential role in the epigenetic regulation of COL2A1 expression.

    DOI: 10.1002/jor.21528

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  • [Cutting edge on research of cartilage metabolism. Recent progress in bio-molecular imaging of articular cartilage]. 査読

    Toshitaka Oohashi, Keiichiro Nishida

    Clinical calcium   21 ( 6 )   896 - 902   2011年6月

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    記述言語:日本語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    In the process of cartilage degeneration seen in osteoarthritis, loss of proteoglycan from articular cartilage has been widely accepted as a critical early event, followed by collagen degradation designated as a point of no return. Recent advance in the development of targeted molecular probes and new imaging modalities enabled the detection of qualitative and functional change of articular cartilage. In this paper, we describe the recent progress of bio-molecular imaging of articular cartilage including our fluorescent-labeled glycosaminoglycan-binding octaarginine.

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  • Clonal overgrowth of esophageal smooth muscle cells in diffuse leiomyomatosis-Alport syndrome caused by partial deletion in COL4A5 and COL4A6 genes. 査読 国際誌

    Toshitaka Oohashi, Ichiro Naito, Yasuyoshi Ueki, Tomoki Yamatsuji, Rattiya Permpoon, Noriaki Tanaka, Yoshio Naomoto, Yoshifumi Ninomiya

    Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology   30 ( 1 )   3 - 8   2011年1月

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    担当区分:筆頭著者, 責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ELSEVIER SCIENCE BV  

    This is a study of a patient who manifests all of the features of a diffuse leiomyomatosis-Alport syndrome (DL-ATS), and her two-year-old son who has already been diagnosed with Alport syndrome. Fourteen years ago, the patient underwent a partial esophageal resection followed by a replacement with jejunum. Recently, she underwent a surgical resection of the esophagus due to esophageal dysfunction. Genetic analyses of COL4A5 and COL4A6 on the X-chromosome were efficiently performed using the genomic DNA of her son. We have identified a novel deletion of 194-kb in length, encompassing COL4A5-COL4A6 promoters as well as nearly the entire large intron 1 of COL4A5 and intron 2 of COL4A6. To uncover the relationship of the esophagus-specific occurrence of the tumor and the expression of those genes, immunohistochemical analyses of type IV collagen α chains were conducted in the non-affected individuals. The esophageal smooth muscle-specific expression of α5(IV) and α6(IV) chains in the gastrointestinal tract was observed. Moreover, CAG repeat analysis of the androgen receptor gene and an immunohistochemical analysis in the leiomyoma revealed clonal overgrowth of the cells which received X-inactivation on the non-affected allele. These results may suggest that the dominant effect was caused by the partial deletion of the esophageal smooth muscle-specific genes, COL4A5 and COL4A6.

    DOI: 10.1016/j.matbio.2010.09.003

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  • Development of an active targeting liposome encapsulated with high-density colloidal gold for transmission electron microscopy. 査読

    Hideki Minematsu, Takayuki Otani, Toshitaka Oohashi, Masahiko Hirai, Kazunori Oie, Koichi Igarashi, Aiji Ohtsuka

    Journal of electron microscopy   60 ( 1 )   95 - 9   2011年

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    担当区分:責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:OXFORD UNIV PRESS  

    Active targeting of the liposome is an attractive strategy for drug delivery and in vivo bio-imaging. We previously reported the specific accumulation of Sialyl Lewis X (SLX) liposome to inflamed tissue in arthritic model mice or tumor-bearing mice. SLX-liposome encapsulation with fluorescent substances allows for the visualization of these liposomes by the time-dependent transvascular accumulation of fluorescent signals in the histological sections. In the present study, we developed a new SLX-liposome encapsulated with colloidal gold for transmission electron microscopic observation. We herein describe the characterization of the colloidal gold-loaded SLX-liposomes and demonstrate its specific targeting to the endothelial cells of tumor blood vessels in tumor-bearing mice.

    DOI: 10.1093/jmicro/dfq071

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  • Bral1: its role in diffusion barrier formation and conduction velocity in the CNS. 査読 国際誌

    Yoko Bekku, Lýdia Vargová, Yoshinobu Goto, Ivan Vorísek, Lesia Dmytrenko, Masahiro Narasaki, Aiji Ohtsuka, Reinhard Fässler, Yoshifumi Ninomiya, Eva Syková, Toshitaka Oohashi

    The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience   30 ( 8 )   3113 - 23   2010年2月

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    担当区分:最終著者, 責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:SOC NEUROSCIENCE  

    At the nodes of Ranvier, excitable axon membranes are exposed directly to the extracellular fluid. Cations are accumulated and depleted in the local extracellular nodal region during action potential propagation, but the impact of the extranodal micromilieu on signal propagation still remains unclear. Brain-specific hyaluronan-binding link protein, Bral1, colocalizes and forms complexes with negatively charged extracellular matrix (ECM) proteins, such as versican V2 and brevican, at the nodes of Ranvier in the myelinated white matter. The link protein family, including Bral1, appears to be the linchpin of these hyaluronan-bound ECM complexes. Here we report that the hyaluronan-associated ECM no longer shows a nodal pattern and that CNS nerve conduction is markedly decreased in Bral1-deficient mice even though there were no differences between wild-type and mutant mice in the clustering or transition of ion channels at the nodes or in the tissue morphology around the nodes of Ranvier. However, changes in the extracellular space diffusion parameters, measured by the real-time iontophoretic method and diffusion-weighted magnetic resonance imaging (MRI), suggest a reduction in the diffusion hindrances in the white matter of mutant mice. These findings provide a better understanding of the mechanisms underlying the accumulation of cations due to diffusion barriers around the nodes during saltatory conduction, which further implies the importance of the Bral1-based extramilieu for neuronal conductivity.

    DOI: 10.1523/JNEUROSCI.5598-09.2010

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  • Neurocan contributes to the molecular heterogeneity of the perinodal ECM. 査読

    Yoko Bekku, Toshitaka Oohashi

    Archives of histology and cytology   73 ( 2 )   95 - 102   2010年

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    担当区分:最終著者, 責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:INT SOC HISTOLOGY & CYTOLOGY  

    Neurocan is a central nervous tissue-specific chondroitin sulfate proteoglycan of the lectican family. Mainly expressed during modeling and remodeling stages of this tissue, it is thought to play an important role via binding to various extracellular matrix and cellular components. In adults, neurocan expression is associated with the perineuronal net structures. This study shows the neurocan immunolocalization at the node of Ranvier in mouse central nervous tissues. The N-terminal fragment of neurocan (Ncan130) was the predominant form detected in the optic nerve. The expression of neurocan in the white matter of brain tissue and nerve tracts revealed differential expression profiles compared with those of versican V2 and brevican, other perinodal extracellular matrix molecules. Double immunolabeling for neurocan and a nodal marker, Bral1, or a paranodal marker, caspr, demonstrated that neurocan was localized at the node of Ranvier. Neurocan expression was found at many--not all--nodal regions, and neurocan-positive nodes outnumbered brevican-positive nodes. The nodal localization of neurocan was diminished in Bral1-deficient mice. Taken together, these findings indicate that neurocan contributes to the molecular heterogeneity of the perinodal matrix, and its nodal expression is dependent on Bral1.

    DOI: 10.1679/aohc.73.95

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  • Optical imaging of mouse articular cartilage using the glycosaminoglycans binding property of fluorescent-labeled octaarginine. 査読 国際誌

    K Inagawa, T Oohashi, K Nishida, J Minaguchi, T Tsubakishita, K O Yaykasli, A Ohtsuka, T Ozaki, T Moriguchi, Y Ninomiya

    Osteoarthritis and cartilage   17 ( 9 )   1209 - 18   2009年9月

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    担当区分:責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    OBJECTIVE: The aim of the current study was to examine the cartilage-specific binding property of polyarginine peptides (R4, 8, 12, and 16) and specifically to test octaarginine peptides for the optical imaging of articular cartilage in experimentally induced arthritis in mice. METHODS: Four rhodamine-labeled polyarginine peptides each with a different-length arginine chain (R4, 8, 12, or 16) were injected into the knee joints of C57BL/6J mice (n=20). The joints were excised 1h later and the fluorescent signal intensity in cartilage cryosections was compared for the four peptides. To examine the substrate of R8 in cartilage, femoral condyles obtained from another set of mice were treated with chondroitinase ABC (Ch'ase ABC), keratanase or heparitinase then immersed in R8-rhodamine. Fluorescent signals were examined by fluorescent microscopy. Next, R8-rhodamine was injected into the right knee joints of three control and three collagen antibody-induced arthritis (CAIA) mice, and fluorescent intensity in normal and degenerative cartilage was semi-quantitatively analysed on the histological sections using image software. Finally, femoral condyles from normal mice (n=2) and CAIA mice (n=2) were immersed in R8-rhodamine and calcein, then imaged using optical projection tomography (OPT). RESULTS: Fluorescent signals were specifically detected in the cartilage pericellular matrix from the surface to the tide mark but were completely absent in the calcified layer or bone marrow. The number of arginine residues significantly influenced peptide accumulation in articular cartilage, with R8 accumulating the most. The fluorescent signal in the femoral condylar cartilage diminished when it was treated with Ch'ase ABC. R8 accumulation was significantly decreased in the degenerative cartilage of CAIA mice, and this was demonstrated both histologically and in three-dimensional (3D)-reconstruction image by OPT. CONCLUSION: R8 may be a useful new experimental probe for optical imaging of normal and arthritic articular cartilage.

    DOI: 10.1016/j.joca.2009.03.010

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  • The 3’-untranslated region of ADAMTS1 regulates its mRNA stability. 査読

    Hatipoglu OF, Hirohata S, Yaykasli KO, Cilek MZ, Demircan K, Shinohata R, Yonezawa T, Oohashi T, Kusachi S, Ninomiya Y

    Acta Medica Okayama   63 ( 2 )   79 - 85   2009年4月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.18926/AMO/31831

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  • Brevican distinctively assembles extracellular components at the large diameter nodes of Ranvier in the CNS. 査読 国際誌

    Yoko Bekku, Uwe Rauch, Yoshifumi Ninomiya, Toshitaka Oohashi

    Journal of neurochemistry   108 ( 5 )   1266 - 76   2009年3月

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    担当区分:最終著者, 責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Brevican is known to be an abundant extracellular matrix component in the adult brain and a structural constituent of perineuronal nets. We herein show that brevican, tenascin-R (TN-R) and phosphacan are present at the nodes of Ranvier on myelinated axons with a particularly large diameter in the central nervous system. A brevican deficiency resulted in a reorganization of the nodal matrices, which was characterized by the shift of TN-R, and concomitantly phosphacan, from an axonal diameter-dependent association with nodes to an axonal diameter independent association. Supported by the co-immunoprecipitation results, these observations indicate that the presence of TN-R and phosphacan at nodes is normally brevican-dependent, while in the absence of brevican these molecules can also be recruited by versican V2. The versican V2 and Bral1 distribution was not affected, thus indicating a brevican-independent role of these two molecules for establishing hyaluronan-binding matrices at the nodes. Our results revealed that brevican plays a crucial role in determining the specialization of the hyaluronan-binding nodal matrix assemblies in large diameter nodes.

    DOI: 10.1111/j.1471-4159.2009.05873.x

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  • ADAMTS9 activation by interleukin 1 beta via NFATc1 in OUMS-27 chondrosarcoma cells and in human chondrocytes. 査読 国際誌

    Kursat Oguz Yaykasli, Toshitaka Oohashi, Satoshi Hirohata, Omer Faruk Hatipoglu, Kiichi Inagawa, Kadir Demircan, Yoshifumi Ninomiya

    Molecular and cellular biochemistry   323 ( 1-2 )   69 - 79   2009年3月

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    担当区分:責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    ADAMTS9 is a member of the disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) genes, with aggrecan-degrading activity. It has also been characterized to be reactive and highly activated ADAMTS by IL-1 beta in both chondrosarcoma cells and human chondrocytes (Demircan et al. Arthritis Rheum 52:1451-1460, 2005). In order to understand the regulation of ADAMTS9 gene expression a functional 3.0 kb human ADAMTS9 promoter has been cloned and characterized. A sequence analysis of the promoter revealed the presence of putative binding sites for Nuclear Factor of Activated T cells (NFAT), which is commonly found in the ADAMTS4 and ADAMTS5 promoters. NFATc1 was up-regulated in an activated form by IL-1 beta in human chondrocytes. The IL-1 beta inducible ADAMTS9 expression was inhibited by NFAT inhibitors, FK506 and 11Arg (11R)-VIVIT. Furthermore, direct binding of NFATc1 on distal and proximal promoters of ADAMTS9 was demonstrated by a chromatin immunoprecipitation assay. Promoter-reporter assays supported those results. These findings may provide a better understanding of the regulation of ADAMTS9 expression induced by inflammatory cytokines.

    DOI: 10.1007/s11010-008-9965-4

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  • THE ION-DIFFUSION BARRIER MODEL AT THE NODE OF RANVIER: FROM THE EXTRACELLULAR ION DIFFUSION ANALYSIS IN BRAL1-DEFICIENT MICE 査読

    Yoko Bekku, Lydia Vargova, Yoshinobu Goto, Yoshifumi Ninomiya, Eva Sykova, Toshitaka Oohashi

    JOURNAL OF PHYSIOLOGICAL SCIENCES   59   292 - 292   2009年

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    記述言語:英語   出版者・発行元:SPRINGER TOKYO  

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  • Target-tropic accumulation of SLX-liposome in arthritis mouse 査読

    Minaguchi JA, Minematsu H, Oohashi T, Otani T, Inagawa K, Oie K, Nishida K, Ohtsuka A, Ninomiya Y, Igarashi K

    Matrix Biology   27   43 - 43   2008年12月

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    記述言語:英語  

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  • Transvascular accumulation of Sialyl Lewis X conjugated liposome in inflamed joints of collagen antibody-induced arthritic (CAIA) mice. 査読

    Jun Minaguchi, Toshitaka Oohashi, Kiichi Inagawa, Aiji Ohtsuka, Yoshifumi Ninomiya

    Archives of histology and cytology   71 ( 3 )   195 - 203   2008年11月

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    担当区分:責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The aim of the current study was to investigate the specific accumulation of the Sialyl Lewis X (SLX) liposome in inflammation in the collagen-antibody induced arthritic (CAIA) model mice. The SLX-liposome encapsulating fluorescent substance (Cy5.5 or Cy3) was prepared for this study. The SLX-liposome was administered intravenously via the mouse caudal vein. After 1 to 24 h, the accumulation of SLX-liposome was observed using in vivo fluorescent imaging equipment (eXplore Optix), or the knee joints were removed for histological analysis. The in vivo fluorescent imaging showed that the signal was confined to the inflammatory site in the CAIA mice in an inflammatory dependent manner. The signal intensity was stronger at 24 h than at 1 h after injection. In the histological sections, the fluorescent signals were detected in the periarticular soft-tissue, especially in the hyperplastic synovium, including a pannus invasion with inflammatory cells in the CAIA. Intense signals were observed in vessel-like structures 1 h after injection; these were co-labeled with the vascular endothelial cell marker (CD31) and E-selectin, a ligand of the SLX-liposome expressed on activated endothelial cells. The diffused signals from the vessels increased time-dependently at 6 to 24 h after injection. This is the first report to examine the exact localization of the SLXliposome by encapsulated fluorescence in hyperplastic synovial tissue of CAIA mice. These results suggest the feasibility and potential use of SLX-liposome as a vehicle for the active targeting of drug delivery to inflammatory tissue.

    DOI: 10.1679/aohc.71.195

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  • Molecular cloning and developmental expression of a hyaluronan and proteoglycan link protein gene, crtl1/hapln1, in zebrafish. 査読

    Jeong Suk Kang, Yasuhiko Kawakami, Yoko Bekku, Yoshifumi Ninomiya, Juan Carlos Izpisúa Belmonte, Toshitaka Oohashi

    Zoological science   25 ( 9 )   912 - 8   2008年9月

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    担当区分:最終著者, 責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The proteoglycan aggregate of the cartilage is composed of aggrecan, link protein (LP), and hyaluronan, providing resistance to compression in joints and cartilage structures. To further understand the function of LP during the process of chondrogenesis and bone formation in zebrafish, we cloned the zebrafish cDNA for hyaluronan and proteoglycan link protein 1 (crtl1/hapln1) and examined the expression of the gene during embryogenesis using in-situ hybridization. crtl1/hapln1 expression is first observed in the adaxial cells at the bud- stage. Throughout somitogenesis, crtl1/hapln1 is expressed in the sclerotomes, floor plate, and hypochord. In addition, crtl1/hapln1 is expressed in rhombomeres 3 and 5, pharyngeal arches, telecephalon, otic vesicles, and pectral fins. During chondrocranial/skull formation, crtl1/hapln1 expression is highest at around 4 dpf and is colocalized with aggrecan in the cartilaginous arches and with dermacan in the dermal bones.

    DOI: 10.2108/zsj.25.912

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  • Ten_m3 regulates eye-specific patterning in the mammalian visual pathway and is required for binocular vision. 査読 国際誌

    Catherine A Leamey, Sam Merlin, Paul Lattouf, Atomu Sawatari, Xiaohong Zhou, Natasha Demel, Kelly A Glendining, Toshitaka Oohashi, Mriganka Sur, Reinhard Fässler

    PLoS biology   5 ( 9 )   e241 - 2092   2007年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:PUBLIC LIBRARY SCIENCE  

    Binocular vision requires an exquisite matching of projections from each eye to form a cohesive representation of the visual world. Eye-specific inputs are anatomically segregated, but in register in the visual thalamus, and overlap within the binocular region of primary visual cortex. Here, we show that the transmembrane protein Ten_m3 regulates the alignment of ipsilateral and contralateral projections. It is expressed in a gradient in the developing visual pathway, which is consistently highest in regions that represent dorsal visual field. Mice that lack Ten_m3 show profound abnormalities in mapping of ipsilateral, but not contralateral, projections, and exhibit pronounced deficits when performing visually mediated behavioural tasks. It is likely that the functional deficits arise from the interocular mismatch, because they are reversed by acute monocular inactivation. We conclude that Ten_m3 plays a key regulatory role in the development of aligned binocular maps, which are required for normal vision.

    DOI: 10.1371/journal.pbio.0050241

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  • ADAMTS-9 is synergistically induced by interleukin-1beta and tumor necrosis factor alpha in OUMS-27 chondrosarcoma cells and in human chondrocytes. 査読 国際誌

    Kadir Demircan, Satoshi Hirohata, Keiichiro Nishida, Omer F Hatipoglu, Toshitaka Oohashi, Tomoko Yonezawa, Suneel S Apte, Yoshifumi Ninomiya

    Arthritis and rheumatism   52 ( 5 )   1451 - 60   2005年5月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:WILEY-LISS  

    OBJECTIVE: To compare induction of the aggrecanases (ADAMTS-1, ADAMTS-4, ADAMTS-5, ADAMTS-8, ADAMTS-9, and ADAMTS-15) by interleukin-1beta (IL-1beta) and tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) in chondrocyte-like OUMS-27 cells and human chondrocytes, and to determine the mechanism of induction of the most responsive aggrecanase gene. METHODS: OUMS-27 cells were stimulated for different periods of time and with various concentrations of IL-1beta and/or TNFalpha. Human chondrocytes obtained from osteoarthritic joints and human skin fibroblasts were also stimulated with IL-1beta and/or TNFalpha. Total RNA was extracted, reverse transcribed, and analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction and Northern blotting. ADAMTS-9 protein was examined by Western blotting, and the role of the MAPK signaling pathway for ADAMTS9 induction in IL-1beta-stimulated OUMS-27 cells was investigated. RESULTS: IL-1beta increased messenger RNA (mRNA) levels of ADAMTS4, ADAMTS5, and ADAMTS9 but not ADAMTS1 and ADAMTS8. The fold increase for ADAMTS9 mRNA was greater than that for mRNA of the other aggrecanase genes. The increase of ADAMTS9 mRNA by IL-1beta stimulation was greater in chondrocytes than in fibroblasts. The combination of IL-1beta and TNFalpha had a synergistic effect, resulting in a considerable elevation in the level of ADAMTS9 mRNA. ADAMTS-9 protein was also induced in IL-1beta-stimulated OUMS-27 cells. The MAPK inhibitors SB203580 and PD98059 decreased ADAMTS9 up-regulation in OUMS-27 cells. CONCLUSION: ADAMTS9 is an IL-1beta- and TNFalpha-inducible gene that appears to be more responsive to these proinflammatory cytokines than are other aggrecanase genes. Furthermore, these cytokines had a synergistic effect on ADAMTS9. Together with the known ability of ADAMTS-9 to proteolytically degrade aggrecan and its potential to cleave other cartilage molecules, the data suggest that ADAMTS-9 may have a pathologic role in arthritis.

    DOI: 10.1002/art.21010

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  • Suppression of chondrosarcoma cells by 15-deoxy-Delta 12,14-prostaglandin J2 is associated with altered expression of Bax/Bcl-xL and p21. 査読 国際誌

    Zheng-Nan Shen, Keiichiro Nishida, Hideyuki Doi, Toshitaka Oohashi, Satoshi Hirohata, Toshifumi Ozaki, Aki Yoshida, Yoshifumi Ninomiya, Hajime Inoue

    Biochemical and biophysical research communications   328 ( 2 )   375 - 82   2005年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ACADEMIC PRESS INC ELSEVIER SCIENCE  

    We previously reported that 15-deoxy-Delta(12,14)-prostaglandin J(2) (15d-PGJ(2)), the most potent agonist for peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR gamma), induces apoptosis of human chondrosarcoma cell line OUMS-27. The current study aimed to explore the mechanism of 15d-PGJ(2)-induced apoptosis and inhibition of cell proliferation in OUMS-27 cells. The preliminary results of cDNA microarray analysis showed the down-regulation of anti-apoptotic Bcl-xL and up-regulation of pro-apoptotic Bax in the process of 15d-PGJ(2)-induced apoptosis. These changes were further confirmed at mRNA and protein levels by RT-PCR and Western blot analysis, respectively. Among cyclin-dependent kinase inhibitors, p21 was induced and up-regulated by 15d-PGJ(2), but p16 and p27 were not changed, suggesting that the involvement of p21 in inhibition of cell proliferation. Activation of caspase-3 by 15d-PGJ(2) was partly, but not completely, blocked by PPAR gamma antagonist (GW9662) suggesting the 15d-PGJ(2) exerted its effect by PPAR gamma-dependent and -independent pathways. Interestingly, immunohistochemical study on human chondrosarcoma samples revealed that Bcl-xL is frequently expressed by tumor cells. The results of the current study suggest that the potential ability of 15d-PGJ(2) in regulation of cell cycle and inhibition of Bcl-xL expression might be beneficial in the development of novel pharmacological agents for chondrosarcoma.

    DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.12.186

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  • [Bral1, Bral2: the novel brain specific-hyaluronan and protoglycan link protein genes]. 査読

    Toshitaka Oohashi, Yoko Bekku, Yoshifumi Ninomiya

    Tanpakushitsu kakusan koso. Protein, nucleic acid, enzyme   49 ( 15 Suppl )   2354 - 61   2004年11月

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    担当区分:筆頭著者, 責任著者   記述言語:日本語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

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  • Dynamic induction of ADAMTS1 gene in the early phase of acute myocardial infarction. 査読 国際誌

    Keigo Nakamura, Satoshi Hirohata, Takashi Murakami, Toru Miyoshi, Kadir Demircan, Toshitaka Oohashi, Hiroko Ogawa, Kazuya Koten, Kenichi Toeda, Shozo Kusachi, Yoshifumi Ninomiya, Yasushi Shiratori

    Journal of biochemistry   136 ( 4 )   439 - 46   2004年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:JAPANESE BIOCHEMICAL SOC  

    Extracellular matrix (ECM)-degrading enzymes such as matrix metalloproteases (MMPs) play an essential role in the repair of infarcted tissue, which affects ventricular remodeling after myocardial infarction. ADAMTS1 (A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs), a newly discovered metalloprotease, was originally cloned from a cancer cell line, but little is known about its contribution to disease. To test the hypothesis that ADAMTS1 appears in infarcted myocardial tissue, we examined ADAMTS1 mRNA expression in a rat myocardial infarction model by Northern blotting, real-time RT-PCR and in situ hybridization. Normal endothelium expressed little ADAMTS1 mRNA, while normal myocardium expressed no detectable ADAMTS1 mRNA. Up-regulation of ADAMTS1 was demonstrated by Northern blot analysis and real-time RT-PCR at 3 h after coronary artery ligation. In situ hybridization revealed strong ADAMTS1 mRNA signals in the endothelium and myocardium in the infarcted heart, mainly in the infarct zone, at 3 h after myocardial infarction. The rapid and transient up-regulation of the ADAMTS1 gene in the ischemic heart was distinct from the regulatory patterns of other MMPs. Our study demonstrated that the ADAMTS1 gene is a new early immediate gene expressed in the ischemic endothelium and myocardium.

    DOI: 10.1093/jb/mvh138

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  • Lp3/Hapln3, a novel link protein that co-localizes with versican and is coordinately up-regulated by platelet-derived growth factor in arterial smooth muscle cells. 査読 国際誌

    Hiroko Ogawa, Toshitaka Oohashi, Masataka Sata, Yoko Bekku, Satoshi Hirohata, Keigo Nakamura, Tomoko Yonezawa, Shozo Kusachi, Yasushi Shiratori, Yoshifumi Ninomiya

    Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology   23 ( 5 )   287 - 98   2004年8月

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    担当区分:責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ELSEVIER SCIENCE BV  

    Link proteins (LPs) belong to the link-module superfamily, which can stabilize and enhance the binding of lecticans to hyaluronan. We report here the identification and characterization of a novel rat link protein gene (Lp3/Hapln3). The deduced protein sequence shares the typical modular elements of link proteins and has an estimated mass of 39 kDa. Examination of the rat genomic DNA sequence revealed that Lp3/Hapln3 and aggrecan genes were paired on chromosome 1q31. Another LP gene and the lectican gene were also paired at a different locus, as they are in the human and mouse genomes. Immunohistochemical analysis showed the prominent expression of Lp3/Hapln3 in the smooth muscle tissues of the vascular wall and gastrointestinal tract. Further comparative studies revealed that Lp3/Hapln3 was well co-localized with versican around the smooth muscle cells of blood vessels but not around endothelial cells. In vitro experiments using primary cultured rat arterial smooth muscle cells (ASMCs) demonstrated the coordinated up-regulation of Lp3/Hapln3 and versican by platelet-derived growth factor (PDGF). These data were supported by in vivo studies of a mechanical vascular injury model in mice. Altogether, our results suggest that Lp3/Hapln3 is involved, together with versican and hyaluronan, in the formation of the pericellular matrix of vascular smooth muscle cells.

    DOI: 10.1016/j.matbio.2004.07.001

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  • Characterization of dermacan, a novel zebrafish lectican gene, expressed in dermal bones. 査読 国際誌

    Jeong Suk Kang, Toshitaka Oohashi, Yasuhiko Kawakami, Yoko Bekku, Juan Carlos Izpisúa Belmonte, Yoshifumi Ninomiya

    Mechanisms of development   121 ( 3 )   301 - 12   2004年3月

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    担当区分:責任著者   記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ELSEVIER SCIENCE BV  

    We report here the isolation and characterization of a cDNA encoding zebrafish dermacan, a novel member of hyaluronan (HA)-binding proteoglycans, which was termed after its characteristic expression in the zebrafish dermal bones. The deduced protein sequence shares the typical modular elements of lecticans. Sequence comparison covering the C-terminal globular domain demonstrated that dermacan shows high homology with zebrafish versican but is distinct from any other identified lecticans. Genomic DNA analysis demonstrated that dermacan and versican were encoded by distinct genes in the zebrafish genome. The expression of dermacan is initiated in the sclerotome and cephalic paraxial mesoderm at 16 h postfertilization. During the pharyngular period, dermacan transcripts were detected in the sclerotome, tail fin bud, pharyngular arch primordial region, and otic vesicle. In the development of craniofacial bones, dermacan expression was detected typically in the opercle and dentary. These regions belong to the craniofacial dermal bones. aggrecan expression, in contrast, was observed in the elements of craniofacial cartilage bones. In the dermacan-morpholino-injected embryos, dermal bones, e.g. opercle, dentary, and branchiostegal rays, as well as axial skeleton in the trunk, showed decreased ossification. We conclude that dermacan is a novel lectican gene, and that zebrafish lectican genes have genetically diverged. In addition, our data suggest the involvement of dermacan in zebrafish dermal bone development.

    DOI: 10.1016/j.mod.2004.01.007

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  • Cartilage link protein interacts with neurocan, which shows hyaluronan binding characteristics different from CD44 and TSG-6. 査読 国際誌

    Uwe Rauch, Satoshi Hirakawa, Toshitaka Oohashi, Joachim Kappler, Gunnel Roos

    Matrix biology : journal of the International Society for Matrix Biology   22 ( 8 )   629 - 39   2004年2月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ELSEVIER SCIENCE BV  

    The interaction of neurocan with hyaluronan was qualitatively characterized with alkaline phosphatase fusion proteins secreted by mammalian cells. The wild type neurocan hyaluronan binding domain fused to alkaline phosphatase bound to immobilized hyaluronan under physiological as well as moderately hypertonic conditions, whereas its ability to bind to immobilized chondroitin sulfate dropped rapidly with increasing salt concentration. Strong hyaluronan binding ability was still evident when in both link modules within the hyaluronan binding domain a basic amino acid was mutated, which is well conserved among link modules of hyaluronan binding proteins. A strong enhancement of the binding of neurocan to immobilized hyaluronan was observed after preincubation of the immobilized hyaluronan with cartilage link protein. Moreover, this preincubation mediated also the binding of a fusion protein representing only the immunoglobulin module of neurocan linked to alkaline phosphatase, which showed no binding to immobilized hyaluronan alone. The interaction of the neurocan immunoglobulin module with link protein could also be shown by overlay blot analysis. These observations suggest that the hyaluronan binding characteristics of paired link modules are different from those of single link modules, and that the reported temporal co-expression of cartilage link protein and of neurocan in developing brain implicates the possibility of a cooperative function of these molecules.

    DOI: 10.1016/j.matbio.2003.11.007

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  • Molecular cloning of Bral2, a novel brain-specific link protein, and immunohistochemical colocalization with brevican in perineuronal nets. 査読 国際誌

    Yoko Bekku, Wei-Dong Su, Satoshi Hirakawa, Reinhard Fässler, Aiji Ohtsuka, Jeong Suk Kang, Jennifer Sanders, Takuro Murakami, Yoshifumi Ninomiya, Toshitaka Oohashi

    Molecular and cellular neurosciences   24 ( 1 )   148 - 59   2003年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The hyaluronan binding chondroitin sulphate proteoglycans, called lecticans, are the abundant extracellular matrix molecules in the developing and/or adult brain. The link proteins (LPs) are also known to be coordinately present in brain. We report here the molecular cloning and expression analysis of a novel member of LPs: Bral2, predominantly expressed in brain. The Bral2 mRNA expression is first detected at P20 and continued through adulthood, suggesting its functional importance and association with adult-type lecticans. The substantial immunoreactivity of Bral2 is found in several nuclei throughout the midbrain and hindbrain in a perineuronal net pattern. In situ hybridization revealed that Bral2 is synthesized by these neurons themselves, especially by the GABAergic neurons in the cerebellar cortex. Interestingly, the colocalization and synergic importance of Bral2 and brevican in the perineuronal nets is indicated by the comparative immunohistochemical analysis using wild-type and brevican-deficient mouse brain. Our results suggest that Bral2 is involved in the formation of extracellular matrix contributing to perineuronal nets and facilitate the understanding of a functional role of these extracellular matrices.

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  • Molecular cloning of a novel transmembrane protein MOLT expressed by mature oligodendrocytes. 査読 国際誌

    Hiroyuki Nomoto, Tomoko Yonezawa, Kouichi Itoh, Katsuhiko Ono, Kiyotaka Yamamoto, Toshitaka Oohashi, Fumio Shiraga, Hiroshi Ohtsuki, Yoshifumi Ninomiya

    Journal of biochemistry   134 ( 2 )   231 - 8   2003年8月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    A novel oligodendrocyte (OL)-specific cDNA was isolated from brain capillary endothelial cells and characterized. The cDNA encodes a protein of 1099 amino acids that contains a signal peptide and a transmembrane domain. The protein was expressed in mature OLs in vivo and in vitro cell cultures and was thus designated as mature OL transmembrane protein (MOLT). RT-PCR analysis showed that MOLT mRNA was expressed in brain, lung, pancreas, and testis. A polyclonal antibody raised against a part of the mouse MOLT reacted specifically with multipolar OLs possessing radially oriented processes that penetrated into the gray matter. More cells were detected in the white matter, and these had longitudinally oriented processes. In a rat OL lineage culture system, oligodendrocyte precursor cells did not initially produce MOLT mRNA and protein, but when they begun to differentiate into mature OLs, they started expressing MOLT. Consequently, MOLT may function as OLs become mature and may serve as a cell-surface marker for OL differentiation.

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  • The murine Ten-m/Odz genes show distinct but overlapping expression patterns during development and in adult brain. 査読 国際誌

    Xiao-Hong Zhou, Oliver Brandau, Kang Feng, Toshitaka Oohashi, Yoshifumi Ninomiya, Uwe Rauch, Reinhard Fässler

    Gene expression patterns : GEP   3 ( 4 )   397 - 405   2003年8月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The mouse TEN-M/ODZ proteins belong to a new family of type II transmembrane proteins with unknown function. The family consists of four members, which are expressed highly in brain and less in many other tissues. In the present study we have generated specific RNA probes and antibodies to characterize the expression of the 4 Ten-m/Odz genes in the developing and adult central nervous system (CNS) of mice. Ten-m/Odz3 and Ten-m/Odz4 mRNAs were first detectable at E7.5, Ten-m/Odz2 expression started at the 37 somite (E 10.5) stage, while Ten-m/Odz1 mRNA is not found before E15.5. In the adult mouse CNS mRNAs of the 4 Ten-m/Odzs were expressed in distinct patterns, which partially overlapped. Immunostaining and in situ hybridization localized proteins and mRNAs of Ten-m/Odzs in adjacent areas suggesting that TEN-M/ODZ proteins might be transported from the cell body along the axon or that they are shed from the cell surface and diffuse into distant regions.

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  • Vascular endothelial growth factor principally acts as the main angiogenic factor in the early stage of human osteoblastogenesis. 査読 国際誌

    Takayuki Furumatsu, Zheng Nan Shen, Akira Kawai, Keiichiro Nishida, Hironori Manabe, Toshitaka Oohashi, Hajime Inoue, Yoshifumi Ninomiya

    Journal of biochemistry   133 ( 5 )   633 - 9   2003年5月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis is essential for bone formation. However, the effect of VEGF on osteoblastic cells during osteoblastogenesis is still controversial. The aim of this study was to clarify the relationship between osteoblastic cells derived from human mesenchymal stem cells (MSCs) and VEGF in the early stage of osteoblastic differentiation. Continuous dexamethasone treatment with a low concentration stimulated osteoblastogenesis of MSCs and the expression of VEGF121 mRNA. The VEGF secretion from osteoblastic cells also increased along with osteoblastogenesis. Neuropilin-1, which mainly binds VEGF165, was detected at all stages during early osteoblastogenesis, but VEGF receptor-1 and -2 were not detected on RT-PCR analyses. In this study, VEGF had no direct effect on the proliferation of osteoblastic cells. However, the secreted VEGF in the conditioned medium of osteoblastic cells exhibited high angiogenic power as to endothelial cell proliferation. Our findings indicated that VEGF121 principally acts as the main angiogenic factor in the early stage of human osteoblastogenesis. The present study also demonstrated the differential expression of VEGF121 during osteoblastogenesis. The increase of VEGF in the early stage might be a useful marker of induction of bone formation due to human MSCs.

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  • All four members of the Ten-m/Odz family of transmembrane proteins form dimers. 査読 国際誌

    Kang Feng, Xiao-Hong Zhou, Toshitaka Oohashi, Matthias Mörgelin, Ariel Lustig, Satoshi Hirakawa, Yoshifumi Ninomiya, Jürgen Engel, Uwe Rauch, Reinhard Fässler

    The Journal of biological chemistry   277 ( 29 )   26128 - 35   2002年7月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Ten-m/Odz/teneurins are a new family of four distinct type II transmembrane molecules. Their extracellular domains are composed of an array of eight consecutive EGF modules followed by a large globular domain. Two of the eight modules contain only 5 instead of the typical 6 cysteine residues and have the capability to dimerize in a covalent, disulfide-linked fashion. The structural properties of the extracellular domains of all four mouse Ten-m proteins have been analyzed using secreted, recombinant molecules produced by mammalian HEK-293 cells. Electron microscopic analysis supported by analytical ultracentrifugation data revealed that the recombinant extracellular domains of all Ten-m proteins formed homodimers. SDS-PAGE analysis under nonreducing conditions as well as negative staining after partial denaturation of the molecules indicated that the globular COOH-terminal domains of Ten-m1 and -m4 contained subdomains with a pronounced stability against denaturing agents, especially when compared with the homologous domains of Ten-m2 and -m3. Cotransfection experiments of mammalian cells with two different extracellular domains revealed that Ten-m molecules have also the ability to form heterodimers, a property that, combined with alternative splicing events, allows the formation of a multitude of molecules with different characteristics from a limited set of genes.

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  • Human BRAL1 and BCAN genes that belong to the link-module superfamily are tandemly arranged on chromosome 1q21-23. 査読

    Hiroyuki Nomoto, Toshitaka Oohashi, Satoshi Hirakawa, Yasuyoshi Ueki, Hiroshi Ohtsuki, Yoshifumi Ninomiya

    Acta medica Okayama   56 ( 1 )   25 - 9   2002年2月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    We herein determined by fluorescence in situ hybridization the chromosomal localization of 2 human genes, BRAL1 and BCAN, both of which belong to the link-module superfamily, i.e. to the same band of chromosome 1q21-23. Further analysis of the genomic organization of BRAL1 and BCAN revealed that the BRAL1 gene was located 20-kb upstream of the BCAN start site. We isolated a polymorphic dinucleotide (CA) repeat sequence from a genomic clone containing the BCAN gene. High heterozygosity (0.79) makes this polymorphism a useful marker in the study of genetic disorders. Knowledge of the structure of the genes and the marker provides essential information for further analysis of the gene locus at chromosome 1q21-23.

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  • Bral1, a brain-specific link protein, colocalizing with the versican V2 isoform at the nodes of Ranvier in developing and adult mouse central nervous systems. 査読 国際誌

    Toshitaka Oohashi, Satoshi Hirakawa, Yoko Bekku, Uwe Rauch, Dieter R Zimmermann, Wei-Dong Su, Aiji Ohtsuka, Takuro Murakami, Yoshifumi Ninomiya

    Molecular and cellular neurosciences   19 ( 1 )   43 - 57   2002年1月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Bral1, a brain-specific hyaluronan-binding protein, has been cloned recently. To gain insight into the role of Bral1, we generated a specific antibody against this protein. We have examined the detailed localization pattern of Bral1 protein and compared it with that of other members of the lectican proteoglycan family, such as brevican and versican, with which Bral1 is predicted to interact. The immunoreactivity of Bral1 antibody was predominantly observed in myelinated fiber tracts in the adult brain and could be detected at P20 in the white matter of the developing cerebellum, suggesting that expression starts when axonal myelination takes place. Furthermore, immunostaining demonstrated that Bral1 colocalized with the versican V2 isoform at the nodes of Ranvier. The present data suggest that Bral1 may play a pivotal role in the formation of the hyaluronan-associated matrix in the CNS that facilitates neuronal conduction by forming an ion diffusion barrier at the nodes.

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  • Neurocan is dispensable for brain development. 査読 国際誌

    X H Zhou, C Brakebusch, H Matthies, T Oohashi, E Hirsch, M Moser, M Krug, C I Seidenbecher, T M Boeckers, U Rauch, R Buettner, E D Gundelfinger, R Fässler

    Molecular and cellular biology   21 ( 17 )   5970 - 8   2001年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Neurocan is a component of the extracellular matrix in brain. Due to its inhibition of neuronal adhesion and outgrowth in vitro and its expression pattern in vivo it was suggested to play an important role in axon guidance and neurite growth. To study the role of neurocan in brain development we generated neurocan-deficient mice by targeted disruption of the neurocan gene. These mice are viable and fertile and have no obvious deficits in reproduction and general performance. Brain anatomy, morphology, and ultrastructure are similar to those of wild-type mice. Perineuronal nets surrounding neurons appear largely normal. Mild deficits in synaptic plasticity may exist, as maintenance of late-phase hippocampal long-term potentiation is reduced. These data indicate that neurocan has either a redundant or a more subtle function in the development of the brain.

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  • The brain link protein-1 (BRAL1): cDNA cloning, genomic structure, and characterization as a novel link protein expressed in adult brain. 査読 国際誌

    S Hirakawa, T Oohashi, W D Su, H Yoshioka, T Murakami, J Arata, Y Ninomiya

    Biochemical and biophysical research communications   276 ( 3 )   982 - 9   2000年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    We report here molecular cloning and expression analysis of the gene for a novel human brain link protein-1 (BRAL1) which is predominantly expressed in brain. The predicted open reading frame of human brain link protein-1 encoded a polypeptide of 340 amino acids containing three protein modules, the immunoglobulin-like fold and proteoglycan tandem repeat 1 and 2 domains, with an estimated mass of 38 kDa. The brain link protein-1 mRNA was exclusively present in brain. When analyzed during mouse development, it was detected solely in the adult brain. Concomitant expression pattern of mRNAs for brain link protein-1 and various lectican proteoglycans in brain suggests a possibility that brain link protein-1 functions to stabilize the binding between hyaluronan and brevican. The human BRAL1 gene contained 7 exons and spanned approximately 6 kb. The entire immunoglobulin-like fold was encoded by a single exon and the proteoglycan tandem repeat 1 and 2 domains were encoded by a single and two exons, respectively. The deduced amino acid sequence of human brain link protein-1 exhibited 45% identity with human cartilage link protein-1 (CRTL1), previously reported as link protein to stabilize aggregates of aggrecan and hyaluronan in cartilage. These results suggest that brain link protein-1 may have distinct function from cartilage link protein-1 and play specific roles, especially in the adult brain.

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  • Differential expression of mouse alpha5(IV) and alpha6(IV) collagen genes in epithelial basement membranes. 査読 国際誌

    K Saito, I Naito, T Seki, T Oohashi, E Kimura, R Momota, Y Kishiro, Y Sado, H Yoshioka, Y Ninomiya

    Journal of biochemistry   128 ( 3 )   427 - 34   2000年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    We first completed the primary structure of the mouse alpha5(IV) and alpha6(IV) chains, from which synthetic peptides were produced and a chain-specific monoclonal antibodies were raised. Expression of collagen IV genes in various basement membranes underlying specific organ epithelia was analyzed by immunohistochemical staining using these monoclonal antibodies and other antibodies from human and bovine sequences. It was possible to predict the presence of the three collagen IV molecules: [alpha1(IV)](2) alpha2(IV), alpha3(IV)alpha4(IV)alpha5(IV), and [alpha5(IV)](2)alpha6(IV). In skin basement membrane two of the three forms, [alpha1(IV)](2)alpha2(IV) and [alpha5(IV)](2)alpha6(IV), were detected. The alpha3(IV)alpha4(IV)alpha5(IV) molecule was observed as the major form in glomerulus, alveolus, and choroid plexus, where basement membranes function as filtering units. The molecular form [alpha5(IV)](2)alpha6(IV) was present in basement membranes in tubular organs such as the epididymis, where the tubes need to expand in diameter. Thus, the distribution of the basement membranes with different molecular composition is consistent with tissue-specific function.

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  • Peri-implantation lethality in mice lacking the Sm motif-containing protein Lsm4. 査読 国際誌

    E Hirsch, T Oohashi, M Ahmad, S Stamm, R Fässler

    Molecular and cellular biology   20 ( 3 )   1055 - 62   2000年2月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) are particles present only in eukaryotic cells. They are involved in a large variety of RNA maturation processes, most notably in pre-mRNA splicing. Several of the proteins typically found in snRNPs contain a sequence signature, the Sm domain, conserved from yeast to mammals. By using a promoter trap strategy to target actively transcribed loci in murine embryonic stem cells, a new murine gene encoding an Sm motif-containing protein was identified. Database searches revealed that it is the mouse orthologue of Lsm4p, a protein found in yeast and human cells and putatively associated with U6 snRNA. Introduction of the geo reporter gene cassette under the control of the murine Lsm4 (mLsm4) endogenous promoter showed that the gene was ubiquitously transcribed in embryonic and adult tissues. The insertion of the geo cassette disrupted the mLsm4 allele, and homozygosity for the mutation led to a recessive embryonic lethal phenotype. mLsm4-null zygotes survived to the blastocyst stages, implanted into the uterus, but died shortly thereafter. The early death of mLsm4p-null mice suggests that the role of mLsm4p in splicing is essential and cannot be compensated by other Lsm proteins.

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  • The extracellular matrix in the mouse brain: its reactions to endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase and certain other enzymes. 査読

    T Murakami, A Ohtsuka, W D Su, T Taguchi, T Oohashi, T Murakami, K Abe, Y Ninomiya

    Archives of histology and cytology   62 ( 3 )   273 - 81   1999年8月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    As our previous studies have indicated, the cingulate cortex of the adult mouse brain contains many neurons with rich cell surface glycoproteins which are linked by collagenous ligands to perineuronal proteoglycans. The present study demonstrated that exclusive incubation with endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase abolished the lectin Vicia villosa or Wisteria floribunda agglutinin (VVA or WFA) labeling of the nerve cell surface glycoproteins, while it neither interfered with the cationic iron colloid or aldehyde fuchsin stainings of the perineuronal proteoglycans nor abolished the Gömöri's ammoniacal silver impregnation of the collagenous ligands. Double incubations with endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase and collagenase did not eliminate the lectin VVA or WFA labeling of the nerve cell surface glycoproteins, though they did eliminate the cationic iron colloid and aldehyde fuchsin stainings of the perineuronal proteoglycans as well as the Gömöri's ammoniacal silver impregnation of the collagenous ligands. Triple incubations with endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase, collagenase, and endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase abolished the lectin VVA or WFA labeling of the nerve cell surface glycoproteins, and also eliminated the cationic iron colloid and aldehyde fuchsin stainings of the perineuronal proteoglycans and the Gömöri's ammoniacal silver impregnation of the collagenous ligands. These findings indicate that: the nerve cell surface glycoproteins or their terminal N-acetylgalactosamines are digested by endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase; these galactosamines associated with the collagenous ligands or perineuronal proteoglycans are not digested by endo-alpha-N-acetylgalactosaminidase; and the terminal N-acetylgalactosamines newly exposed by collagenase incubation are digested by this galactosaminidase. It was further demonstrated that hyaluronidase incubation neither digests the collagenous ligands nor revives the lectin VVA or WFA labeling of the nerve cell surface proteoglycans.

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  • Mouse ten-m/Odz is a new family of dimeric type II transmembrane proteins expressed in many tissues. 査読 国際誌

    T Oohashi, X H Zhou, K Feng, B Richter, M Mörgelin, M T Perez, W D Su, R Chiquet-Ehrismann, U Rauch, R Fässler

    The Journal of cell biology   145 ( 3 )   563 - 77   1999年5月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The Drosophila gene ten-m/odz is the only pair rule gene identified to date which is not a transcription factor. In an attempt to analyze the structure and the function of ten-m/odz in mouse, we isolated four murine ten-m cDNAs which code for proteins of 2,700-2, 800 amino acids. All four proteins (Ten-m1-4) lack signal peptides at the NH2 terminus, but contain a short hydrophobic domain characteristic of transmembrane proteins, 300-400 amino acids after the NH2 terminus. About 200 amino acids COOH-terminal to this hydrophobic region are eight consecutive EGF-like domains. Cell transfection, biochemical, and electronmicroscopic studies suggest that Ten-m1 is a dimeric type II transmembrane protein. Expression of fusion proteins composed of the NH2-terminal and hydrophobic domain of ten-m1 attached to the alkaline phosphatase reporter gene resulted in membrane-associated staining of the alkaline phosphatase. Electronmicroscopic and electrophoretic analysis of a secreted form of the extracellular domain of Ten-m1 showed that Ten-m1 is a disulfide-linked dimer and that the dimerization is mediated by EGF-like modules 2 and 5 which contain an odd number of cysteines. Northern blot and immunohistochemical analyses revealed widespread expression of mouse ten-m genes, with most prominent expression in brain. All four ten-m genes can be expressed in variously spliced mRNA isoforms. The extracellular domain of Ten-m1 fused to an alkaline phosphatase reporter bound to specific regions in many tissues which were partially overlapping with the Ten-m1 immunostaining. Far Western assays and electronmicroscopy demonstrated that Ten-m1 can bind to itself.

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  • Differential tissular expression and localization of type IV collagen alpha1(IV), alpha2(IV), alpha5(IV), and alpha6(IV) chains and their mRNA in normal breast and in benign and malignant breast tumors. 査読 国際誌

    S Nakano, K Iyama, M Ogawa, H Yoshioka, Y Sado, T Oohashi, Y Ninomiya

    Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology   79 ( 3 )   281 - 92   1999年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Type IV collagen, the major component of basement membrane (BM), is composed of six genetically distinct alpha chains. We investigated the cellular regulation and origin of these alpha(IV) chains in normal and neoplastic breast tissues by immunohistochemistry by using alpha(IV) chain-specific antibodies and by in situ hybridization. In normal breast, alpha1(IV) and alpha2(IV) chains were stained in all BM, whereas alpha5(IV) and alpha6(IV) chains were restrictively localized in a linear pattern in the BM of the mammary gland. Similar immunostaining profiles were observed in benign breast tumors and in the intraductal components of invasive ductal carcinoma. However, in invasive ductal carcinoma, alpha1(IV) and alpha2(1V) chains were discontinuously or negatively stained in the cancer cell nests, and the assembly of alpha5(IV) and alpha6(IV) chains into the BM was completely inhibited. Coexpression of alpha5(IV) and alpha6(IV) chains was related to the localization of alpha-smooth muscle actin (alpha-SMA)-positive myoepithelial cells. By in situ hybridization, in fibroadenoma and invasive ductal carcinoma, the signals for alpha1(IV) and alpha2(IV) mRNA were abundant in stromal cells. However, the signals for alpha5(IV) and alpha6(IV) mRNA were not seen in any of these cells. In contrast, in intraductal papilloma, coexpression of alpha1 (IV)/alpha2(IV) mRNA and alpha5(IV)/alpha6(IV) mRNA was identified in epithelial cells. The results indicate that the mammary gland forms a second network of BM composed of alpha5(IV)/alpha6(IV) chains, in addition to the classic network of alpha1(IV)/alpha2(IV) chains. The expression of type IV collagen alpha chains seems to be differentially regulated by the epithelial-myoepithelial interaction and to be associated with the invasive potential of breast cancer.

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  • Host response to EBV infection in X-linked lymphoproliferative disease results from mutations in an SH2-domain encoding gene. 査読 国際誌

    A J Coffey, R A Brooksbank, O Brandau, T Oohashi, G R Howell, J M Bye, A P Cahn, J Durham, P Heath, P Wray, R Pavitt, J Wilkinson, M Leversha, E Huckle, C J Shaw-Smith, A Dunham, S Rhodes, V Schuster, G Porta, L Yin, P Serafini, B Sylla, M Zollo, B Franco, A Bolino, M Seri, A Lanyi, J R Davis, D Webster, A Harris, G Lenoir, G de St Basile, A Jones, B H Behloradsky, H Achatz, J Murken, R Fassler, J Sumegi, G Romeo, M Vaudin, M T Ross, A Meindl, D R Bentley

    Nature genetics   20 ( 2 )   129 - 35   1998年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    X-linked lymphoproliferative syndrome (XLP or Duncan disease) is characterized by extreme sensitivity to Epstein-Barr virus (EBV), resulting in a complex phenotype manifested by severe or fatal infectious mononucleosis, acquired hypogammaglobulinemia and malignant lymphoma. We have identified a gene, SH2D1A, that is mutated in XLP patients and encodes a novel protein composed of a single SH2 domain. SH2D1A is expressed in many tissues involved in the immune system. The identification of SH2D1A will allow the determination of its mechanism of action as a possible regulator of the EBV-induced immune response.

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  • Differential expression of type IV collagen isoforms, alpha5(IV) and alpha6(IV) chains, in basement membranes surrounding smooth muscle cells. 査読 国際誌

    T Seki, I Naito, T Oohashi, Y Sado, Y Ninomiya

    Histochemistry and cell biology   110 ( 4 )   359 - 66   1998年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Smooth muscle is composed of cigar-shaped, non-striated cells, each of which is encapsulated by a basement membrane and forms the contractile portion of tubular organs such as the gastrointestinal tract, pulmonary tract, genitourinary tract, and vasculature, in which slow and sustained contractions are needed. We examined basement membranes produced by smooth muscle cells and, using alpha(IV) chain-specific monoclonal antibodies, analyzed type IV collagens in these organs. Detailed distribution analysis of the alpha chains in normal and Alport cases by use of specific antibodies indicated that there are at least three molecular forms of type IV collagen, [alpha1(IV)]2alpha2(IV),alpha3(IV)alpha4(IV)alpha5+ ++(IV), and alpha5(IV)/alpha6(IV). Smooth muscle cells in the urinary bladder and uterus were enclosed by basement membranes composed of alpha1, alpha2, alpha5, and alpha6 chains. The same alpha chains were present around smooth muscle cells in the muscular layer of the fundus of the stomach, whereas those in the antrum and further distal side of the gastrointestinal tract expressed mostly alphal and alpha2 chains. In addition, immunostaining analysis of the vasculature also showed that most of the smooth muscle cells were positive for alpha1 and alpha2 chains; however, alpha5 and alpha6 chains were also expressed by smooth muscle cells in the aorta and some arteries where blood pressure changes significantly. These results suggest that the smooth muscle cells enclosed by alpha5/alpha6-containing basement membranes might have some particular function related to mechanical stress or tensile strength during the characteristic contractile activity of tubular organs.

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  • Differential expression of type IV collagen isoforms, alpha 5(IV) and alpha 6(IV) chains, in basement membranes surrounding smooth muscle cells 査読

    T Seki, Naito, I, T Oohashi, Y Sado, Y Ninomiya

    HISTOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY   110 ( 4 )   359 - 366   1998年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:SPRINGER VERLAG  

    Smooth muscle is composed of cigar-shaped, non-striated cells, each of which is encapsulated by a basement membrane and forms the contractile portion of tubular organs such as the gastrointestinal tract, pulmonary tract, genitourinary tract, and vasculature, in which slow and sustained contractions are needed. We examined basement membranes produced by smooth muscle cells and, using alpha(IV) chain-specific monoclonal antibodies, analyzed type IV collagens in these organs. Detailed distribution analysis of the alpha chains in normal and Alport cases by use of specific antibodies indicated that there are at least three molecular forms of type IV collagen, [alpha 1(IV)](2)alpha 2(IV), alpha 3(IV)alpha 4(IV)alpha 5(IV), and alpha 5(IV)/alpha 6(IV). Smooth muscle cells in the urinary bladder and uterus were enclosed by basement membranes composed of alpha 1, alpha 2, alpha 5, and alpha 6 chains. The same alpha chains were present around smooth muscle cells in the muscular layer of the fundus of the stomach, whereas those in the antrum and further distal side of the gastrointestinal tract expressed mostly alpha 1 and alpha 2 chains. In addition, immunostaining analysis of the vasculature also showed that most of the smooth muscle cells were positive for alpha 1 and alpha 2 chains; however, alpha 5 and alpha 6 chains were also expressed by smooth muscle cells in the aorta and some arteries where blood pressure changes significantly. These results suggest that the smooth muscle cells enclosed by alpha 5/alpha 6-containing basement membranes might have some particular function related to mechanical stress or tensile strength during the characteristic contractile activity of tubular organs.

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  • Organization and Expression of Basement Membrane Collagen IV Genes and Their Roles in Human Disorders.(共著) 査読 国際誌

    Journal of Biochemistry   123 ( 5 )   767 - 76   1998年5月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

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  • Two genes, COL4A3 and COL4A4 coding for the human alpha3(IV) and alpha4(IV) collagen chains are arranged head-to-head on chromosome 2q36. 査読 国際誌

    R Momota, M Sugimoto, T Oohashi, K Kigasawa, H Yoshioka, Y Ninomiya

    FEBS letters   424 ( 1-2 )   11 - 6   1998年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    We first isolated and characterized genomic DNA fragments that cover the 5' flanking sequences of COL4A3 and COL4A4 encoding the human basement membrane alpha3(IV) and alpha4(IV) collagen chains, respectively. Nucleotide sequence analysis indicated that the two genes are arranged head-to-head. To determine transcription start site for COL4A4 gene, we performed RACE and RNase protection assays, indicating that there are two alternative transcripts presumably derived from two different promoters. Interestingly, one transcription start site (from exon 1') of COL4A4 is only 5 bp away from the reported transcription start site of COL4A3, whereas the other transcript (from exon 1) starts 373 nucleotides downstream from the first one, generating the two kinds of transcripts that differ in the 5' UTR regions. Expression of these two transcripts appears tissue-specific; exon 1 transcript was expressed predominantly in epithelial cells, while exon 1' transcript showed rather ubiquitous and low expression. The nucleotide sequence of the promoter region is composed of dense CpG dinucleotides, GC boxes, CTC boxes and a CCAAT box but no TATA box. These results provide information to delineate the promoter activity for the tissue-specific expression of the six type IV collagen genes and basement membrane assembly in different tissues and organs.

    DOI: 10.1016/S0014-5793(98)00128-8

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  • Expression of type XVII collagen alpha 1 chain mRNA in the mouse heart. 査読

    J Kondo, S Kusachi, Y Ninomiya, H Yoshioka, T Oohashi, M Doi, T Murakami, H Moritani, H Kumashiro, T Tsuji

    Japanese heart journal   39 ( 2 )   211 - 20   1998年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The type XVII collagen alpha 1 chain has been identified as a component of the type I hemidesmosome, and is thus thought to play a role in extracellular matrix (ECM) maintenance and signal transduction between the cell and the ECM. We examined the expression of type XVII collagen alpha 1 chain mRNA in the mouse heart by Northern blot analysis and determined the sequential changes of its expression in different developmental stages of the heart using the reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Northern blotting: Total RNA was extracted from 10 adult mouse hearts by the guanidine/cesium method. Hybridization was performed with mouse cDNA for alpha 1 (XVII) collagen. RT-PCR: Total RNA was extracted from 7 embryos, 4 neonates and 8 adult mice. Reverse transcription was performed using oligo-dT primer and MMLV. Amplification was carried out in alpha 1 (XVII) collagen and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). GAPDH served as an internal control. Northern blotting revealed a 5.6 kb signal that was identical to that of the alpha 1 (XVII) of skin and transformed keratinocyte reported previously. The sequences of the PCR products were also identical to those reported. The normalized expression ratios of alpha 1 (XVII) were 0.91 +/- 0.20 in the embryonic heart, 0.36 +/- 0.20 in the neonatal heart and 0.96 +/- 0.21 in the adult heart. In conclusion, we identified the expression of type XVII collagen alpha 1 chain mRNA in the mouse heart, suggesting that the type I hemidesmosome is located in the heart. The results of the RT-PCR at different developmental stages of the heart suggest that type XVII collagen contributes not only to cardiogenesis in the embryonic stage but also to maintenance of architecture and function in the adult heart.

    DOI: 10.1536/ihj.39.211

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  • Topoisomerase I and II consensus sequences in a 17-kb deletion junction of the COL4A5 and COL4A6 genes and immunohistochemical analysis of esophageal leiomyomatosis associated with Alport syndrome. 査読 国際誌

    Y Ueki, I Naito, T Oohashi, M Sugimoto, T Seki, H Yoshioka, Y Sado, H Sato, T Sawai, F Sasaki, M Matsuoka, S Fukuda, Y Ninomiya

    American journal of human genetics   62 ( 2 )   253 - 61   1998年2月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Diffuse esophageal leiomyomatosis (DL), a benign smooth-muscle-cell tumor, is characterized by abnormal cell proliferation. DL is sometimes associated with X-linked Alport syndrome (AS), an inherited nephropathy caused by COL4A5 gene mutations. COL4A5 is tightly linked, in a head-to-head fashion, to the functionally related and coordinately regulated COL4A6 gene. No X-linked AS cases are due to COL4A6 mutations, but all DL/AS cases are always associated with deletions spanning the 5' regions of the COL4A5/COL4A6 cluster. Unlike the COL4A5 breakpoints, those of COL4A6 are clustered within intron 2 of the gene. We identified a DL/AS deletion and the first characterization of the breakpoint sequences. We show that a deletion eliminates the first coding exon of COL4A5 and the first two coding exons of COL4A6. The breakpoints share the same sequence, which, in turn, is closely homologous to the consensus sequences of topoisomerases I and II. Additional DNA evidence suggested that the male patient is a somatic mosaic for the mutation. Immunohistochemical analysis using alpha-chain-specific monoclonal antibodies supported this conclusion, since it revealed the absence of the alpha5(IV) and alpha6(IV) collagen chains in most but not all of the basement membranes of the smooth-muscle-cell tumor. We also documented a similar segmental staining pattern in the glomerular basement membranes of the patient's kidney. This study is particularly relevant to the understanding of DL pathogenesis and its etiology.

    DOI: 10.1086/301703

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  • There is temporal and spatial expression of alpha1 (IV), alpha2 (IV), alpha5 (IV), alpha6 (IV) collagen chains and beta1 integrins during the development of the basal lamina in an "in vitro" skin model. 査読 国際誌

    R Fleischmajer, K Kühn, Y Sato, E D MacDonald 2nd, J S Perlish, T C Pan, M L Chu, Y Kishiro, T Oohashi, S M Bernier, Y Yamada, Y Ninomiya

    The Journal of investigative dermatology   109 ( 4 )   527 - 33   1997年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Temporal and spatial expression of alpha1 (IV), alpha2 (IV), alpha3 (IV), alpha4 (IV), alpha5 (IV), and alpha6 (IV) collagen chains was studied during the formation of the basal lamina in an "in vitro" skin model. A sequential study was performed at 7-d and 14-d cultures (lamina densa absent) and at 28-, 36-, and 56-d cultures (lamina densa present). Expression of beta1, beta4, alpha1, alpha2, alpha3, alpha5, alpha6 integrin subunits and co-localization with collagen IV was studied by regular and laser confocal indirect immunofluorescence microscopy. mRNA expression of alpha2 (IV) and alpha6 (IV) chains was estimated by northern blots. The earliest expression of alpha1 (IV) and alpha2 (IV) collagen chains was noted in 7-d cultures restricted to basal keratinocytes. At 14-d cultures, alpha1 (IV) and alpha2 (IV) chains were noted in basal keratinocytes and as a broad band (10 microm) in the adjacent dermis. At this stage 80% of the alpha2 (IV) mRNA was expressed in the dermis and 20% in the epidermis. At 28-, 36-, and 56-d cultures the alpha1 (IV) and alpha2 (IV) chains were present in a linear distribution at the epidermo-dermal junction and in the upper dermis. The alpha6 (IV) collagen chains were expressed much later at 36-d cultures and the alpha5 (IV) at 56 d, both mostly in a linear distribution but also in the adjacent dermis. Alpha6 (IV) mRNA was demonstrated in the dermis of 36-d cultures. There was co-localization of collagen IV and beta1 integrin subunits in 14-d cultures at the matrix site of keratinocytes. Functional perturbation studies with AIIB2 monoclonal antibody (anti-beta1 subunits) and competitive inhibition with a collagen cyanogen bromide digestion derived fragment (CB3[IV]) that contains the collagen IV ligand for alpha1beta1, alpha2beta1 integrins, altered the pattern of collagen IV deposition.

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  • Differential expression of alpha 1(IV), alpha 2(IV), alpha 5(IV) and alpha 6(IV) collagen chains in the basement membrane of basal cell carcinoma. 査読 国際誌

    K Tanaka, K Iyama, M Kitaoka, Y Ninomiya, T Oohashi, Y Sado, T Ono

    The Histochemical journal   29 ( 7 )   563 - 70   1997年7月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Type IV collagen, the major component of basement membrane, consists primarily of alpha 1(IV) and alpha 2(IV) chains. Recently, other types of collagen IV chains, i.e. alpha 3(IV), alpha 4(IV), alpha 5(IV) and alpha 6(IV) chains, have been identified by protein chemistry and molecular cloning. We have examined the diversity of the assembly of alpha (IV) chains of the basement membrane surrounding tumour nests of basal cell carcinomas, in tissues from 11 patients, by immunohistochemical analysis using specific monoclonal antibodies to six alpha (IV) chain. The immunostaining profile of each chain differed with respect to the histological subtypes of basal cell carcinoma. In the morphea-like subtype, which was more invasive, alpha 1(IV) and alpha 2(IV) chains were discontinuously stained, and alpha 5(IV) and alpha 6(IV) chains were entirely absent. However, in the superficial subtype, which was non-aggressive, alpha 1(IV), alpha 2(IV), alpha 5(IV) and alpha 6(IV) chains were well stained compared with the other subtypes of basal cell carcinoma. In addition, in the solid subtype, which showed slow growth and ulceration, alpha 1(IV) and alpha 2(IV) chains were continuously stained, and alpha 5(IV) and alpha 6(IV) chains were discontinuous or absent. The assembly of alpha 5(IV) and alpha 6(IV) chains into the basement membrane was inhibited in the solid and morphea subtypes of BCC. This differential expression of type IV collagen chains seems to be associated with the invasive potential of basal cell carcinoma.

    DOI: 10.1023/A:1026428010104

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  • The primary structure of the Cl(-)-translocating ATPase, b subunit of Acetabularia acetabulum, which belongs to the F-type ATPase family. 査読 国際誌

    C Moritani, T Ohhashi, H Kadowaki, M Tagaya, T Fukui, F Lottspeich, D Oesterhelt, M Ikeda

    Archives of biochemistry and biophysics   339 ( 1 )   115 - 24   1997年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The genes possibly encoding the b subunit (50 kDa) of the Cl(-)-translocating ATPase of Acetabularia acetabulum were cloned from total RNA and from poly(A)+ RNA and sequenced. The deduced amino acid sequence of the open reading frame consisted of 478 amino acids and showed high similarity to the beta subunit of chloroplast F1-ATPase. Gene fragments encoding the putative beta subunit of chloroplast F1- (273 bp) and mitochondrial F1-ATPases (332 bp) were also cloned from A. acetabulum and sequenced, respectively. The deduced amino acid sequence of the chloroplast F1-ATPase showed 92.5% identity to be primary structure of the b subunit of the Cl(-)-translocating ATPase, while the nucleotide sequences were 79.9% identical. The deduced amino acid sequence of the latter was 77.3% identical to that of the b subunit of the Cl(-)-translocating ATPase and the nucleotide sequences were 67.5% identical. By Northern analysis, these three beta-like genes were demonstrated to be transcribed with different sizes of RNA species. A putative chloroplast F1-beta fragment also hybridized with chloroplast DNA isolated from the organism.

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  • Absence of alpha 6(IV) collagen in kidney and skin of X-linked Alport syndrome patients. 査読 国際誌

    S Hino, T Takemura, Y Sado, M Kagawa, T Oohashi, Y Ninomiya, K Yoshioka

    Pediatric nephrology (Berlin, Germany)   10 ( 6 )   742 - 4   1996年12月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    To identify the abnormalities of the type IV collagen alpha 6 chain, alpha 6(IV), in Alport syndrome, we examined renal and skin tissue using rat monoclonal antibodies against non-consensus amino acid sequences of alpha 6(IV). Immunofluorescence of normal human kidney and skin tissue revealed linear alpha 6(IV) staining in the basement membrane (BM) of Bowman's capsule, in some tubules, and also in the epidermal BM. Renal specimens from five male patients of four families with X-linked Alport syndrome showed no reactivity for alpha 6(IV) in Bowman's capsules and tubules. In these patients, alpha 1(IV) and alpha 2(IV) were normal, whereas alpha 3(IV), alpha 4(IV), and alpha 5(IV) were absent from the BMs of the kidney. In skin tissue of male patients, neither alpha 5(IV) nor alpha 6(IV) were detected. The epidermal BM of female heterozygotes with X-linked Alport syndrome showed a mosaic staining for alpha 5(IV) and alpha 6(IV). These findings indicate that, in addition to a disturbed alpha 3(IV)-alpha 4(IV)-alpha 5(IV) network, patients with X-linked Alport syndrome have abnormalities in alpha 6(IV) of the renal and epidermal BMs at the protein level.

    DOI: 10.1007/s004670050206

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  • Nephritogenicity and alpha-chain composition of NC1 fractions of type IV collagen from bovine renal basement membrane. 査読 国際誌

    S Rauf, M Kagawa, Y Kishiro, S Inoue, I Naito, T Oohashi, M Sugimoto, Y Ninomiya, Y Sado

    Virchows Archiv : an international journal of pathology   428 ( 4-5 )   281 - 8   1996年7月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Nephritogenicity (anti-GBM-nephritis-inducing activity) and alpha-chain composition of globular-do-main (NCI) fractions of type IV collagen from bovine renal, pulmonary, and placental basement membranes (BMs) was examined by injecting these fractions with adjuvant into WKY/NCrj rats and by Western blotting using epitope-defined monoclonal antibodies to the six different alpha chains of type IV collagen. A purified nephritogenic fraction from renal BM contained alpha 1-alpha 6(IV)NCI, whereas a non-nephritogenic fraction contained only alpha 1-alpha 2(IV)NCI. Renal and pulmonary NCI had strong nephritogenic activity: placental NCI had weak activity. The renal and pulmonary fractions contained alpha 1-alpha 6(IV)NCI, and the placental fraction had a large amount of alpha 1-alpha 2(IV)NCI and a very small amount of alpha 3-alpha 6(IV)NCI. Immunohistochemical study of bovine renal BM with the monoclonal antibodies revealed that bovine glomerular BM contained alpha 1-alpha 5(IV) chains, but not the alpha 6(IV) chain. The absence of alpha 6(IV) chain in glomerular BM in bovine and in humans indicates that alpha 6(IV) chain is not a target antigen of anti-GBM nephritis. Nephritogenicity is apparently a property of alpha 3-alpha 5(IV)NCI.

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  • Isolation and structure of the COL4A6 gene encoding the human alpha 6(IV) collagen chain and comparison with other type IV collagen genes. 査読 国際誌

    T Oohashi, Y Ueki, M Sugimoto, Y Ninomiya

    The Journal of biological chemistry   270 ( 45 )   26863 - 7   1995年11月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The genes COL4A5 and COL4A6, coding for the basement membrane collagen chains, alpha 5(IV) and alpha 6(IV), respectively, are located head-to-head in close proximity on human chromosome Xq22, and COL4A6 is transcribed from two alternative promoters in a tissue-specific fashion (Sugimoto M., Oohashi T., and Ninomiya Y. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11679-11683). Immunofluorescence studies using alpha chain-specific antibodies demonstrated that the two genes are expressed in a tissue-specific manner (Ninomiya, Y., Kagawa, M., Iyama, K., Naito, L., Kishiro, Y., Seyer, J. M., Sugimoto, M., Oohashi, T., and Sado, Y. (1995) J. Cell Biol. 130, 1219-1229). We report here for the first time the isolation and the structural organization of the human COL4A6 gene. The entire gene presumably exceeds 200 kilobase pairs and contains 46 exons. Exons 1' and 1 encode the two different 5'-UTRs and the two amino-terminal parts of of the signal peptide. The carboxyl part of the signal peptide and the 7 S domain are coded for by the following 6 different exons, 2-7, whereas the exons 7-42 encode the central COL 1 domain, which contains the Gly-X-Y repeats. The last three exons, 43-45, encode the carboxyl-terminal NC1 domain. Sizes of more than a half of the exons of the gene are the same as those of Col4a2 but quite different from those of COL4A5. Within the COL4A6 gene we found three CA repeat markers that can be used for allele detection. The detailed structure of the COL4A6 gene and the high heterozygosity microsatellite markers located within the gene will be useful for linkage analysis and familial diagnosis of diseases caused by mutations of this gene.

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  • ESTABLISHMENT BY THE RAT LYMPH-NODE METHOD OF EPITOPE-DEFINED MONOCLONAL-ANTIBODIES RECOGNIZING THE 6 DIFFERENT ALPHA-CHAINS OF HUMAN TYPE-IV COLLAGEN 査読

    Y SADO, M KAGAWA, Y KISHIRO, K SUGIHARA, NAITO, I, JM SEYER, M SUGIMOTO, T OOHASHI, Y NINOMIYA

    HISTOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY   104 ( 4 )   267 - 275   1995年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:SPRINGER VERLAG  

    A group of rat monoclonal antibodies recognizing the six different alpha chains of human type IV collagen have been established by our novel method. The method is designated the rat lymph node method in which enlarged medial iliac lymph nodes of a rat injected with an antigen emulsion via hind footpads are used as a source of B cells for cell fusion to produce hybridomas. The immunogens used were synthetic peptides having non-consensus amino acid sequences near the carboxyl termini of type IV collagen alpha chains. Hybridomas were screened both by ELISA with synthetic peptides and by indirect immunofluorescence with cryostat sections of human kidneys. Because the epitopes of all antibodies were determined by multipin-peptide scanning, they were confirmed to be isoform-specific. They are useful for identification of alpha chains of type IV collagen at the protein level in normal and abnormal conditions. The combined use of synthetic peptides as immunogens, the rat lymph node method as making monoclonal antibodies, and the multipin-peptide scanning as epitope mapping is found to be a strong tool for identification of peptides and proteins whose amino acid sequences are known or have been deduced.

    Web of Science

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  • Establishment by the rat lymph node method of epitope-defined monoclonal antibodies recognizing the six different alpha chains of human type IV collagen. 査読 国際誌

    Y Sado, M Kagawa, Y Kishiro, K Sugihara, I Naito, J M Seyer, M Sugimoto, T Oohashi, Y Ninomiya

    Histochemistry and cell biology   104 ( 4 )   267 - 75   1995年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    A group of rat monoclonal antibodies recognizing the six different alpha chains of human type IV collagen have been established by our novel method. The method is designated the rat lymph node method in which enlarged medial iliac lymph nodes of a rat injected with an antigen emulsion via hind footpads are used as a source of B cells for cell fusion to produce hybridomas. The immunogens used were synthetic peptides having non-consensus amino acid sequences near the carboxyl termini of type IV collagen alpha chains. Hybridomas were screened both by ELISA with synthetic peptides and by indirect immunofluorescence with cryostat sections of human kidneys. Because the epitopes of all antibodies were determined by multipin-peptide scanning, they were confirmed to be isoform-specific. They are useful for identification of alpha chains of type IV collagen at the protein level in normal and abnormal conditions. The combined use of synthetic peptides as immunogens, the rat lymph node method as making monoclonal antibodies, and the multipin-peptide scanning as epitope mapping is found to be a strong tool for identification of peptides and proteins whose amino acid sequences are known or have been deduced.

    PubMed

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  • Differential expression of two basement membrane collagen genes, COL4A6 and COL4A5, demonstrated by immunofluorescence staining using peptide-specific monoclonal antibodies. 査読 国際誌

    Y Ninomiya, M Kagawa, K Iyama, I Naito, Y Kishiro, J M Seyer, M Sugimoto, T Oohashi, Y Sado

    The Journal of cell biology   130 ( 5 )   1219 - 29   1995年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Genes for the human alpha 5(IV) and alpha 6(IV) collagen chains have a unique arrangement in that they are colocalized on chromosome Xq22 in a head-to-head fashion and appear to share a common bidirectional promoter. In addition we reported a novel observation that the COL4A6 gene is transcribed from two alternative promoters in a tissue-specific manner (Sugimoto, M., T. Oohashi, and Y. Ninomiya. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:11679-11683). To know whether the translation products of both genes are colocalized in various tissues, we raised alpha 5(IV) and alpha 6(IV) chain-specific rat monoclonal antibodies against synthetic peptides reflecting sequences near the carboxy terminus of each noncollagenous (NC)1 domain. By Western blotting alpha 6(IV) chain-specific antibody recognized 27-kD monomers and associated dimers of the human type IV collagen NC1 domain, which is the first demonstration of the presence in tissues of the alpha 6(IV) polypeptide as predicted from its cDNA sequence. Immunofluorescence studies using anti-alpha 6(IV) antibody demonstrated that in human adult kidney the alpha 6(IV) chain was never detected in the glomerular basement membrane, whereas the basement membranes of the Bowman's capsules and distal tubules were positive. The staining pattern of the glomerular basement membrane was quite different from that obtained with the anti-alpha 5(IV) peptide antibody. The alpha 5(IV) and alpha 6(IV) chains were colocalized in the basement membrane in the skin, smooth muscle cells, and adipocytes; however, little if any reaction was seen in basement membranes of cardiac muscles and hepatic sinusoidal endothelial cells. Thus, both genes are expressed in a tissue-specific manner, perhaps due to the unique function of the bidirectional promoter for both genes, which is presumably different from that for COL4A1 and COL4A2.

    DOI: 10.1083/jcb.130.5.1219

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  • The genes COL4A5 and COL4A6, coding for basement membrane collagen chains alpha 5(IV) and alpha 6(IV), are located head-to-head in close proximity on human chromosome Xq22 and COL4A6 is transcribed from two alternative promoters. 査読 国際誌

    M Sugimoto, T Oohashi, Y Ninomiya

    Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America   91 ( 24 )   11679 - 83   1994年11月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The genes for the alpha 5(IV) and alpha 6(IV) chains of human basement membrane collagen type IV have been found together on chromosome X at segment q22 and have been reported to be arranged in a head-to-head fashion. Here we report the 5' flanking sequences of COL4A5 and COL4A6 and that COL4A6 is transcribed from two alternative promoters in a tissue-specific fashion. Analysis of the sequence immediately upstream of the transcription start sites revealed some features of housekeeping genes--i.e., the lack of a TATA motif and the presence of CCAAT and CTC boxes. Further analysis revealed that COL4A6 contains two alternative promoters that control the generation of two different transcripts. One transcription start site (from exon 1') is 442 bp away from the transcription start site of COL4A5, while an alternative transcription start site (from exon 1) is located 1050 bp from the first one and drives the expression of a second transcript that encodes an alpha 6(IV) chain with a different signal peptide. Reverse transcription-PCR experiments revealed that the transcript from exon 1' is abundant in placenta, whereas the transcript from exon 1 is more frequently found in kidney and lung. These results provide additional clues to answering the general question of what mechanisms are used to generate unique basement membrane structures in different tissues.

    DOI: 10.1073/pnas.91.24.11679

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  • Purification and characterization of a membrane-bound ATPase from Acetabularia cliftonii that corresponds to a Cl(-)-translocating ATPase in Acetabularia acetabulum. 査読 国際誌

    C Moritani, T Ohhashi, S Satoh, D Oesterhelt, M Ikeda

    Bioscience, biotechnology, and biochemistry   58 ( 11 )   2087 - 9   1994年11月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    A Mg(2+)-ATPase was solubilized from membranes of Acetabularia cliftonii using nonanoyl-N-methylgluconamide and purified by ion-exchange and gel permeation chromatography. One active ATPase fraction after Mono Q chromatography had a specific activity of 10 units/mg of protein. Judged from subunit composition [54 (a), 50 (b) with a fainter band around 40 kDa], catalytic properties, and N-terminal amino acid sequence of the b subunit, the isolated enzyme was comparable to the Cl(-)-ATPase of Acetabularia acetabulum. Immunological characterization of both subunits showed significant similarity to the F type of ATPase. Cl(-)-transport activity was observed by reconstitution studies into liposomes.

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  • Identification of a new collagen IV chain, alpha 6(IV), by cDNA isolation and assignment of the gene to chromosome Xq22, which is the same locus for COL4A5. 査読 国際誌

    T Oohashi, M Sugimoto, M G Mattei, Y Ninomiya

    The Journal of biological chemistry   269 ( 10 )   7520 - 6   1994年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    To date, five distinct alpha chains have been identified in basement membrane collagen IV. We have cloned a gene encoding a new alpha chain belonging to basement membrane collagen IV by cDNA isolation under low stringency conditions. Isolation of overlapping clones and the technique of 5' rapid amplification of cDNA ends enabled us to derive the primary structure of the entire polypeptide. The deduced collagen polypeptide contained 1678 amino acid residues, including a 21-residue signal peptide, a 24-residue amino-terminal NC domain, a central 1405-residue collagenous (COL1) domain, and a 228-residue carboxyl-terminal NC1 domain. We have designated this newly found alpha chain as the alpha 6(IV) chain. The gene was mapped to chromosome Xq22 by in situ hybridization of metaphase lymphocytes. This is the same region of chromosome X where the gene coding for the alpha 5(IV) collagen chain (COL4A5) resides. Mutations in COL4A5 have been characterized in more than 50 patients with Alport syndrome. However, some of the X-linked cases of Alport syndrome are not apparently caused by COL4A5 mutations. The gene we describe in this paper therefore seems to be a candidate for mutations in this group of Alport syndrome patients.

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  • Chloroplast ATPase in Acetabularia acetabulum: purification and characterization of chloroplast F1-ATPase. 査読 国際誌

    S Satoh, C Moritani, T Ohhashi, K Konishi, M Ikeda

    Bioscience, biotechnology, and biochemistry   58 ( 3 )   521 - 5   1994年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    ATPases were isolated from chloroplasts of the unicellular marine alga Acetabularia acetabulum. Two preparations of ATPase, a chloroplast-enriched fraction and an alpha beta gamma-complex were compared. The alpha beta gamma-complex was released into an EDTA solution and purified by anion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and gel permeation chromatography. The subunit composition of this enzyme appeared to be 52-53 (alpha), 51 (beta), and 40 (gamma) kDa from SDS-PAGE. ATPase activity was enriched about 260-fold to a specific activity of approximate 4.1 U.mg protein-1. The catalytic properties of the alpha beta gamma-complex were as follows: pH optimum at 7.5; substrate specificity, ATP > ITP, GTP > UTP = CTP (Km for ATP 0.2 mM); divalent cation requirement, Mg2+ = Mn2+ = Co2+ > Zn2+ > Ni2+ > Ca2+; ATPase activity was inhibited by monovalent anions (NO3-, SCN-), while monovalent cations had neither inhibitory nor stimulatory effect. Orthovanadate had no inhibitory effect on the enzyme activity of alpha beta gamma-complex. Azide was the most effective inhibitor of the alpha beta gamma-complex. N-Terminal amino acid sequences of the alpha and beta subunits were not obtained and appeared to be blocked. The gamma subunit gave a sequence of AGLKEMKD-XIGSVXNTKKI, which showed 60% similarity to the gamma subunits of spinach and Chlamydomonas reinhardtii CF1-ATPase and EF1-ATPase.

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  • Isolation and characterization of human cDNAs and genomic DNAs encoding alpha-4(IV) and alpha-6(IV) chains reveal the presence of a distinct subclass of collagen IV genes. 査読 国際誌

    M Sugimoto, T Oohashi, M G Mattei, A Fukutomi, N Kashihara, N Matsuo, H Yoshioka, Y Ninomiya

    Contributions to nephrology   107   29 - 35   1994年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

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  • cDNA isolation and partial gene structure of the human alpha 4(IV) collagen chain. 査読 国際誌

    M Sugimoto, T Oohashi, H Yoshioka, N Matsuo, Y Ninomiya

    FEBS letters   330 ( 2 )   122 - 8   1993年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    A novel collagen IV chain, alpha 4(IV), has recently been identified in basement membranes. We describe part of the primary structure of the human alpha 4(IV) polypeptide for the first time, which has been determined by cloning and sequencing of cDNAs encoding 241 amino acid residues of the COL domain and 231 residues of the NC1 domain. We also characterized a genomic DNA fragment containing 4 exons coding for the entire NC1 domain. Among five known alpha chains of collagen IV, the alpha 4(IV) chain is distinct from the other four chains. However, it is more similar to the alpha 2(IV) chain than to the alpha 1(IV), alpha 3(IV) and alpha 5(IV) chains in terms of amino acid sequence homology, domain structure of polypeptides and exon/intron structure of the genes, suggesting the presence of two phylogenetically distinct subclasses of collagen IV alpha chains; one composed of alpha 2 and alpha 4 chains and the other of alpha 1, alpha 3 and alpha 5 chains.

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  • Improvement of reconstitution of the Cl--translocating ATPase isolated from Acetabularia acetabulum into liposomes and several anion pump characteristics 査読

    Toshitaka Ohhashi, Takashi Katsu, Mikiko Ikeda

    BBA - Biomembranes   1106 ( 1 )   165 - 170   1992年4月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The improved reconstitution of the Mono Q-III fraction, a Cl--translocating ATPase, isolated from Acetabularia acetabulum (Ikeda et al. (1990) Biochemistry 29, 2057-2065) into liposomes rendered transport properties of this enzyme clear. The liposomes were prepared by the reversed-phase method using egg lecithin and cholesterol in a molar ration of 2:1 and the purified ATPase was incorporated into the liposomes by a dialysis for 3 h. About 80% of the ATPase was incorporated into the liposomes. The weight ratio of the enzyme to lipid was 1:400-600. A sigmoid curve was obtained when the Cl--transport activity of the enzyme was plotted against Cl- concentration. Hill's plot afforded a half-subsrate concentration [S]0.5 of 45 mM and a Hill's coefficient n of 2.33. Effects of Br- and F- on the Cl--transport were also examined in the reconstituted system, both halide ions decrease the 36Cl- efflux significantly. These kinetic data are in good agreement with the electrophysiological data presented by Tittor et al. (1983) J. Membr. Biol. 75, 129-139). © 1992.

    DOI: 10.1016/0005-2736(92)90235-E

    Scopus

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  • Improvement of reconstitution of the Cl(-)-translocating ATPase isolated from Acetabularia acetabulum into liposomes and several anion pump characteristics. 査読 国際誌

    T Ohhashi, T Katsu, M Ikeda

    Biochimica et biophysica acta   1106 ( 1 )   165 - 70   1992年4月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The improved reconstitution of the Mono Q-III fraction, a Cl(-)-translocating ATPase, isolated from Acetabularia acetabulum (Ikeda et al. (1990) Biochemistry 29, 2057-2065) into liposomes rendered transport properties of this enzyme clear. The liposomes were prepared by the reversed-phase method using egg lecithin and cholesterol in a molar ratio of 2:1 and the purified ATPase was incorporated into the liposomes by a dialysis for 3 h. About 80% of the ATPase was incorporated into the liposomes. The weight ratio of the enzyme to lipid was 1:400-600. A sigmoid curve was obtained when the Cl(-)-transport activity of the enzyme was plotted against Cl- concentration. Hill's plot afforded a half-substrate concentration [S]0.5 of 45 mM and a Hill's coefficient n of 2.33. Effects of Br- and F- on the Cl(-)-transport were also examined in the reconstituted system, both halide ions decreased the 36Cl- efflux significantly. These kinetic data are in good agreement with the electrophysiological data presented by Tittor et al. ((1983) J. Membr. Biol. 75, 129-139).

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  • Preparative high-yield electroelution of proteins after separation by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis and its application to analysis of amino acid sequences and to raise antibodies. 査読 国際誌

    T Ohhashi, C Moritani, H Andoh, S Satoh, S Ohmori, F Lottspeich, M Ikeda

    Journal of chromatography   585 ( 1 )   153 - 9   1991年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    A method for the preparative high-yield electroelution of proteins from sodium dodecyl sulphate (SDS) polyacrylamide gel strips was established. The method consisted of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, detection of proteins with sodium acetate and electrophoretic elution at 200 V for 3 h by utilizing a horizontal flat-bed gel electrophoresis apparatus. Standard proteins with molecular masses of 14-66 kilodalton (cytochrome c, aldolase, ovalbumin and bovine serum albumin) were recovered with an average yield of 73.6 +/- 2.3%. A membrane-bound protein, rat skeletal muscle Ca(2+)-ATPase (100 kilodalton) was also well recovered (over 60%). This method was applicable to the purification of proteins required for N-terminal amino acid sequencing and to raise antibodies.

    DOI: 10.1016/0021-9673(91)85069-R

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  • Characterization of fibroblast-derived prolidase. The presence of two forms of prolidase. 査読 国際誌

    T Oono, H Yasutomi, T Ohhashi, H Kodama, J Arata

    Journal of dermatological science   1 ( 5 )   319 - 23   1990年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Crude enzyme solutions of prolidase were extracted from cultured human skin fibroblasts derived from control and prolidase-deficient sisters. Two forms of prolidases (prolidase-I and II) were partially purified by high performance liquid chromatography equipped with an ion exchange column. On gel filtration, the relative molecular weights of prolidase-I and II were estimated to be MW = 105,000 and 151,000, respectively. The substrate specificity of partially purified prolidase-I and II in control fibroblasts was estimated against Gly-Pro, Ala-Pro, Met-Pro. Each form of prolidase differed in its substrate specificity. In prolidase-deficient sisters, the elder with typical clinical manifestations and the younger with only slight clinical manifestations, the activity of prolidase-I was absent. However, the activity of prolidase-II was sufficiently present in both sisters. The substrate specificity of prolidase-II in the patients was similar to that of control. No difference in substrate specificity was found between these two patients.

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  • Characterization of prolidase I and II from erythrocytes of a control, a patient with prolidase deficiency and her mother. 査読 国際誌

    T Ohhashi, T Ohno, J Arata, K Sugahara, H Kodama

    Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry   187 ( 1 )   1 - 9   1990年1月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Prolidase I (EC 3.4.13.9) was purified to homogeneity from the erythrocytes of a normal human (control) and the patient's mother, and prolidase II from erythrocytes of a control and the patient's mother, and prolidase from the patient's erythrocytes was also highly purified. The various properties of the patient's prolidase were compared to those of prolidase from a control and the patient's mother. Prolidase I from a control and the patient's mother had a molecular weight of about 112,000, and was composed of two subunits with an identical molecular weight of 56,000. The Km values for Gly-Pro of the control's and the patient's mother's prolidase I were 2.90 +/- 0.22 and 2.88 +/- 0.27 mM, but the Vmax values for Gly-Pro of the mother's enzyme was reduced about 30% compared to that of control enzymes (mother: 6.02 units/mg protein, control: 22.21 units/mg protein). Isoionic points of these enzymes by chromatofocusing were pH 4.6 approximately 4.7. Prolidase II from the control and the patient's mother, and the patient's prolidase had a molecular weight of about 185,000, and was composed of two subunits with an identical molecular weight of 95,000. The Km and Vmax values for various substrates of prolidase II from a control and the patient's mother, and the patient's prolidase were almost the same.

    PubMed

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  • Characteristics and partial purification of prolidase and prolinase from leukocytes of a normal human and a patient with prolidase deficiency. 査読 国際誌

    H Kodama, T Ohhashi, C Ohba, T Ohno, J Arata, I Kubonishi, I Miyoshi

    Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry   180 ( 1 )   65 - 72   1989年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

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  • CHARACTERISTICS OF PARTIALLY PURIFIED PROLIDASE FROM ERYTHROCYTES OF NORMAL INDIVIDUALS, OF 2 PATIENTS WITH PROLIDASE DEFICIENCY, AND OF THE PATIENTS MOTHER 査読

    T OHHASHI, T OHNO, J ARATA, H KODAMA

    JOURNAL OF CLINICAL BIOCHEMISTRY AND NUTRITION   5 ( 3 )   183 - 192   1988年11月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:JOURNAL CLINICAL BIOCHEMISTRY & NUTRITION  

    Web of Science

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  • Biochemical investigations on prolidase and prolinase in erythrocytes from patients with prolidase deficiency. 査読 国際誌

    H Kodama, H Mikasa, T Ohhashi, T Ohno, J Arata

    Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry   173 ( 3 )   317 - 23   1988年4月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    PubMed

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  • Biochemical studies on prolidase in sera from control, patients with prolidase deficiency and their mother. 査読 国際誌

    T Ohhashi, T Ohno, J Arata, H Kodama

    Journal of inherited metabolic disease   11 ( 2 )   166 - 73   1988年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Prolidase activity in serum from normal subjects and the mother of two patients was readily detected without adding Mn2+ to the assay, and the activity was increased by addition of Mn2+ to the assay or preincubation with Mn2+. However, the activity in serum from patients with prolidase deficiency against gly-pro, leu-pro and val-pro could not be detected irrespective of Mn2+ conditions and activity against met-pro, ala-pro and phe-pro also showed a marked reduction compared to controls. Both normal and the patients' mother's prolidase activity against gly-pro was reduced about 20% at 60 degrees C compared to the activity at 37 degrees C, but the addition of Mn2+ at 55 degrees C increased the activity about 1.8-fold, whereas prolidase activity of patients could not be increased by the addition of Mn2+. The addition of Co2+ increased prolidase activity in serum from control and the patients' mother but did not increase the heat stability. These results indicate that prolidase in serum from patients with prolidase deficiency is altered rather than markedly reduced in amount.

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書籍等出版物

  • 細胞外マトリックス実験法

    大橋俊孝( 担当: 分担執筆 ,  範囲: プロテオグリカンの基礎知識)

    丸善出版株式会社  2021年12月 

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  • Human pathobiochemistry : from clinical studies to molecular mechanisms

    ( 範囲: 編集者(主担当))

    2019年4月  ( ISBN:9789811329760

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    総ページ数:xi, 349 p.   記述言語:英語

    CiNii Books

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  • Neural Proteoglycan

    Research Signpost,Kerala, India  2007年5月 

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  • プロテオグリカン グライコワード 査読

    大橋俊孝( 担当: 単著 ,  範囲: ヒアルロン酸プロテオグリカンリンクプロテインの役割)

    グライコフォーラム  2023年4月 

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  • 平成18〜平成19年度科学研究費補助金(基盤研究(c))研究成果報告書

    2008年 

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  • (財)中冨健康科学振興財団 第17回研究助成業績集

    (財)中冨健康科学振興財団  2006年 

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  • 平成14-15年度科学研究費補助金(基盤研究B)成果報告書

    2004年 

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  • Advancement of Life Science

    Roan AMVO Publishing Company, Taipei  2003年 

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  • 平成13-14年度科学研究費補助金(萌芽的研究)成果報告書

    2003年 

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  • 平成14年度科学研究費補助金(特定領域研究(2))成果報告書

    2003年 

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  • 平成13-14年度科学研究費補助金(基盤研究B)成果報告書

    2003年 

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  • 平成11-13年度科学研究費補助金(基盤研究B)成果報告書

    2002年 

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  • 平成12-13年度科学研究費補助金(基盤研究B)成果報告書

    2002年 

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  • 細胞外マトリックスと血管内皮細胞

    メディカルレビュー社  2002年 

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  • 平成11-13年度科学研究費補助金(基盤研究B)成果報告書

    2002年 

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  • 科学研究費補助金(基盤研究(B)展開)研究報告書

    2001年 

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  • 科学研究費補助金(萌芽)研究報告書

    2001年 

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  • Hyaluronan : structure, metabolism, biological activities, therapeutic applications

    Balazs, Endre A., Hascall, Vincent C.

    Matrix Biology Institute  ( ISBN:9780977135905

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    総ページ数:2 v.   記述言語:英語

    CiNii Books

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  • コラーゲン遺伝子の構造機能および発現調節(共著)

    新生化学実験講座 第10巻 血管内皮と平滑筋 

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MISC

  • 1細胞解析を用いた老化マウス長管骨創傷治癒遅延メカニズムの解明

    北川若奈, 大野充昭, 土佐郁恵, 石橋 啓, 窪木拓男, 大橋俊孝

    岡山歯学会抄録集   2023年12月

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    担当区分:最終著者  

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  • 単一細胞RNA-seqによるヒト軟骨細胞の分化経路全体の逆遺伝学的追跡

    Do Thuy Han, 大野充昭, Wang Ziyi, 北川若奈, 窪木拓男, 大橋俊孝, 久保田聡

    岡山歯学会抄録集   2023年12月

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  • 下垂体後葉Neurovascular unitにおけるIV型コラーゲンの解析

    米澤朋子, Tang Shaoying, 大橋俊孝

    第49回日本神経内分泌学会学術集会抄録集   2023年10月

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    担当区分:最終著者  

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  • ハンチントン病モデルマウスにおける神経ペプチド関連遺伝子群の遺伝子発現変化の解析

    宮﨑 晴子, 貫名 信行, 大橋 俊孝

    第49回 日本神経内分泌学会学術集会抄録集   2023年10月

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  • The role of link protein HAPLN4, an organizer of perineuronal net, in the synapse formation and the synaptic transmission

    89th Harden Conference, Proteoglycans: Matrix, Master Regulators

    2023年9月

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    担当区分:筆頭著者, 責任著者  

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  • 活動性食欲不振モデルマウスの脳内ペリニューロナルネットとパルブアルブミン介在ニューロンの評価

    大橋俊孝, Hoang Duy Nguyen, 宮崎晴子, 酒本真次, 髙木学

    第46回日本神経科学大会抄録集   2023年8月

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    担当区分:筆頭著者, 責任著者  

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  • 老化がBMP-2の骨誘導能に与える影響の検討

    北川 若奈, 大野 充昭, 土佐 郁恵, Dang Tuan Anh, Do Thuy Hang, 石橋 啓, 窪木 拓男, 大橋 俊孝

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   55回   156 - 156   2023年6月

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    担当区分:最終著者   記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • 長鎖型XVIII型コラーゲンは新規膜結合型コラーゲンである可能性が高い

    上野 智規, 米澤 朋子, 百田 龍輔, 佐々木 隆子, 大橋 俊孝, 水野 一乘

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   55回   147 - 147   2023年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • β3インテグリン遺伝子導入ヒト表皮角化細胞を用いた難治性潰瘍に対する新規再生医療の開発

    久保 美代子, 山本 健一, 木下 理恵, 米澤 朋子, 大橋 俊孝, 阪口 政清

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   55回   134 - 134   2023年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • 1細胞解析を応用した加齢変化が骨髄ニッチ関連細胞へ及ぼす影響の解明

    石橋 啓, 大野 充昭, 土佐 郁恵, Dang Tuan Anh, 北川 若奈, Do Thuy Hang, 窪木 拓男, 大橋 俊孝

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   55回   60 - 60   2023年6月

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    担当区分:最終著者   記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • 発達期および成熟期におけるHapln4欠損マウスCalyx-MNTBシナプス周囲のグリア細胞の分布に関する研究

    北見 智, 谷 祐一, 野島 弘二郎, 兼城 一媛乃, Nguyen Duy Hoang, 宮崎 晴子, 堀 哲也, 大橋 俊孝

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   55回   150 - 150   2023年6月

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    担当区分:最終著者, 責任著者   記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • 活動性食欲不振モデルマウスの脳内神経周囲ネットとパルバルブミン介在ニューロンの評価

    第48回 岡山脳研究セミナー プログラム・抄録集   2023年2月

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    担当区分:最終著者, 責任著者  

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  • シングルセルRNA-seqデータ再解析によるヒト角化・非角化歯肉比較解析

    DO THUY Hang, DO THUY Hang, 大野光昭, 大野光昭, 小盛大志, 小盛大志, 北川若奈, 北川若奈, 窪木拓男, 窪木拓男, 大橋俊孝

    日本補綴歯科学会誌(Web)   15   2023年

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  • 1細胞解析を応用した骨髄老化によるマウス長管骨創傷治癒遅延メカニズムの解明

    北川若奈, 北川若奈, 大野充昭, 大野充昭, 土佐郁恵, 石橋啓, 石橋啓, 窪木拓男, 窪木拓男, 大橋俊孝

    日本補綴歯科学会誌(Web)   15   2023年

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  • Potential impact of perineuronal net on the pathogenesis of Schizophrenia.

    Toshitaka Oohashi

    In Commemoration of the 30th Anniversary of Mizutani Foundation for Glycoscience   71 - 73   2022年11月

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    担当区分:筆頭著者, 責任著者  

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  • Roles of basement membrane in oral mucosal keratinization 招待

    Toshitaka Oohashi

    2022 Korea-Japan Joint Symposium on Matrix Biology   14 - 14   2022年10月

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    担当区分:筆頭著者, 責任著者  

    researchmap

  • 加齢が骨髄ニッチ関連細胞および類洞基底膜に与える影響

    石橋啓, 大野 充昭, 土佐 郁恵, 北川若奈, 秋山謙太郎, 窪木 拓男, 大橋 俊孝

    日本補綴歯科学会第131回学術大会抄録集   14 ( 特別号 )   148 - 148   2022年7月

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    担当区分:最終著者   記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • ペリニューロナルネットリンクプロテインHapln4欠損マウスにおいてグリア細胞が発達期calyx-MNTBシナプス形成に与える影響 査読

    大橋 俊孝, 谷祐一, 宮﨑晴子, 野島弘二郎, 兼城一媛乃, 堀 哲也

    Neuro2022 抄録集   65th   2022年7月

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    担当区分:筆頭著者, 責任著者  

    J-GLOBAL

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  • BMP-2は造血機能を有した骨・骨髄組織を誘導する

    北川 若奈, 大野 充昭, 土佐 郁恵, 石橋 啓, 大橋 俊孝, 窪木 拓男

    日本補綴歯科学会誌   14 ( 特別号 )   176 - 176   2022年7月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • XVIII型コラーゲン欠損マウスの肝臓で起こると思われる代謝機構の変化 査読

    百田龍輔, 米澤朋子, 柳井広之, 大橋俊孝

    第54回日本結合組織学会学術大会抄録集   54th (Web)   89 - 89   2022年6月

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    担当区分:最終著者  

    J-GLOBAL

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  • XVIII型コラーゲン欠損マウスにおける皮膚創傷治癒の解析 査読

    米澤朋子, 前川明日華, 前場崇宏, 百田龍輔, 渋谷千晶, 岩田宗一郎, 大野充昭, 大橋俊孝

    120 - 120   2022年6月

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    担当区分:最終著者  

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  • Hapln4欠損マウスにおけるCayx-MNTBシナプスの発達に及ぼすグリア細胞 査読

    宮﨑晴子, 谷祐一, 野島弘二郎, 兼城一媛乃, Nguyen Duy Hoang, 堀哲也, 大橋俊孝

    第54回日本結合組織学会学術大会抄録集   115 - 115   2022年6月

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    担当区分:最終著者, 責任著者  

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  • BMP-2は造血機能を有した骨・骨髄組織を誘導する

    北川若奈, 北川若奈, 大野充昭, 大野充昭, 土佐郁恵, 石橋啓, 石橋啓, 大橋俊孝, 窪木拓男, 窪木拓男

    日本補綴歯科学会誌(Web)   14   2022年

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  • 加齢が骨髄ニッチ関連細胞および類洞基底膜に与える影響

    石橋啓, 石橋啓, 大野充昭, 大野充昭, 土佐郁恵, 北川若奈, 北川若奈, 秋山謙太郎, 窪木拓男, 窪木拓男, 大橋俊孝

    日本補綴歯科学会誌(Web)   14   2022年

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  • MRONJ様病変誘発モデルマウスの抜歯窩へのE-rhBMP-2含有骨補填材移植が抜歯窩周囲の骨壊死を抑制する

    田仲 由希恵, 三海 晃弘, 大野 充昭, 土佐 郁恵, 納所 秋二, 大野 彩, 窪木 拓男, 大橋 俊孝

    日本口腔インプラント学会誌   34 ( 特別号 )   ポスター - 4   2021年12月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本口腔インプラント学会  

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  • rhBMP-2、rhFGF-2の骨形成能は移植部位に存在する骨髄組織の影響を受ける

    納所 秋二, 大野 充昭, 土佐 郁恵, 石橋 啓, 田仲 由希恵, 大野 彩, 大橋 俊孝, 窪木 拓男

    日本口腔インプラント学会誌   34 ( 特別号 )   優秀 - 3   2021年12月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本口腔インプラント学会  

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  • Cysltr1遺伝子変異は破骨細胞分化と炎症性骨破壊に影響しない

    藤田 洋史, 土生田 宗憲, 大野 充昭, 大橋 俊孝, 服部 高子, 久保田 聡, 大内 淑代

    第94回日本生化学会大会, 横浜(Web開催)[P-925]   94th   [P - 925]   2021年11月

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    記述言語:日本語   掲載種別:研究発表ペーパー・要旨(全国大会,その他学術会議)   出版者・発行元:(公社)日本生化学会  

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  • 骨髄細胞がBMP-2、FGF-2の骨形成能に与える影響の検討

    納所 秋二, 大野 充昭, 土佐 郁恵, 石橋 啓, 三海 晃弘, 田仲 由希恵, 大野 彩, 小盛 大志, 前川 賢治, 大橋 俊孝, 窪木 拓男

    日本補綴歯科学会誌   13 ( 特別号 )   200 - 200   2021年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • 薬剤関連顎骨壊死様モデルマウスにおけるE-rhBMP-2の治療効果の検討

    三海 晃弘, 大野 充昭, 土佐 郁恵, 納所 秋二, 大野 彩, 縄稚 久美子, 田仲 由希恵, 大橋 俊孝, 窪木 拓男

    日本補綴歯科学会誌   13 ( 特別号 )   114 - 114   2021年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • 薬剤関連顎骨壊死様モデルマウスにおけるE-rhBMP-2の治療効果の検討

    三海 晃弘, 大野 充昭, 土佐 郁恵, 納所 秋二, 大野 彩, 縄稚 久美子, 田仲 由希恵, 大橋 俊孝, 窪木 拓男

    日本補綴歯科学会誌   13 ( 特別号 )   114 - 114   2021年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • アグリカン欠損は成長板軟骨細胞のアポトーシスを誘導する 査読

    大橋俊孝, 塚野萌美, 古谷満寿美, 大野充昭

    第33回日本軟骨代謝学会抄録集   107 - 107   2021年3月

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    担当区分:筆頭著者, 責任著者  

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  • コラーゲン研究の新展開:基礎から創薬まで マウス皮膚創傷モデルにおけるXVIII型コラーゲンの解析

    米澤 朋子, 前場 崇宏, Tang Shaoying, 大野 充昭, 百田 龍輔, 稲川 喜一, 大橋 俊孝

    日本生化学会大会プログラム・講演要旨集   93回   [1S08e - 06]   2020年9月

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    担当区分:最終著者   記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本生化学会  

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  • 口腔粘膜上皮の角化制御に関わる基底膜分子の同定

    Ha Nguyen, 大野 充昭, 小盛 大志, 大野 彩, 前川 賢治, 窪木 拓男, 大橋 俊孝

    日本口腔インプラント学会誌   33 ( 特別号 )   135 - 135   2020年9月

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    担当区分:最終著者   記述言語:英語   出版者・発行元:(公社)日本口腔インプラント学会  

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  • 骨髄存在・非存在下にてrhBMP-2、rhFGF-2が骨形成に与える影響の検討

    納所 秋二, 大野 充昭, 土佐 郁恵, 三海 晃弘, 石橋 啓, 大野 彩, 窪木 拓男, 大橋 俊孝

    日本補綴歯科学会誌   12 ( 特別号 )   215 - 215   2020年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • 要介護高齢者の腸内細菌叢とボディマス指数の関係 介護老人保健施設における横断研究

    大森 江, 大野 充昭, 大野 彩, 水口 真実, 小山 絵理, 徳本 佳奈, 山本 道代, 大橋 俊孝, 窪木 拓男

    日本補綴歯科学会誌   12 ( 特別号 )   225 - 225   2020年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • XVIII型コラーゲン欠損が骨髄造血幹細胞に与える影響

    石橋 啓, 大野 充昭, 土佐 郁恵, 納所 秋二, 窪木 拓男, 大橋 俊孝

    日本補綴歯科学会誌   12 ( 特別号 )   224 - 224   2020年6月

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    担当区分:最終著者   記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • 骨髄存在・非存在下にてrhBMP-2,rhFGF-2が骨形成に与える影響の検討

    納所秋二, 納所秋二, 大野充昭, 土佐郁恵, 三海晃弘, 三海晃弘, 石橋啓, 石橋啓, 大野彩, 大野彩, 窪木拓男, 大橋俊孝

    日本補綴歯科学会誌(Web)   12   2020年

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  • Postnatal Runx2 deletion causes age-related changes in bone.

    Ikue Tosa, Daisuke Yamada, Shunpei Tsukamoto, Kenji Kawabe, Takeshi Takarada, Mitsuaki Ono, Toshitaka Oohashi, Takuo Kuboki

    JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH   34   219 - 219   2019年12月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究発表ペーパー・要旨(国際会議)   出版者・発行元:WILEY  

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  • DNMTによる軟骨細胞分化制御メカニズムの解明

    野村 優, 吉岡 裕也, Nguyen Ha Thi, 納所 秋二, 小盛 大志, 大橋 俊孝, 大野 充昭, 窪木 拓男

    日本口腔インプラント学会誌   32 ( 2 )   E88 - E88   2019年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本口腔インプラント学会  

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  • 骨髄間葉系幹細胞におけるRunx2の発現低下は骨および骨髄の加齢様変化をもたらす

    土佐 郁恵, 山田 大祐, 大野 充昭, 大橋 俊孝, 窪木 拓男, 宝田 剛志

    日本補綴歯科学会誌   11 ( 特別号 )   129 - 129   2019年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • 骨髄環境におけるBMP-2誘導性骨形成・骨芽細胞分化抑制メカニズムの解明

    納所 秋二, 大野 充昭, Nguyen Ha, 笈田 育尚, 小盛 大志, 秋山 謙太郎, 大橋 俊孝, 窪木 拓男

    日本補綴歯科学会誌   11 ( 特別号 )   130 - 130   2019年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • 変形性関節症:from bench to bedside 関節軟骨のバイオイメージング

    大橋 俊孝, 加来田 博貴, 大野 充昭, 西田 圭一郎

    日本整形外科学会雑誌   93 ( 2 )   S331 - S331   2019年3月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本整形外科学会  

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  • 骨髄間葉系幹細胞におけるRunx2の発現低下は骨および骨髄の加齢様変化をもたらす

    土佐郁恵, 土佐郁恵, 山田大祐, 大野充昭, 大野充昭, 大橋俊孝, 窪木拓男, 宝田剛志

    日本補綴歯科学会誌(Web)   11   2019年

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  • 骨髄環境におけるBMP-2誘導性骨形成・骨芽細胞分化抑制メカニズムの解明

    納所秋二, 大野充昭, 大野充昭, NGUYEN Ha, NGUYEN Ha, 笈田育尚, 小盛大志, 秋山謙太郎, 大橋俊孝, 窪木拓男

    日本補綴歯科学会誌(Web)   11   2019年

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  • Novel function of BMP-2 in inhibiting bone formation in marrow environment

    Ha Nguyen Thi, Mitsuaki Ono, Yasutaka Oida, Emilio Satoshi Hara, Taishi Komori, Kentaro Akiyama, Ha Nguyen Thi Thu, Hai Thanh Pham, Kyawthu Aung, Toshitaka Oohashi, Takuo Kuboki

    JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH   33   338 - 338   2018年11月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究発表ペーパー・要旨(国際会議)   出版者・発行元:WILEY  

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  • Aggrecanは胎生後の長管骨の発生において必須である

    鳥原 秀美, 大野 充昭, 上岡 寛, 大橋 俊孝

    日本矯正歯科学会大会プログラム・抄録集   77回   234 - 234   2018年10月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本矯正歯科学会  

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  • 骨髄細胞は骨髄環境下においてBMP-2誘導性骨形成を抑制する(Marrow cells inhibits BMP-2-induced bone formation in the marrow)

    Nguyen Ha, Nguyen H, 大野 充昭, 笈田 育尚, 小盛 大志, 秋山 謙太郎, 大橋 俊孝, 窪木 拓男

    日本口腔インプラント学会学術大会抄録集   48回   302 - 302   2018年9月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本口腔インプラント学会  

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  • 変形性関節症関連microRNAの検索並びに解析

    大月 孝志, オメル・ファルク・ハティポール, 品岡 玲, メフメット・ゼイネル・チレッキ, 西村 拓人, 浅野 恵一, 稲垣 純子, 大橋 俊孝, 西田 圭一郎, 岡田 保典, 廣畑 聡

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   50回   111 - 111   2018年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • アグリカン欠損マウスの成長板は、軟骨マトリックスの硬化および軟骨細胞の形態異常を呈する

    大橋 俊孝, Alberton Paolo, 野坂 浩一, 栗原 伸之介, 枝松 緑, 大野 充昭, Aszodi Attila

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   50回   96 - 96   2018年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • Type IV collagen α6は口腔粘膜上皮の角化を制御する

    小盛 大志, 大野 充昭, 植田 淳二, 前川 賢治, 大橋 俊孝, 窪木 拓男

    日本補綴歯科学会誌   10 ( 特別号 )   126 - 126   2018年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • Col4a3ノックアウトマウスにおける網膜の表現型解析

    米澤 朋子, 松前 洋, 神崎 勇希, Chuyuan Lou, 前場 崇宏, 森實 祐基, 美名口 順, Miner Jeffrey, 大橋 俊孝

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   50回   106 - 106   2018年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • 生後の骨・軟骨におけるアグリカンの役割の解明

    鳥原 秀美, 大野 充昭, 栗原 伸之介, 枝松 緑, 宝田 剛志, 上岡 寛, 大橋 俊孝

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   50回   155 - 155   2018年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • 遺伝子検査に関する講義・実習の補綴学教育への導入

    大野 充昭, 秋山 謙太郎, 大野 彩, 納所 秋二, 三海 晃弘, 樋口 隆晴, 前川 賢治, 大橋 俊孝, 窪木 拓男

    日本補綴歯科学会誌   10 ( 特別号 )   288 - 288   2018年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • 骨髄内加齢変化のRunx2コンディショナル欠損による模倣

    土佐郁恵, 土佐郁恵, 山田大祐, 塚本俊平, 河邊憲司, 大野充昭, 大橋俊孝, 窪木拓男, 宝田剛志

    日本分子生物学会年会プログラム・要旨集(Web)   41st   2018年

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  • 骨芽細胞・破骨細胞可視化マウスの作製とその検証

    三海晃弘, 大野充昭, 秋山謙太郎, 納所秋二, 小盛大志, 大野彩, 窪木拓男, 大橋俊孝

    日本補綴歯科学会中国・四国支部学術大会プログラム・抄録集(Web)   2018   2018年

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  • Type IV collagenα6は口腔粘膜上皮の角化を制御する

    小盛大志, 大野充昭, 植田淳二, 前川賢治, 大橋俊孝, 窪木拓男

    日本補綴歯科学会誌(Web)   10   2018年

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  • 骨細胞におけるPerlecan/HSPG2の発現部位は細胞の成熟とともに細胞体から細胞突起へと変化する

    鳥原 秀美, 大野 充昭, 佐々木 隆子, 上岡 寛, 大橋 俊孝

    生命科学系学会合同年次大会   2017年度   [2P - 0326]   2017年12月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:生命科学系学会合同年次大会運営事務局  

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  • 骨細胞の成熟過程におけるPerlecan/HSPG2の発現解析

    鳥原 秀美, 大野 充昭, 大橋 俊孝, 上岡 寛

    日本矯正歯科学会大会プログラム・抄録集   76回   175 - 175   2017年10月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本矯正歯科学会  

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  • 口腔粘膜上皮の角化制御におけるCollagen IV α6の役割

    小盛 大志, 大野 充昭, 植田 淳二, 土佐 郁恵, 前川 賢治, 大橋 俊孝, 窪木 拓男

    日本口腔インプラント学会学術大会抄録集   47回   O - 5   2017年9月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本口腔インプラント学会  

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  • 必須アミノ酸Tryptophanは骨髄由来間葉系幹細胞の幹細胞性を制御し骨形成を促進する

    大野 充昭, Hai Pham, 笈田 育尚, 小盛 大志, 土佐 郁恵, 大橋 俊孝, 秋山 謙太郎, 窪木 拓男

    日本口腔インプラント学会学術大会抄録集   47回   O - 7   2017年9月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本口腔インプラント学会  

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  • The hyaluronan and proteoglycan link proteins: organizers of the brain ecm and key molecules for neuronal function and plasticity

    T. Oohashi, T. Sakaba

    JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY   142   53 - 53   2017年8月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究発表ペーパー・要旨(国際会議)   出版者・発行元:WILEY  

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  • がん微小環境の実体 がん微小環境におけるバーシカン分解酵素ADAMTSの局在と血管新生におけるバーシカンの意義

    浅野 恵一, 廣畑 聡, 大月 孝志, オメル・ファルク・ハティポール, 稲垣 純子, 大橋 俊孝

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   49回   56 - 56   2017年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • ヒト骨髄由来間葉系幹細胞および軟骨細胞の核内の染色体配置の解析の試み

    大野 充昭, 小盛 大志, 土佐 郁恵, 秋山 謙太郎, 大野 彩, 窪木 拓男, 大橋 俊孝

    日本補綴歯科学会誌   9 ( 特別号 )   271 - 271   2017年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本補綴歯科学会  

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  • ヒト骨髄由来間葉系幹細胞および軟骨細胞の核内の染色体配置の解析の試み

    大野充昭, 大野充昭, 小盛大志, 土佐郁恵, 秋山謙太郎, 大野彩, 大野彩, 窪木拓男, 大橋俊孝

    日本補綴歯科学会誌(Web)   9   2017年

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  • 変形性関節症へのヒアルロン酸投与、いつ投与すべきか? 動物モデルからの知見

    大月 孝志, 品岡 玲, 熊岸 加苗, 河野 真優美, 篠原 真歩, 浅野 恵一, 稲垣 純子, 大橋 俊孝, 西田 圭一郎, 廣畑 聡

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   48回   60 - 60   2016年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • 皮膚創傷治癒過程におけるCCN4/WISP-1の役割

    大野 充昭, 正木 明日香, 前田 あずさ, Hara Emilio S., 小盛 大志, 久保田 聡, Young Marian F., 大橋 俊孝, 窪木 拓男

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   48回   88 - 88   2016年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • 伸展刺激の強度による細胞外マトリックスタンパクおよびマトリックス分解酵素発現への影響

    大月 孝志, 金道 幸子, 長谷川 みさ, 稲垣 純子, 浅野 恵一, 障子 友理, 熊岸 加苗, 西田 圭一郎, 大橋 俊孝, 廣畑 聡

    日本生化学会大会・日本分子生物学会年会合同大会講演要旨集   88回・38回   [2P0078] - [2P0078]   2015年12月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本生化学会  

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  • メカニカルストレスが軟骨様細胞の細胞外マトリックス及びマトリックス分解酵素のmRNA発現へ示す効果の検討

    大月 孝志, 金道 幸子, 長谷川 みさ, 平田 彩, 川地 輝幸, 浅野 恵一, 稲垣 純子, 障子 友理, 熊岸 加苗, 西田 圭一郎, 大橋 俊孝, 廣畑 聡

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   47回   134 - 134   2015年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • 関節軟骨造影剤を用いた関節軟骨プロテオグリカンの評価

    大橋 俊孝, 加来田 博貴, 芳谷 学, 山田 翔也, 大月 孝志, 廣畑 聡, 二宮 善文, 西田 圭一郎

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   47回   97 - 97   2015年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • ADAMTSによるバーシカン分解と腫瘍内血管新生の関連

    浅野 恵一, 稲垣 純子, 障子 友理, Hofmann Matthias, 大月 孝志, 廣畑 聡, 大橋 俊孝

    日本結合組織学会学術大会プログラム・抄録集   47回   114 - 114   2015年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • 新規X線造影剤による変形性膝関節症ラット関節軟骨の高解像度マイクロCT造影

    大橋 俊孝, 加来田 博貴, 芳谷 学, 大月 孝志, 大野 充昭, 山田 翔也, 前原 亜美, 廣畑 聡, 西田 圭一郎, 窪木 拓男, 二宮 善文

    日本結合組織学会学術大会・マトリックス研究会大会合同学術集会プログラム・抄録集   46回・61回   106 - 106   2014年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会・マトリックス研究会  

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  • リジンオリゴマーからなる関節軟骨特異的X線プローブの創出

    大橋俊孝, 芳谷学, 大野充昭, 山田翔也, 大月孝志, 前原亜美, 廣畑聡, 西田圭一郎, 窪木拓男, 加来田博貴, 二宮善文

    日本軟骨代謝学会プログラム・抄録集   27th   2014年

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  • Structurally simple cartilage probes constructed with epsilon-lysine oligomers targeting chondroitin sulfates

    Hiroki Kakuta, Manabu Hagaya, Shoya Yamada, Fuminori Ohsawa, Ami Maehara, Aki Yoshida, Mitsuaki Ono, Ryuichi Nakahara, Keiichiro Nishida, Toshitaka Oohashi

    ABSTRACTS OF PAPERS OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY   246   2013年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究発表ペーパー・要旨(国際会議)   出版者・発行元:AMER CHEMICAL SOC  

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  • 肝細胞癌におけるXV型コラーゲン発現とその臨床応用

    木村 紘爾, 大橋 俊孝, 中山 勝, 小見山 高明, 市村 浩一, 内藤 一郎, 浅野 博昭, 佃 和憲, 大塚 愛二, 二宮 善文

    日本結合組織学会学術大会・マトリックス研究会大会合同学術集会プログラム・抄録集   45回・60回   106 - 106   2013年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会・マトリックス研究会  

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  • まれなEGFR変異を有する肺腺癌の1例

    木村 紘爾, 山根 正修, 豊岡 伸一, 古川 公之, 大橋 俊孝, 山本 寛斉, 宗 淳一, 大藤 剛宏, 三好 新一郎

    日本呼吸器外科学会雑誌   27 ( 3 )   P04 - 06   2013年4月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(NPO)日本呼吸器外科学会  

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  • レチノイドX受容体パーシャルアゴニストNEt-4IBの創出と薬効・副作用評価

    加来田 博貴, 川田 浩平, 中山 真理子, 山田 翔也, 小林 俊貴, 古沢 優貴, 大橋 俊孝, 田井 章博, 矢間 太

    ビタミン   87 ( 4 )   254 - 254   2013年4月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本ビタミン学会  

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  • PS-082-4 肝細胞癌切除標本におけるXV型コラーゲン発現の検討とその臨床応用へ対する考察(PS ポスターセッション,第113回日本外科学会定期学術集会)

    木村 紘爾, 大橋 俊孝, 中山 勝, 小宮山 高明, 市村 浩一, 内藤 一郎, 浅野 博昭, 佃 和憲, 内藤 稔, 三好 新一郎, 大塚 愛二, 二宮 善文

    日本外科学会雑誌   114 ( 2 )   634 - 634   2013年3月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:一般社団法人日本外科学会  

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  • 肝細胞癌切除標本におけるXV型コラーゲン発現の検討とその臨床応用へ対する考察

    木村 紘爾, 大橋 俊孝, 中山 勝, 小宮山 高明, 市村 浩一, 内藤 一郎, 浅野 博昭, 佃 和憲, 内藤 稔, 三好 新一郎, 大塚 愛二, 二宮 善文

    日本外科学会雑誌   114 ( 臨増2 )   634 - 634   2013年3月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(一社)日本外科学会  

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  • 肝細胞癌におけるXV型コラーゲンの発現解析

    中山 勝, 大橋 俊孝, 小見山 高明, 木村 紘爾, 内藤 一郎, 三好 新一郎, 大塚 愛二, 二宮 善文

    日本生化学会大会プログラム・講演要旨集   85回   2P - 823   2012年12月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本生化学会  

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  • Discovery of a novel benzotriazole-type retinoid X receptor partial-agonist decreasing plasma glucose level in type-2 diabetes mellitus with decreased side effects

    Hiroki Kakuta, Nobumasa Yakushiji, Fuminori Ohsawa, Shoya Yamada, Mariko Nakayama, Kohei Kawata, Yui Ohta, Chisa Fujiwara, Toshitaka Oohashi, Makoto Makishima, Akihiro Tai, Hiroyuki Yasui, Yutaka Yoshikawa

    CANCER RESEARCH   72   2012年4月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究発表ペーパー・要旨(国際会議)   出版者・発行元:AMER ASSOC CANCER RESEARCH  

    DOI: 10.1158/1538-7445.AM2012-946

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  • 関節軟骨に特異的に結合するX線造影化イメージングプローブの創出研究

    芳谷 学, 大澤 史宜, 加来田 博貴, 大橋 俊孝

    日本薬学会年会要旨集   132年会 ( 2 )   271 - 271   2012年3月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本薬学会  

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  • アルポート症候群

    大橋俊孝, 喜多村真治

    別冊 日本臨床 先天代謝異常症候群(下)   20   704 - 707   2012年

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  • ADAMTS1のin vitroでのリンパ管新生阻害効果

    稲垣 純子, 高橋 克之, 小川 弘子, Hatipoglu Omer F, Cilek Mehmet Zeynel, 小比賀 真就, 米澤 朋子, 大橋 俊孝, 廣畑 聡, 二宮 善文

    日本生化学会大会プログラム・講演要旨集   84回   2P - 0343   2011年9月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本生化学会  

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  • ADAMTS1は腫瘍壊死因子刺激下の内皮細胞におけるアポトーシスに関連する

    オメル・ファルク・ハティポール, 小比賀 真就, 廣畑 聡, 小川 弘子, メフメット・ゼェイネル・チレッキ, 稲垣 純子, 大月 孝志, 石井 裕子, 幡中 邦彦, 草地 省蔵, 米澤 朋子, 大橋 俊孝, 二宮 善文

    日本結合組織学会学術大会・マトリックス研究会大会合同学術集会プログラム・抄録集   43回・58回   104 - 104   2011年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会・マトリックス研究会  

    J-GLOBAL

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  • ADAMTS1は血管新生を阻害しアポトーシスを抑制する

    廣畑 聡, 小比賀 真就, オメル・ファルク・ハティポール, 小川 弘子, メフメット・ゼェイネル・チレッキ, 稲垣 純子, 大月 孝志, 石井 裕子, 幡中 邦彦, 草地 省蔵, 米澤 朋子, 大橋 俊孝, 二宮 善文

    日本結合組織学会学術大会・マトリックス研究会大会合同学術集会プログラム・抄録集   43回・58回   103 - 103   2011年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会・マトリックス研究会  

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  • 炎症標的化金コロイド内包リポソームのリウマチ関節炎症部位への集積

    古谷 満寿美, 松本 衣未, 美名口 順, 小川 弘子, 古松 毅之, 廣畑 聡, 二宮 善文, 西田 圭一郎, 大塚 愛二, 大橋 俊孝

    日本結合組織学会学術大会・マトリックス研究会大会合同学術集会プログラム・抄録集   43回・58回   118 - 118   2011年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会・マトリックス研究会  

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  • 関節軟骨のバイオイメージング

    大橋俊孝, 西田圭一郎

    Clin Calcium   21 ( 6 )   100 - 106   2011年

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  • 軟骨組織のバイオイメージング

    大橋俊孝

    臨床整形外科   45 ( 5 )   454 - 457   2010年

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  • ADAMTS1遺伝子治療はプロテアーゼ非依存的に血管新生阻害効果を発揮し,腫瘍増大を阻害する

    廣畑聡, 小比賀真就, HATIPOGLU Omer Faruk, 小川弘子, CILEK Mehmet Zeynel, 高橋克之, 稲垣純子, 三好亨, 大月孝志, 石井裕子, 草地省蔵, 米澤朋子, 大橋俊孝, 二宮善文

    日本結合組織学会学術大会抄録集   42nd   2010年

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  • ADAMTS1の内皮細胞に対するアポトーシス効果の検討

    HATIPOGLU Omer Faruk, 廣畑聡, 小比賀真就, CILEK Mehmet Zeynel, 小川弘子, 三好亨, 稲垣純子, 大月孝志, 草地省蔵, 米澤朋子, 大橋俊孝, 二宮善文

    日本結合組織学会学術大会抄録集   42nd   2010年

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  • ADAMTS1プロモーターは急性低酸素状態の内皮細胞選択的に遺伝子発現を誘導する

    CILEK Mehmet Zeynel, 廣畑聡, HATIPOGLU Omer Faruk, 小川弘子, 三好亨, 稲垣純子, 大月孝志, 大橋俊孝, 米澤朋子, 原田浩, 上川滋, 草地省蔵, 二宮善文

    日本結合組織学会学術大会抄録集   42nd   2010年

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  • 炎症部位を標的としたドラッグデリバリシステムの組織学的検討

    美名口 順, 峯松 秀希, 大橋 俊孝, 大谷 敬亨, 稲川 喜一, 竹花 一成, 大塚 愛二, 二宮 善文

    日本獣医学会学術集会講演要旨集   148回   153 - 153   2009年9月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本獣医学会  

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  • 軟骨基質集積ペプチドを用いた軟骨組織のバイオイメージング

    大橋 俊孝, 稲川 喜一, 西田 圭一郎, 松本 衣未, 大丸 奈月, 大塚 愛二, 二宮 善文

    バイオイメージング   18 ( 2 )   182 - 183   2009年7月

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  • UTILIZATION OF ADAMTSI AS A NEW TOOL FOR DETECTING HYPOXIA

    Mehmet Zeynel Cilek, Satoshi Hirohata, Omer Faruk Hatipoglu, Kadir Demircan, Junko Inagaki, Tomoko Yonezawa, Toshikata Oohashi, Yoshifumi Ninomiya

    IUBMB LIFE   61 ( 3 )   357 - 358   2009年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究発表ペーパー・要旨(国際会議)   出版者・発行元:JOHN WILEY & SONS INC  

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  • Brevican organizes hyaluronan-binding extracellular assemblies distinctively at the large diameter nodes of Ranvier in the CNS

    Yoko Bekku, Yoshifumi Ninomiya, Toshitaka Oohashi

    NEUROSCIENCE RESEARCH   65   S73 - S73   2009年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究発表ペーパー・要旨(国際会議)   出版者・発行元:ELSEVIER IRELAND LTD  

    DOI: 10.1016/j.neures.2009.09.254

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  • 軟骨のバイオイメージング

    大橋俊孝

    関節外科   2009年

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  • 高密度金コロイド内包標的指向性リポソームの開発

    大谷 敬亨, 峯松 秀希, 平井 政彦, 大橋 俊孝, 大塚 愛二, 大家 一典, 五十嵐 貢一

    Drug Delivery System   23 ( 3 )   427 - 427   2008年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本DDS学会  

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  • がん細胞株におけるADAMTS1の発現レベルの検討

    メフメット・ゼネユル・チレッキ, 廣畑 聡, カディール・デミルジャン, オメル・ファルク・ハティポール, 小川 弘子, 米澤 朋子, 草地 省蔵, 大橋 俊孝, 二宮 善文

    日本結合組織学会学術大会・マトリックス研究会大会合同学術集会プログラム・抄録集   39回・54回   144 - 144   2007年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会・マトリックス研究会  

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  • Bral1, brain-specific link protein, is essential for stabilizing extracellular matrix at the node of Ranvier in the CNS

    Yoko Bekku, Yoshifumi Ninomiya, Toshitaka Oohashi

    NEUROSCIENCE RESEARCH   58   S40 - S40   2007年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究発表ペーパー・要旨(国際会議)   出版者・発行元:ELSEVIER IRELAND LTD  

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  • Alport症候群に合併した食道びまん性平滑筋腫症の1例

    西江学, 猶本良夫, 白川靖博, 山辻知樹, 浅海信也, 田中紀章, 大原信哉, 内藤一郎, 大橋俊孝, 二宮善文

    消化器外科   2005年

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  • GM-CSF刺激によりヒト末梢血単核球におけるバーシカンの発現は増加する

    山脇均, 広畑聡, 小比賀真就, 小川弘子, 大橋俊孝, 草地省蔵, 二宮善文

    日本結合組織学会学術大会抄録集   37th   2005年

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  • 5) Identification and Characterization of a novel rat link protein gene : Lp3/Hapln3(第84回日本循環器学会中国地方会)

    小川 弘子, 廣畑 聡, 三好 亨, 村上 充, 白鳥 康史, 大橋 俊孝, 二宮 善文, 草地 省蔵, 佐田 政隆

    Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society   68 ( 0 )   938 - 938   2004年10月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:社団法人日本循環器学会  

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  • 新規マトリックスリンクプロテインLp3/Hapln3 クローニングおよびその発現解析

    小川 弘子, 廣畑 聡, 大橋 俊孝, 佐田 政隆, 村上 充, 二宮 善文, 草地 省蔵, 白鳥 康史, 大江 透

    日本動脈硬化学会総会プログラム・抄録集   36回   197 - 197   2004年7月

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    記述言語:英語   出版者・発行元:(一社)日本動脈硬化学会  

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  • ヒト大腸癌細胞におけるIV型コラーゲンα鎖の動態とその遺伝子発現の解析

    池田 公英, 本田 由美, 猪山 賢一, 江上 寛, 大橋 俊孝, 二宮 善文, 佐渡 義一

    マトリックス研究会大会   ( 51 )   30 - 30   2004年4月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:マトリックス研究会  

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  • 新規の脳特異的ヒアルロン酸-プロテオグリカン結合蛋白質: Bral1, Bral2

    大橋俊孝, 別宮洋子, 二宮善文

    蛋白質核酸酵素   49,15,2354-2361   2004年

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  • 新規ラットリンク蛋白質遺伝子,Lp3/Hapln3の道程と特色(原標題は英語)

    小川弘子, 広畑聡, 三好亨, 村上充, 白鳥康史, 大橋俊孝, 二宮善文, 草地省蔵, 佐田政隆

    Circulation Journal   68 ( Supplement 3 )   2004年

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  • Brain Link Proteins : New Insights for Hyaluronan-Binding Proteoglycans in Brain

    OOHASHI Toshitaka, NINOMIYA Yoshifumi

    Connective tissue   35 ( 1 )   25 - 30   2003年3月

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    記述言語:英語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

    Link protein is originally characterized as an abundant extracellular matrix protein in cartilage and named Crtl1. It can stabilize aggregates of aggrecan and hyaluronan, giving cartilage its tensile strength. Similarly to the cartilage matrix, a high content of hyaluronan matrix has also been recognized in the brain matrix. Subsequently, several hyaluronan binding chondroitin sulphate proteoglycans, called lecticans, have been identified as the abundant extracellular matrix molecules in the developing and/or adult brain. Other than Crtl1, brain-specific link protein gene, Brail, was cloned recently. The two link proteins (LPs), old and new, are differentially expressed and seemed to be coordinately expressed with lecticans in the brain. In this review, we will focus on these brain link proteins that may play crucial roles in hyaluronan matrix.

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  • 新規脳リンクプロテインBral2のクローニングと発現

    大橋 俊孝, 蘇 衛東, 別宮 洋子, 大塚 愛二, 二宮 善文

    生化学   74 ( 8 )   734 - 734   2002年8月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本生化学会  

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  • バーシカンV2・脳リンクプロテイン会合体の中枢神経ランビエ絞輪での発現とその機能

    大橋俊孝, 別宮洋子, 平川聡史, 李勝天, 松井秀樹, 二宮善文

    Connective tissue   34 ( 1 )   50 - 50   2002年4月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

    ヒアルロン酸(HA)結合型の細胞外マトリックス及び細胞膜蛋白質は、HA結合ドメインとして機能するリンクモジュールを持つ。そのうちHA結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)はレクティカンプロテオグリカンと呼ばれる。レクティカンファミリーは、Aggrecan,Versican,Neurocan,Brevicanの4遺伝子からなり、通常HA/Lectican/Link Proteinの会合体として機能すると考えられる。我々は最近中枢神経特異的リンクプロテイン遺伝子Bral1をクローニングし、Bral1は中枢神経特異的プロテオグリカンversican V2とランビエ絞輪にcolocalizeすることを報告した。ランビエ絞輪は神経の活動電位の発生と跳躍伝導に重要であることが知られている。我々はBral1が絞輪の細胞外部において、ヒアルロン酸にversicanコアプロテインを固定し、その結果versicanコアプロテインに結合している多数のグリコサミノグリカン鎖をランビエ絞輪に蓄積させ陰性に荷電させているのではないかと予想している。即ち、電位依存性NaイオンチャンネルによりNaイオンが細胞内外に出入りし活動電位を生ずるための細胞外環境を整えている役割をしていると考えている。我々は絞輪における「細胞外Naイオンプール」という仮説をたて、Bral1がその中心的な分子であるのでは...

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  • 脳特異的リンクプロテイン(Bral1)の発現パターンの解析

    別宮 洋子, 大橋 俊孝, 平川 聡史, 蘇 衛東, 大塚 愛二, 二宮 善文

    神経化学   40 ( 2-3 )   292 - 292   2001年9月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(一社)日本神経化学会  

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  • 脳リンクプロテイン(Bral1)はランビエ絞輪で「細胞外Naイオンプール」の中心的役割を果たしているか?

    大橋 俊孝, 別宮 洋子, 平川 聡史, 蘇 衛東, 大塚 愛二, 二宮 善文

    生化学   73 ( 8 )   1064 - 1064   2001年8月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:(公社)日本生化学会  

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  • 脳神経系におけるリンクモジュール遺伝子の発現

    大橋 俊孝, 平川 聡史, 蘇 衛東, 別宮 洋子, 大塚 愛二, 二宮 善文

    マトリックス研究会大会   ( 48 )   68 - 68   2001年4月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:マトリックス研究会  

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  • 成熟した脳・脊髄のプロテオグリカン

    村上宅郎, 大塚愛二, 大橋俊孝, 二宮善文

    細胞   33,8,44-47 ( 8 )   320 - 323   2001年

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:ニュー・サイエンス社  

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    その他リンク: http://search.jamas.or.jp/link/ui/2001236515

  • 脳神経系におけるリンクモジュール蛋白の機能発現

    大橋 俊孝, 平川 聡史, 蘇 衛東, 大塚 愛二, 村上 宅郎, 二宮 善文

    岡山医学会雑誌   112 ( 9~12 )   218 - 218   2000年12月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:岡山医学会  

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  • B18 漿膜下基底膜の構成IV型コラーゲンα鎖

    内藤 一郎, 斎藤 健司, 大橋 俊孝, Miner JH., 松原 龍也, 沖垣 達, 二宮 善文

    Connective tissue   32 ( 2 )   202 - 202   2000年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • B36 新規リンクプロテインのクローニング

    平川 聡史, 蘇 衛東, 大橋 俊孝, 村上 宅郎, 荒田 次郎, 二宮 善文

    Connective tissue   32 ( 2 )   211 - 211   2000年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • A15 ヒトten-m/odz遺伝子クローニングと発現の検討

    大橋 俊孝, 蘇 衛東, 平川 聡史, 植木 靖好, 長岡 義晴, 二宮 善文

    Connective tissue   32 ( 2 )   126 - 126   2000年5月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • 精巣基底膜におけるα5(IV)およびα6(IV)遺伝子の発現

    斎藤 健司, 関 次男, 大橋 俊孝, 百田 龍輔, 二宮 善文

    日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集   21   430 - 430   1998年12月

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  • マウスten-m/odz蛋白質の構造解析と発現

    大橋 俊孝, FASSLER Reinhard, 蘇 衛東, ニ宮 善文

    日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集   21   614 - 614   1998年12月

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  • Hypoxia Increases Transforming Growth Factor-β1 Concomitantly with Types I and III Collagen without Further Enhancement by Reoxygenation in Cultured Rat Cardiac Fibroblasts

    NUNOYAMA Hiroshi, KUSACHI Shozo, NINOMIYA Yoshifumi, OOHASHI Toshitaka, KONDO Jun, MURAKAMI Masahiro, MURAKAMI Takashi, OHNISHI Hiromichi, DOI Masayuki, TSUJI Takao

    Connective tissue   30 ( 3 )   207 - 211   1998年9月

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    記述言語:英語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

    The effects of oxygen concentration and reoxygenation following hypoxic culture on transforming growth factor-β1(TGF-β1)expression and types I and III collagen[α2(I)and α1(III)]mRNA expression were examined in neonatal rat cardiac fibroblasts cultured with medium containing 10% or 1% fetal calf serum at confluency. The oxygen tension was varied using a N_2-CO_2-O_2 controllable incubator. Cells were exposed to continuous hypoxia(2% O_2)or were reoxygenated(21% O_2)after hypoxic culture. The TGF-β1 protein expression level was determined by an enzyme-linked immunosorbent assay, and the expression levels of TGF-β1, α2(I)and α1(III)mRNA were measured by a Northern blot analysis. Both the TGF-β1 mRNA and protein levels were higher in the continuous hypoxic cultures than in the continuous normoxic cultures. Their levels in reoxygenation cultures were not substantially different from those in the continuous normoxic cultures. Similarly, the expressions of both α2(I)and α1(III)mRNA were enhanced in continuous hypoxic culture, and no differences were obtained between normoxic and reoxygenation cultures. The present results indicate that hypoxia induces high expression levels of TGF-β1 and types I and III collagen in rat cardiac fibroblasts and reoxygenation does not further enhance this hypoxia-induced upregulation.

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  • A-5 ヒトα3(IV)、α4(IV)遺伝子プロモータ-構造と組織特異的発現について

    百田 龍輔, 大橋 俊孝, 二宮 善文

    Connective tissue   30 ( 2 )   135 - 135   1998年6月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本結合組織学会  

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  • Alport症候群(共著)

    百田龍輔, 大橋俊孝

    日本臨床 別冊 先天代謝異常症候群(下巻)   522 - 525   1998年

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  • Alternative transcripts are also found in the human COL4A4 gene expression.

    R Momota, T Oohashi, M Sugimito, Naito, I, Y Sado, Y Ninomiya

    MATRIX BIOLOGY   15 ( 3 )   171 - 172   1996年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究発表ペーパー・要旨(国際会議)   出版者・発行元:GUSTAV FISCHER VERLAG  

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  • マウスIV型コラーゲンα6鎖の遺伝子発現

    斎藤 健司, 大橋 俊孝, 関 次男, 佐渡 義一, 内藤 一郎, 小田 琢三, 二宮 善文

    日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集   19   435 - 435   1996年8月

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  • PARTIAL GENE STRUCTURE OF THE HUMAN ALPHA-4(IV) COLLAGEN CHAIN

    M SUGIMOTO, T OOHASHI, H YOSHIOKA, N MATSUO, Y NINOMIYA

    INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE   34 ( 4 )   1203 - 1203   1993年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究発表ペーパー・要旨(国際会議)   出版者・発行元:LIPPINCOTT-RAVEN PUBL  

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講演・口頭発表等

  • 神経周囲網のオーガナイザーであるリンクタンパク質HAPLN4のシナプス形成とシナプス伝達における役割

    プロテオグリカン国際会議

    2023年9月 

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    開催年月日: 2023年9月

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  • The role of link protein HAPLN4, an organizer of perineuronal net, in the synapse formation and the synaptic function. 招待

    Toshitaka Oohashi

    KSBMB International Conference  2023年5月 

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    開催年月日: 2023年5月

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  • Cysltr1遺伝子変異は破骨細胞分化と炎症性骨破壊に影響しない

    藤田 洋史, 土生田 宗憲, 大野 充昭, 大橋 俊孝, 服部 高子, 久保田 聡, 大内 淑代

    日本生化学会大会プログラム・講演要旨集  2021年11月  (公社)日本生化学会

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    開催年月日: 2021年11月

    記述言語:日本語  

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  • 肝細胞癌におけるXV型コラーゲン発現とその臨床応用

    木村 紘爾, 大橋 俊孝, 中山 勝, 小宮山 高明, 市村 浩一, 内藤 一郎, 浅野 博昭, 佃 和憲, 大塚 愛二, 二宮 善文

    日本結合組織学会学術大会・マトリックス研究会大会合同学術集会プログラム・抄録集  2013年6月  日本結合組織学会・マトリックス研究会

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    開催年月日: 2013年6月

    記述言語:日本語  

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  • 肝細胞癌切除標本におけるXV型コラーゲン発現の検討とその臨床応用へ対する考察

    木村 紘爾, 大橋 俊孝, 中山 勝, 小宮山 高明, 市村 浩一, 内藤 一郎, 浅野 博昭, 佃 和憲, 内藤 稔, 三好 新一郎, 大塚 愛二, 二宮 善文

    日本外科学会雑誌  2013年3月  (一社)日本外科学会

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    開催年月日: 2013年3月

    記述言語:日本語  

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  • 肝細胞癌におけるXV型コラーゲンの発現解析

    中山 勝, 大橋 俊孝, 小見山 高明, 木村 紘爾, 内藤 一郎, 三好 新一郎, 大塚 愛二, 二宮 善文

    日本生化学会大会プログラム・講演要旨集  2012年12月  (公社)日本生化学会

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    開催年月日: 2012年12月

    記述言語:日本語  

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  • Analysis of the perineuronal net formation in the mouse medial nucleus of the trapezoid body (MNTB)

    International Symposium on Glyco-Neuroscience  2014年 

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  • リジンオリゴマーからなる関節軟骨特異的X線プローブの創出

    第27回日本軟骨代謝学会  2014年 

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  • 成熟脳のペリニューロナルECMの形成と機能について

    第21回 プロテオグリカンフォーラム  2014年 

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  • Role of nodal protroglycan-enriched ECM on formation and maintenance of CNS node of Ranvier

    8th International Conference on Proteoglycans  2013年 

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  • 幹細胞癌におけるXV型コラーゲン発現とその臨床応用

    第45回日本結合組織学会学術大会  2013年 

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  • 中枢神経ランビエ絞輪の形成・維持への細胞外マトリックス分子の関与

    第45回日本結合組織学会学術大会  2013年 

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  • 炎症標的化金コロイド内包リポソームのリウマチ関節炎症部位への集積の光学・電子顕微鏡観察

    第26回日本軟骨代謝学会  2013年 

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  • 神経細胞局所のヒアルロン酸結合性細胞外マトリックスの機能-ミッシングリンク-

    第3回 新潟プロテオグリカン研究会  2013年 

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  • マウス聴覚系内側台形体核(MNTB)におけるペリニューロナルネット形成

    第36回日本分子生物学会年会  2013年 

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  • Analysis of the perineuronal net formation in the mouse medial nucleus of the trapezoid body (MNTB)

    9th Pan Pasific Connective Tissue Society Symposium  2013年 

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  • バイオイメージングを用いた関節軟骨の評価

    第40回日本臨床バイオメカニクス学会  2013年 

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  • Changes of the extracellular matrix and extracellular space diffusion parameters in the thalamus of aged Bral2 deficient mice

    SfN 2013  2013年 

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  • Structurally simple cartilage probes constructed with epsilon-lysine oligomers targeting chondroitin sulfates

    8th International Conference on Proteoglycans  2013年 

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  • Bral2はbrevicanのペリニューロナルネットの構造形成に重要である

    第43回日本結合組織学会  2011年 

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  • 関節軟骨のバイオイメージング

    第33回生体膜と薬物シンポジウム  2011年 

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  • THE ION-DIFFUSION BARRIER MODEL AT THE NODE OF RANVIER: FROM THE EXTRACELLULAR ION DIFFUSION ANALYSIS IN BRAL1-DEFICIENT MICE

    7th International Conference on Proteoglycans  2011年 

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  • Bral2はbrevicanのペリニューロナルネットの構造形成に重要である

    第84回日本生化学会大会  2011年 

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  • Neurocan-GFP, a novel probe for hyaluronan in atherosclerotic plaques

    大43回日本動脈硬化学会総会・学術集会  2011年 

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  • 半月板細胞におけるII型コラーゲンの発現制御-メカニカルストレスによるエピジェネティックな転写制御

    第43回日本結合組織学会  2011年 

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  • 炎症標的化金コロイド内包リポソームのリウマチ関節炎症部位への集積

    第43回日本結合組織学会  2011年 

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  • The nodal ECM barrier model in the CNS: From an extracellular ion diffusion anaslsis in Bral1-deficient mice

    Ninth Biennial Satellite Meeting of the International Society for Neurochemistry on Myeline Biology: Myeline Development, Function and Related Diseases  2009年 

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  • OUMS-27軟骨肉腫細胞または軟骨細胞におけるNFATc1を解したIL-1bによるADAMTS9遺伝子の活性化

    第22回日本軟骨代謝学会  2009年 

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  • 生体構成成分を可視化する

    生体機能制御学講座研究構想シンポジウム  2009年 

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  • THE ION-DIFFUSION BARRIER MODEL AT THE NODE OF RANVIER: FROM THE EXTRACELLULAR ION DIFFUSION ANALYSIS IN BRAL1-DEFICIENT MICE

    IUPS 2009(国際生理学会議)  2009年 

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  • 軟骨組織のバイオイメージング

    第27回日本骨代謝学会学術集会  2009年 

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  • 軟骨基質集積ナノプローブを用いた軟骨組織のバイオイメージング

    第5回北海道結合組織勉強会  2009年 

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  • Optical imaging of mouse articular cartilage using the glycosaminoglycans binding property of fluorescent-labeled octaarginine

    第8回環太平洋結合組織学会  2009年 

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  • Brevican determines specialization of the hyaluronan-binding nodal matrix assemblies at the large diameter nodes of Ranvier in the CNS

    第8回環太平洋結合組織学会  2009年 

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  • 関節軟骨変性疾患の分子標的治療システムの開発

    ナノバイオ標的医療等の新たな医療の創造とその基盤技術研究事業成果報告会  2009年 

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  • 軟骨基質集積ペプチドを用いた軟骨組織のバイオイメージング

    第18回日本バイオイメージング学会  2009年 

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  • The active targeting liposome encapusulated high-density colloidal gold

    11th Liposome Research days conference  2008年 

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  • 新しい軟骨基質結合ペプチドを用いた関節軟骨in vivo蛍光イメージング法の開発

    第40回日本結合組織学会学術集会・第55回日本マトリックス研究会大会合同学術集会  2008年 

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  • 新しい軟骨基質結合ペプチドを用いた関節軟骨in vivo蛍光イメージング法の開発

    第21回日本軟骨代謝学会  2008年 

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  • The inhibition of the ADAMTS9 induced by Interleukin 1b using 11R-VIVIT peptide in OUMS27 Chondrosarcoma cells and in Human Chondrocytes.

    American Society of Matrix Biology  2008年 

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  • Bral1欠損マウスでは脳梁での細胞外イオン拡散が促進される

    北米神経科学会議 2008  2008年 

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  • A 3D Imaging of Mouse Knee Joint Articular Surface by Optical Projection Tomography

    WMIC(World Molecular Imaging Congress) 2008  2008年 

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  • The inhibition of the ADAMTS9 induced by Interleukin 1b using 11R-VIVIT peptide in OUMS27 Chondrosarcoma cells and in Human Chondrocytes.

    第11回 国際リポソーム会議  2008年 

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  • 高密度金コロイド内包標的指向性リポソームの開発

    第40回日本結合組織学会学術集会・第55回日本マトリックス研究会大会合同学術集会  2008年 

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  • シアリルルイスX糖鎖結合リポソームの炎症組織特異的集積性

    第4回北海道結合組織勉強会  2008年 

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  • 軟骨特異的集積ペプチド(CSBP)を用いたin vivo 蛍光イメージングおよびDDS の試み

    第4回北海道結合組織勉強会  2008年 

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  • シアリルルイスX糖鎖結合リポソームのリウマチ関節炎症部位への集積についての組織学的検討

    第40回日本結合組織学会学術集会・第55回日本マトリックス研究会大会合同学術集会  2008年 

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  • 関節炎モデルマウスにおけるシアリルルイスX糖鎖結合リポソームの特異的集積に関する検討

    BMB2008(第31回日本分子生物学会年会・第81回日本生化学会大会合同大会)  2008年 

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  • The inhibition of the ADAMTS9 induced by Interleukin 1b using 11R-VIVIT peptide in OUMS27 Chondrosarcoma cells and in Human Chondrocytes.

    アメリカマトリックス生物学会 年会  2008年 

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  • Deletion of the brain-specific link protein Bral-1 facilitates extracellular diffusion in the mouse corpus callosum.

    SfN 2008  2008年 

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  • ペプチドや核酸などの遺伝子性薬剤を放出するステントの開発

    平成18年度 特別電源所在権科学技術振興事業研究成果発表会  2007年 

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  • Cellular mechanism for cytokine induction in hyaluronan-stimulated human mononuclear cells.

    Hyaluronan 2007  2007年 

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  • Developmental and transgenic expression of crtl1/hapln1 in zebrafish

    第20回日本軟骨代謝学会  2007年 

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  • 光投射型断層撮影イメージング技術(OPT)によるマウス関節標本の3D画像解析

    BMB2007  2007年 

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  • The effect of the length of arginine chain on the internalization into the Rat AoSMC.

    アメリカ糖質生物学会(Glycobiology 2007)  2007年 

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  • Nodal extracellular molecule Bral1 plays a key role in assembling stable extracellular matrices in the CNS

    SfN(Society for Neuroscience)2007  2007年 

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  • Bral1, brain-specific link protein, is essential for stabilizing extracellular matrix at the node of Ranvier in the CNS

    日本神経科学学会Neuro2007  2007年 

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  • Differential expression of ADAMTS1 gene in cancer cell lines.

    第39回日本結合組織学会  2007年 

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  • 光投射型断層撮影イメージング技術(OPT)によるマウス関節標本の3D画像解析

    日本結合組織学会・マトリックス研究会合同大会  2007年 

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  • PTD法を利用した遺伝子性薬剤放出型ステントの開発

    平成17年度 特別電源所在権科学技術振興事業研究成果発表会  2006年 

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  • 脳リンクプロテイン-CSPG複合体の機能制御に関する研究

    特定領域研究第4回公開シンポジウム  2006年 

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  • Alport-leiomyomatosis症候群1例のIV型コラーゲン遺伝子変異解析および免疫組織化学的解析

    第53回日本マトリックス研究会  2006年 

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  • ADAMTSプロテアーゼのうちADAMTS-4が心筋梗塞早期に誘導され、梗塞辺縁部でバーシカンを分解する

    日本分子生物学会 2006 フォーラム  2006年 

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  • Developmental and transgenic expression of crtl1/hapln1 in zebrafish

    American Society of Matrix Biology  2006年 

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  • 脳リンクプロテインによる脳実質ヒアルロン酸‐CSPG複合体の機能制御に関する研究 (Brain link proteins: The role in the formation and function of the chondroitin sulfate proteoglycan complexes in the brain.)

    文部科学省科学研究費特定領域研究「糖鎖によるタンパク質と分子複合体の調節機能」第4回夏期シンポジウム  2006年 

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  • Adenoviral gene therapy using NC1 domain of collagen IV suppresses vessel formation and tumor growth

    欧州結合組織連合学術集会(FECTS)  2006年 

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  • Aggrecanase member of ADAMTS proteases are differently regulated in ventricular remodeling

    20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology  2006年 

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  • Bral1, brain-specific link protein, is essential for stabilizing extracellular matrix at the node of Ranvier in the CNS.

    20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology  2006年 

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  • Hyaluronan induced cytokine expression in peripheral blood mononuclear cells

    Glycomatrix, Extracellular Glycomatrix in Health and Disease  2006年 

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  • Tumor-specific expression of the noncollagenous domain-1 of collagen IV suppresses endothelial tube formation and tumor growth in mice.

    第38回日本結合組織学会学術大会  2006年 

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  • PTD法を利用した遺伝子性薬剤放出ステントの開発

    岡山県産業振興財団 医療・福祉・健康ミクロものづくり共同研究事業成果発表会  2006年 

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  • Alport-leiomyomatosis症候群1例のIV型コラーゲン遺伝子解析および免疫組織化学的解析

    第52回日本マトリックス研究会  2005年 

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  • 脳リンクプロテイン-CSPG複合体の機能制御に関する研究

    特定領域(グライコ)研究第3回夏期シンポジウム  2005年 

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  • GM-CSF刺激によりヒト末梢血単核球におけるバーシカンの発現は増加する

    日本結合組織学会  2005年 

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  • Analysis of neurocan/link protein interactions and distribution of hyaluronan with alkaline phosphatase and GFP fusion proteins.

    The 19th FECTS meeting  2004年 

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  • Idenstification and Characterization of a novel rat link protein: Lp3/Hapln3

    第84回日本循環器学会中国地方会  2004年 

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  • ヒト大腸がん細胞におけるIV型コラーゲンα鎖の動態とその遺伝子発現の解析

    第48回マトリックス研究会  2004年 

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  • Characterization of dermacan, a novel zebrafish lectican gene, expressed in dermal bones.

    第48回マトリックス研究会  2004年 

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  • Lp3/Hapln3, A novel Rat Link Protein is Upregulated in Pressure Overload Heart.

    第68回日本循環器学会  2004年 

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  • Dynamic induction od ADAMTS1 gene in the early phase of acute myocardial infarction.

    2nd national meeting of the American Society for matrix Biology  2004年 

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  • Lp3/Hapln3, a novel llink protein which colocalize with versican and is coordinately upregulated by PDGF.

    2nd national meeting of the American Society for matrix Biology  2004年 

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  • 軟骨細胞におけるIL-1βとTNF-αによるアグリカナーゼ遺伝子発現誘導の多様性

    第77回日本生化学会  2004年 

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  • 血管障害モデルにおけるヒアルロン酸結合リンクプロテインLp3/Hapln3の発現解析

    第77回日本生化学会  2004年 

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  • 中枢神経系軸索ランビエ絞輪における脳特異的リンクプロテイン1, Bral1/Hapln2の機能解析

    Neuro2004  2004年 

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  • 新規マトリックスプロテインLp3/Hapln3:クローニングおよびその発現解析

    第84回日本動脈硬化学会  2004年 

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  • Expression of Versican and its Degrading Enzymes in Acute Myocardial Infarction

    5th Pan-Pacific Connective Tissue Societies Symposium  2003年 

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  • Brain link proteins: New insights for hyaluronan-binding proteoglycan in the brain

    5th Pan-Pacific Connective Tissue Societies Symposium  2003年 

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  • Dermacan: a novel zebrafish lectican gene expressed in dermal bones and required for dermal bone formation

    第26回日本分子生物学会年会  2003年 

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  • Identification of the new rat Vascular link protein, Vasl1

    日本生化学会  2003年 

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  • Brain link proteins: new insights for hyaluronan-binding proteoglycans in the brain

    Hyaluronan 2003  2003年 

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  • Zebrafish dermacan, A new member of the hyaluronan-binding proteoglycan family, lectican

    3rd International conferenca on proteoglycans: Pathobiology of proteoglycans  2003年 

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  • 脳リンクプロテインによる脳実質コンドロイチン硫酸プロテオグリカン複合体機能制御に関する研究

    科学研究費特定領域研究、糖鎖によるタンパク質と分子複合体の機能調節、 第一回夏期シンポジウム  2003年 

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  • Perineuronal nets: 分子生物学的手法による新展開

    日本顕微鏡学会、第59回学術講演会  2003年 

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  • 新規脳リンクプロテインBral1の中枢神経ランビエ絞輪における発現と機能

    プロテオグリカンフォーラム、神経組織プロテオグリカン研究会合同会  2002年 

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  • 新規脳リンクプロテインBral2のクローニングと発現

    第75回日本生化学会  2002年 

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  • Expression and possible function of versican/Bral1 complex at the nodes of Ranvier in the CNS.

    第45回日本神経化学会  2002年 

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  • バーシカンV2・脳リンクプロテイン会合体の中枢神経ランビエ絞輪での発現とその機能

    第34回日本結合組織学会・第49回マトリックス研究会合同会議  2002年 

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  • 新規脳リンクプロテインBral1の中枢神経ランビエ絞輪における発現と機能

    第8回プロテオグリカンフォーラム、第2回神経組織プロテオグリカン研究会合同会  2002年 

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  • 脳神経系におけるリンクモジュール遺伝子の発現

    日本マトリックス研究会  2001年 

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  • 脳リンクプロテイン(Bral1)はランビエ絞輪で「細胞外Naイオンプール」の中心的役割をはたしているか?

    日本生化学会  2001年 

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  • 脳特異的リンクプロテイン(Bral1)の発現パターンの解析

    日本神経科学会 Neuro2001  2001年 

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Works(作品等)

  • BioJapan2013

    2013年

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  • JST 六大学合同新技術説明会

    2013年

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  • 米国ライセンシング協会展示発表

    2013年

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  • Licencing Executives Society 2013

    2013年

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受賞

  • Best Oral Presentation Award

    2018年11月   PPCTSS (Pan-Pasific Connective Tissue Society Symposium)  

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  • 日本結合組織学会優秀演題賞

    2011年  

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    受賞国:日本国

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  • 日本バイオイメージング学会 ベストイメージング賞

    2009年  

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    受賞国:日本国

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  • 結城賞(岡山医学会)

    1995年  

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    受賞国:日本国

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共同研究・競争的資金等の研究

  • 難治性潰瘍での変性コラーゲンの局在証明、再上皮化遅延の病態解明とその治療法開発

    研究課題/領域番号:23K09079  2023年04月 - 2026年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    久保 美代子, 山本 健一, 米澤 朋子, 大橋 俊孝

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    配分額:4680000円 ( 直接経費:3600000円 、 間接経費:1080000円 )

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  • ペリニューロナルネットが制御するマウス聴覚系シナプス刈込み分子機構の解明

    研究課題/領域番号:23H04235  2023年04月 - 2025年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  学術変革領域研究(A)

    大橋 俊孝

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    配分額:7280000円 ( 直接経費:5600000円 、 間接経費:1680000円 )

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  • 分子生物学と情報生物学の融合による口蓋発生メカニズムの解明

    研究課題/領域番号:22KF0265  2023年03月 - 2024年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特別研究員奨励費

    大橋 俊孝, WANG ZIYI

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    担当区分:研究代表者 

    配分額:2300000円 ( 直接経費:2300000円 )

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  • 分子生物学と情報生物学の融合による口蓋発生メカニズムの解明

    研究課題/領域番号:22F22114  2022年04月 - 2024年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特別研究員奨励費

    大橋 俊孝, WANG ZIYI

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    配分額:2300000円 ( 直接経費:2300000円 )

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  • XVIII型コラーゲンの加齢性変化が肝臓・膵臓の機能に及ぼす影響

    研究課題/領域番号:20K11556  2020年04月 - 2023年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    百田 龍輔, 米澤 朋子, 大塚 愛二, 大橋 俊孝, 内藤 一郎

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    配分額:4290000円 ( 直接経費:3300000円 、 間接経費:990000円 )

    脂肪肝の症状がはっきりとみられるXVIII型コラーゲン欠損老齢マウスだけでなく、若い欠損マウスで”予兆”のような現象を改善することで脂肪肝、NAFLDへの進行を予防できるのではないかと考え、加齢マウスだけでなく2ヶ月齢の若いマウスを用いて改めて、網羅的に遺伝子発現と組織学的な検討を行った。若い欠損マウスは細胞内脂肪滴の蓄積では組織学的に大きな差は認められなかったが、血管周囲の構造について野生型と比較して若干違いが見られたのでその再現性について確認を行っている。
    さらに、野生型、欠損の若いマウスについても、双方の肝臓からRNAを抽出し、RNA-seqにより全転写産物の解析を進めている。前年度の加齢マウスで行ったネットワーク解析、コンピューターによる代謝シミュレーションを行い、代謝経路・産物について経時的にどう変化するかについて検討する予定である。
    また、新たにリピドミクスの系を立ち上げたので、マウスの血液中や肝臓に蓄積する脂質組成について比較検討を行っている。すなわち、上記のコンピューターシミュレーションの結果を生体で実際に起きているかどうか確認を進めている。
    一方、上記のシミュレーション結果をもとに、ネットワーク解析などから中心的な役割を果たす複数の代謝経路、遺伝子産物、代謝産物を同定した。これらの候補遺伝子産物で薬理学的な調節が可能な候補を抽出した。また、その機能を調節できるような化合物検索をバーチャルに行う高性能GPU搭載コンピューターの解析環境を立ち上げた。現在これらの結果をもとに論文作成に取り掛かっている。

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  • 基底膜構成分子の誘導制御による低侵襲角化歯肉獲得療法の確立

    研究課題/領域番号:19H03841  2019年04月 - 2023年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    前川 賢治, 窪木 拓男, 冨田 秀太, ハラ エミリオ・サトシ, 大橋 俊孝, 大野 充昭

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    配分額:17030000円 ( 直接経費:13100000円 、 間接経費:3930000円 )

    天然歯や口腔インプラント義歯が長期的に良好な予後を維持するためには,歯頚部や口腔インプラント周囲に十分な幅の「角化した付着歯肉」が必要であると考えられている。我々は,角化歯肉に特異的に高発現している基底膜分子(Ⅳ型コラーゲン556, ⅩⅧ型コラーゲン,ラミニン332)を世界で初めて同定した.また,これらは上皮細胞から分泌され,上皮細胞の角化をオートクライン的に促進していること,さらには,付着・角化歯肉より採取した間葉細胞と口腔粘膜上皮細胞を共培養した場合にのみ,口腔粘膜上皮細胞の角化が促進されることを明らかとした.これらの研究成果から,基底膜直下に存在する角化歯肉由来間葉細胞と非角化歯肉由来間葉細胞の遺伝子発現の相違を明らかにすることで,上皮細胞の角化に関わっている間葉細胞からのシグナル分子を抽出することが可能であると考えた.そこで,レーザーマイクロダイセクション (LMD)法とRNA-Seq を組み合わせて,候補因子の抽出を実施してきた.具体的には,マウスの口蓋粘膜(角化粘膜) と頬粘膜(非角化粘膜)の凍結組織切片を作製, LMDにより上皮組織直下の間葉組織を採取したうえでRNAを抽出し,cDNAライブラリーを作製,シークエンス解析を行った.そして,非角化粘膜と比較し,角化粘膜の間葉組織に高発現する遺伝子を抽出を行ってきた.2021年度は,発現量に有意差があった遺伝子を用いて,Ingenuity Pathway Analysis (IPA)にて上流解析を行い,粘膜の角化に関わる遺伝子を抽出した.そして,すでに確立している口腔粘膜を模倣した3次元培養モデルを用いて抽出された遺伝子の機能解析を実施した.その結果,候補遺伝子のリコンビナントタンパク質を培養液に添加することで上皮の角化が誘導されることが明らかとなった.次年度,in vivoにて候補遺伝子の機能解析を実施する予定である.

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  • 生後の骨・軟骨発達におけるアグリカン新機能を新規Acan変異マウスにより解明する

    研究課題/領域番号:19K09649  2019年04月 - 2023年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    大橋 俊孝, 大野 充昭, 西田 圭一郎

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    配分額:4290000円 ( 直接経費:3300000円 、 間接経費:990000円 )

    生後発達および生体恒常性維持におけるAcanの役割を明らかにするため,Acanfl/flマウスを作製し,タモキシフェン(TAM)誘導性時期特異的Acan全身ノックアウトマウスを樹立した.アグリカンの欠損がECMネットワークの乱れがECMの硬さとTGFβスーパーファミリーの発現に影響し軟骨細胞の増殖分化に影響するという仮説を立て,これを同モデルで検証することを行っている.これまでの主な成果として,透過電子顕微鏡観察から上記ノックアウトマウス脛骨成長板の軟骨細胞の形態異常・カラム配列の乱れ・肥大軟骨層のアポトーシス亢進を認め,アグリカンが生後の骨成長に重要であることを明らかにした.成長板の軟骨細胞が増殖すべきところ、周囲のアグリカンが欠損することにより、異常な細胞接着を生じ,細胞分裂からの細胞形態の平坦化と層状化を阻害していると仮説を立て、そのメカニズムを検討中である.原子間力顕微鏡によるECMの硬さの解析を共同研究者Aszodi博士と引き続き共同研究中で在る.コロナ禍やウクライナ問題で渡航や国際学会発表が行いにくいがオンラインによる研究交流を進める.研究成果の一部は日本結合組織学会や日本軟骨代謝学会等で発表を行い、あるいは論文発表予定である.

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  • スクラップ&ビルドによるペリニューロナルネット機能の作動原理の解明

    研究課題/領域番号:19H04754  2019年04月 - 2021年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  新学術領域研究(研究領域提案型)

    大橋 俊孝

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    配分額:9620000円 ( 直接経費:7400000円 、 間接経費:2220000円 )

    ペリニューロナルネット(PNN)はパルブアルブミン陽性のGABA作動性介在ニューロン(PVI)などに最も顕著に存在する特殊な細胞外マトリックス(ECM)構造である。
    我々は、ペリニューロナルなECM構造の安定化に重要な複数のリンクプロテイン分子(HAPLN)に注目し、それらの遺伝子ノックアウトマウス等を駆使して、HAPLNがPNNの高密度な会合体形成を通じて、神経可塑性の制御やその他の神経活動に重要なことを示すことを目的としている。本研究は、小脳や脳幹部(聴覚系神経核)に焦点を絞り、PNNの会合体形成を傷害する(PNNスクラップ)手法によりPNN機能(動作原理)を追求するものである。
    初年度に、台形体核神経細胞のcalyx of Heldシナプスが複数入力することを電気生理学手法により明らかにした。複数入力が認められるシナプスにおいて自発的EPSCやシナプス短期可塑性の測定、発生に伴うシナプス後細胞のグルタミン酸受容体のサブタイプ変化を調べたが今のところコントロールマウスと統計的な有意差は認められていない。KOマウスで、シナプスのプレとポストのpair recordingで高頻度刺激に対する活動電位発生能力の追随性が低下することが発見された。二年度目には、複数入力を形態学的に確かめることやグリア細胞のシナプス刈込への関与を調べることに注力した。これまでのところ、シナプス刈込みに関与するとされるグリア細胞の挙動が野生型と異なることを見出している。
    成果は日本神経科学会や日本結合組織学会で発表する予定である。

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  • XVIII型コラーゲンの機能解析から皮膚創傷治癒への応用に向けた基礎研究

    研究課題/領域番号:17K11540  2017年04月 - 2021年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    米澤 朋子, 大橋 俊孝, 稲川 喜一

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    配分額:4680000円 ( 直接経費:3600000円 、 間接経費:1080000円 )

    細胞外マトリックスの働きは皮膚の創傷治癒に必須であると考えられているが、生物学的な役割はまだ未解明な点も多い。マウス皮膚創傷治癒において、XVIII型コラーゲンは再生する上皮下に早期に出現することが明らかとなった。また、発現するXVIII型コラーゲンのアイソフォームの種類は再上皮化が進むにつれて変化することが分かった。XVIII型コラーゲンは再生上皮の基底膜の形成や安定化、再上皮化の制御に働くと考えられた。

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  • XVIII型コラーゲンに注目した皮膚基底膜の老化機構の解明

    研究課題/領域番号:17K01848  2017年04月 - 2020年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    百田 龍輔, 大塚 愛二, 大橋 俊孝, 内藤 一郎

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    配分額:4420000円 ( 直接経費:3400000円 、 間接経費:1020000円 )

    ヒトの皮膚で発現している遺伝子の中から、加齢と共に発現が有意に変化する遺伝子群を網羅的に解析し、影響が及ぶ生物学的経路(RNAの転写、スプライシング、膜貫通型糖タンパク、リボタンパク、ミトコンドリア、表皮の角化、微小管形成)を明らかにした。三次元皮膚培養系により、植物のある成分によりUVによるダメージを軽減できることがわかった。また、簡便な方法を用いて、皮膚のXVIII型コラーゲン、IV型コラーゲン、幼弱な上皮細胞を検出する方法と定量的に評価するスクリプトを確立することができた。皮膚の拡大画像とこれらの検出方法を組み合わせた人工知能のプロトタイプを作成した。

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  • BMP-2の環境選択的骨誘導/抑制メカニズムの解明・応用に基づく骨再生療法の開発

    研究課題/領域番号:16H05524  2016年04月 - 2019年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    大野 充昭, 窪木 拓男, 大島 正充, 大野 彩, 大橋 俊孝, 渡辺 亮, 秋山 謙太郎

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    配分額:17160000円 ( 直接経費:13200000円 、 間接経費:3960000円 )

    BMP-2は骨形成を強力に誘導する成長因子として知られている.しかし,我々は,本研究において,骨形成を含むBMP-2の効果は骨髄内において著しく抑制され,本抑制効果は,骨髄細胞が直接骨芽細胞に作用することで生じていることを明らかにした.本研究成果は,BMP-2の臨床応用において,BMP-2の副作用その作用機序の一部を明らかにした大変重要な知見である.

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  • iPS細胞樹立技術を応用した象牙芽細胞マスター遺伝子の探索

    研究課題/領域番号:16K15802  2016年04月 - 2018年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  挑戦的萌芽研究

    大野 充昭, 窪木 拓男, 大島 正充, 前川 賢治, 大橋 俊孝, 渡辺 亮

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    配分額:3380000円 ( 直接経費:2600000円 、 間接経費:780000円 )

    象牙芽細胞分化の制御メカニズムのみならず,象牙芽細胞の分化に関わるマスター遺伝子は未だ不明である.そこで,我々は,象牙芽細胞分化に関わるマスター遺伝子の探索を目的に,組織学的・発生学的観点から網羅的解析を行った.その結果,いくつかの象牙芽細胞分化に関わる候補遺伝子を絞り込むことができた.今後,これらの遺伝子の機能解析を行っていく予定である.

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  • 軟骨特異的プローブによる関節軟骨in vivo造影と定量評価システムの確立

    研究課題/領域番号:15K15551  2015年04月 - 2017年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  挑戦的萌芽研究

    大橋 俊孝, 廣畑 聡, 大月 孝志, アゾーディ アティラ, 西田 圭一郎, 加来田 博貴

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    配分額:3640000円 ( 直接経費:2800000円 、 間接経費:840000円 )

    Ke4-TIBに加えて新規軟骨イメージングプローブ2Ke2-TIBの創出とラット変形性関節症モデルによる、in vivo造影とCT撮像による定量評価を試みたが、理想的な条件設定は完了していない。Ke4-TIBについては特許が2017年3月24日に成立した。プローブ開発と並行して、将来マウス関節軟骨変性モデルが研究へ使用されることを想定して、新規関節軟骨変性モデルの作製にとりかかった。軟骨に豊富に発現している細胞外マトリックス遺伝子(A遺伝子)のFloxマウスをRosa26-cre ERTマウスと交配させた。生後1週よりタモキシフェン投与を開始し、未投与群に比べ、低身長と関節軟骨異常を認めた。

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  • メカニカルストレス による軟骨細胞の miRNA発現のエピジェネティック制御

    研究課題/領域番号:26462299  2014年04月 - 2017年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    西田 圭一郎, 大橋 俊孝, 川畑 智子

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    配分額:3380000円 ( 直接経費:2600000円 、 間接経費:780000円 )

    本研究では, ヒト軟骨細胞に力学的負荷をかけ, 発現が変化するマイクロRNAを網羅的に検討した。この中からmiR-29bに着目し, 標的遺伝子の一つであるADAM12の発現解析を行った。ADAM12は軟骨細胞の分化過程でX型コラーゲンに先立って発現が上昇し, 手術時に採取した変形性関節症(OA)患者の骨棘組織の増殖細胞層および肥大軟骨細胞層に高率に発現していた。OAの関節局所に生じる骨棘は生体の生理的反応である一方で, 痛みや神経障害の原因になる。miR-29あるいはADAM12の発現を人為的に制御することにより, OAの新しい治療法開発に繋がると考えられた。

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  • XV/XVIII型コラーゲンとミトコンドリア間の分子機構

    研究課題/領域番号:26350892  2014年04月 - 2017年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    百田 龍輔, 大橋 俊孝, 米澤 朋子, 小見山 高明, 楢崎 正博, 大塚 愛二, 内藤 一郎

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    配分額:4810000円 ( 直接経費:3700000円 、 間接経費:1110000円 )

    大規模塩基配列計画のデータベースの検索より筋肉で発現している約千の遺伝子の中から候補となる受容体を数十に絞り込んだ。現在、その解析を進めている。また変異動物の組織学的な解析、細胞生物学的な解析により、XV/XVIII型コラーゲン変異個体では細胞骨格に大きな構造変化が起きていることがわかった。抗XV/XVIII型コラーゲン抗体の検索と反応条件の検討の結果、固定標本に対しても反応する条件を確立し、患者標本を用いて未知のXV/XVIII型コラーゲン関連ヒト疾患の検索を行った。現在、これらの結果をまとめている。

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  • プロテオグリカンによるシナプス伝達調節の分子メカニズム:Bral2欠損マウス解析

    研究課題/領域番号:26110713  2014年04月 - 2016年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  新学術領域研究(研究領域提案型)

    大橋 俊孝

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    配分額:8320000円 ( 直接経費:6400000円 、 間接経費:1920000円 )

    脳幹部神経核・小脳に特異的なペリニューロナルネット(PNN)が部位特異的に障害されたBral2/Hapln4 KOマウスを用いて、PNNによる神経活動制御機構を電気生理学的手法(パッチクランプ記録法)を用いて解析した。プルキンエ細胞の軸索を電気刺激して、小脳核細胞体より抑制性シナプス後電流を記録したところ、Bral2欠損マウスではその振幅が野生型に比べて減少した。興奮性シナプス後電流に変化はなかったことから、Bral2を含むPNNが抑制性シナプス伝達に特異的に関与していることが示唆された。また、反復刺激の間に観察される短期シナプス抑圧の減少が観察されたことから、短期可塑性の変化を示された。これらの結果はプルキンエ細胞と小脳核細胞体間のシナプスにおいて、Bral2が安定したシナプス結合のために不可欠であること、短期シナプス可塑性に関与していることを示す。
    PNN関連プロテオグリカン遺伝子のfloxマウスが完成し、f/+のオスメスの交配により、f/fマウスが出産され、生育上の大きな問題は観察されていない。今後同遺伝子の中枢神経系条件的KOマウス作製に供される予定である。

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  • 軟骨特異的蛍光X線デュアルプローブを用いた中小動物関節軟骨画像評価システムの確立

    研究課題/領域番号:25670648  2013年04月 - 2015年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  挑戦的萌芽研究

    大橋 俊孝, 西田 圭一郎, 加来田 博貴

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    配分額:3770000円 ( 直接経費:2900000円 、 間接経費:870000円 )

    中小動物の関節軟骨病変の進行を鮮明に評価できるin vivo用蛍光・X線デュアルプローブの創出を目的として研究を行った。特に、X線プローブの要件としてヨウ素を含む化合物分子量がなるべく小さく、かつ軟骨プロテオグリカン結合性を担保させなければいけない。そのために、軟骨標的化部分をε‐リジンオリゴマーとした。同造影剤の軟骨造影能力をラット膝関節を用い、ex vivoマイクロCTにより評価した。その結果、Ke4-TIBがラットOAモデル膝関節軟骨基質の減少を高解像度で画像化し、X線密度低下として数値化することができた。軟骨のX線in vivoイメージングの可能性を示すことができた。

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  • アクティブターゲティングリポソームを用いたマイクロRNAの抗腫瘍効果

    研究課題/領域番号:24659590  2012年04月 - 2014年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  挑戦的萌芽研究

    二宮 善文, 豊岡 伸一, 大橋 俊孝

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    配分額:3770000円 ( 直接経費:2900000円 、 間接経費:870000円 )

    肺癌、悪性胸膜中皮腫は治療抵抗性の疾患で、特に転移を認め手術不能の場合の予後改善のために、効果的な新規治療法の確立は急務である。
    申請者らは、本疾患を抑制するマイクロRNA(miRNA)を発見しており、本研究では腫瘍細胞に選択的に集積する標的化リポソーム(lip)の確立を目指した。まず細胞やマウス腫瘍モデルでlip集積の、次にmiRNA内包での抗腫瘍効果の評価を計画した。
    当初十分なlip集積が細胞・マウス共に得られなかったが、lip及び投与条件・モデル作成法の改善により集積は向上した。ただし本過程に研究期間の多くを費やしたので、細胞内へのlip取り込み評価とmiRNA内包は今後の課題である。

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  • 糖鎖拡散型ペリニューロナルネット障害マウスモデルによる神経機能解析

    研究課題/領域番号:24110509  2012年04月 - 2014年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  新学術領域研究(研究領域提案型)

    大橋 俊孝

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    配分額:9490000円 ( 直接経費:7300000円 、 間接経費:2190000円 )

    我々は脳幹部神経核・小脳に特異的なPNNを部位特異的に形成障害するモデルとして、Bral2欠損マウスを用いて、PNN形成メカニズムの解析を行った。本モデルは、糖鎖合成や糖鎖ドメインの合成不全を起こすものではないが、本来ヒアルロン酸に依存してPG等が高密度に・秩序よく会合すべきPNNがdiffuseになる特徴をもつ(Bekku et al., J Comp Neurol 2012)。
    Bral2が制御するPNNは聴覚神経系神経核に顕著な発現を示すこと、そのなかでも巨大神経終末を持つ内側台形体核(MNTB)に焦点を絞り研究を行った。
    野生型マウスの内側台形体核(MNTB)においてaggrecanとbrevicanは分離独立(住み分け)した発現をしており、Bral2欠損マウスではbrevicanはaggrecanと共局在した。シナプス周囲・間隙近傍に存在するaggrecanとbrevicanの局所における「住み分け」を規定するのはLPであるBral2とCrtl1とのaffinityの差によると考え、ヒアルロン酸結合ドメイン(G1)のリコンビナントタンパク発現を行った。また、MNTBは聴覚系神経回路の代表的神経核であるので、上記PNN変化が聴覚機能にどの程度影響を与えているかについて、チェコ共和国Syka教授との国際共同研究を行い、聴力の低下を認めている。今後、このECMの変化が聴力低下をもたらすメカニズム解明を行う。

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  • 脳小血管障害における基底膜の役割

    研究課題/領域番号:23390348  2011年04月 - 2014年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    二宮 善文, 米澤 朋子, 大橋 俊孝, 廣畑 聡, 大塚 愛二, 幡中 邦彦, 斎藤 健司, 百田 龍輔, 小川 弘子, 稲垣 純子

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    配分額:19240000円 ( 直接経費:14800000円 、 間接経費:4440000円 )

    血液-脳関門の破綻や脳小血管の出血に基底膜の機能の異常が関与すること、及び、その分子機構を明らかにすることを目的とした。我々は、マウス静脈内に腫瘍壊死因子(TNFα)を投与し、血液-脳関門の破綻を誘導する脳炎モデルを作製した。そして血液-脳関門の破綻および基底膜の主成分であるIV型コラーゲンの変化についてWestern blot法および免疫組織染色法を用いて継時的に解析を行った。解析の結果、継時的にIV型コラーゲンは限定的に分解され、血液-脳関門の破綻と関連性のあることが示唆された。

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  • ヒストン脱アセチル化酵素1(HDAC1)siRNAの遺伝子導入による関節炎治療

    研究課題/領域番号:23592215  2011年 - 2013年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    西田 圭一郎, 大橋 俊孝, 川畑 智子

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    配分額:3510000円 ( 直接経費:2700000円 、 間接経費:810000円 )

    HDAC1に標的を絞り、siRNAの膝関節投与およびエレクトロポレーションを用いた遺伝子導入による局所治療を試みた。体重や関節炎の臨床評価には差は認めず、全身の関節炎に関する治療効果は認めなかったが、膝関節内のHdac1の発現は抑制され、滑膜増殖も抑制されていた。マウス滑膜組織から単離した滑膜線維芽細胞の炎症性サイトカイン産生能には治療群とコントロール群で差を認めなかった。HDAC1 siRNAの導入による関節破壊抑制効果はサイトカイン制御ではなく、滑膜増殖抑制に起因することが示唆された。HDAC1を標的としたin vivo遺伝子導入により局所関節において滑膜炎の制御が可能であることを示した。

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  • 聴覚におけるペリニューロナルネットの役割ー聴覚伝導路特異的Bral2の機能解析ー

    研究課題/領域番号:22591879  2010年 - 2012年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    別宮 洋子, 大橋 俊孝, 大塚 愛二, 百田 龍輔

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    配分額:3640000円 ( 直接経費:2800000円 、 間接経費:840000円 )

    Bral2は、リンクプロテイン(LP)の一種で、ヒアルロン酸(HA)結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)およびHAとともに複合体を形成する。LPは、その複合体形成及び安定化に必須の分子であると考えられている。Bral2は、CSPGの中でもブレビカンと共局在する事がわかっている。これらは、成体脳ではペリニューロナルネット(PNN)と呼ばれる、神経細胞周囲の網目状構造に存在する。
    本研究では、聴覚伝導路において、Bral2複合体のシナプス伝達への関わりを1)シナプスの固定、2)イオンプールとしての可能性、3)イオンチャネルとの分子間相互作用という観点から解析し、聴覚伝導のメカニズムの一端を解明する事を目的とした。
    (I)Bral2欠損マウスにおける神経細胞体への影響(大塚・別宮)
    Bral2欠損マウスにおいて、PNNを構成するCSPG複合体構成分子が小脳核では局在できないことがわかっている。この神経核においてシナプスの接着等に何らかの形態的変化がないかを、電子顕微鏡での観察によって詳細に調べた。その結果、Bral2の小脳核において、単位面積当たりにおけるシナプス数が有意に減少していることが確認された。
    (II)Bral2タンパクの発現機構(百田・大橋)
    Bral2は、in situ hybridization等の結果から、mRNA発現神経細胞が投射した先の神経周囲にタンパクを産出していることが示唆されている。この発現機構を調べるために、Bral2のリコンビナントタンパクを神経細胞に発現させ、軸索輸送により投射先にタンパクが発現されるのかを解析したところ、確かに軸策輸送が観察された。軸索輸送に関与していると予測された配列を欠くリコンビナントタンパクも発現させたが、その配列によるものではないという結果が得られた。
    (III)Bral2欠損マウスにおけるCSPG複合体構成分子への影響(別宮)
    Bral2欠損マウスにおいて、聴覚伝導路におけるCSPG複合体構成分子が、各神経核または神経のサブタイプで異なる変化を示すという結果を得た。ブレビカンは、Bral2欠損マウスにおいてPNNパターンを維持できないことから、その局在はBral2に依存していることがわかった。これらCSPGの構成に関して、解析が単純であるランビエ絞輪においてその不均一性を更に解析し、その結果を論文にまとめた。現在印刷中である。

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  • 変形性関節症の診断治療用の軟骨指向性多機能ナノプローブの開発

    研究課題/領域番号:22591686  2010年 - 2012年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    大橋 俊孝, 西田 圭一郎, 小松 直樹

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    配分額:4680000円 ( 直接経費:3600000円 、 間接経費:1080000円 )

    本研究は、少子高齢化により増加傾向にある変形性関節症などの関節変性疾患において、軟骨変性の早期診断と治療を目指すための、軟骨指向性ナノプローブ開発の研究である。ポリアルギニンペプチド(R8)にDOTA-Gdを付加したプローブの関節軟骨造影効果をex vivo, in vivoで確認した。R8に軟骨変性保護タンパクN-TIMP3を付加させ、リウマチ関節炎モデルマウスでその効果を試したが、in vitroでみられた効果程は明瞭な結果は得られなかった。導入タンパクの持続発現による効果の増強など改善の余地がある。

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  • リンパ管の可視化を用いたリンパ浮腫画像診断法の開発

    研究課題/領域番号:22659323  2010年 - 2011年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  挑戦的萌芽研究

    二宮 善文, 大橋 俊孝

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    配分額:3230000円 ( 直接経費:2900000円 、 間接経費:330000円 )

    本研究は、リンパ管内皮を標的とした分子標的リポソーム技術を用いリポソーム内の蛍光指示薬によるリンパ管の特異的可視化を行い、これをリンパ浮腫の診断に役立てようとするものである。リンパ内皮細胞への結合、リンパ管の蛍光造影に成功したが、ラットリンパ浮腫モデルでの測定法の確立までは至らなかった。関連技術として、光学顕微鏡観察と電子顕微鏡観察に用いられる金コロイド内包リポソームが作製できた。

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  • 関節炎におけるアグリカナーゼ制御機構と変形性関節症早期診断・関節保護治療への応用

    研究課題/領域番号:20390399  2008年 - 2010年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    廣畑 聡, 二宮 善文, 成瀬 恵治, 大橋 俊孝, 西田 圭一郎

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    配分額:19630000円 ( 直接経費:15100000円 、 間接経費:4530000円 )

    同意が得られた関節炎患者におけるADAMTS9のSNPを解析した。ADAMTS9のプロモーター解析でNF-κBの結合を同定した。関節炎患者由来細胞に周期性伸張刺激を加えるとADAMTS1,4,5,9はいずれも異なる発現誘導パターンを示した。COL1A1の発現増強とともにインテグリンの関与を明らかにした。軟骨細胞にメカニカルストレス刺激を加えるとMMP-13およびADAMTS-5が増加し、RUNX-2とp38MAPKが関与していた。ラット変形性関節炎モデルを作成し解析を行った。

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  • 軟骨基質イメージング用マルチモードプローブ開発による変形性関節症治療の新戦略

    研究課題/領域番号:20659232  2008年 - 2009年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  挑戦的萌芽研究

    大橋 俊孝, 西田 圭一郎, 二宮 善文

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    配分額:3200000円 ( 直接経費:3200000円 )

    デュアルモードプローブの作製(二宮・大橋)
    20年度の成果に基づき、CSBP(R8)ペプチドに付加するシグナル発生部分の大きさの検討を行なった。蛍光タンパクであるEGFPを付加したR8-EGFPが軟骨基質に浸透可能であったことから、タンパク質量にして30kDa以下のものが、軟骨基質浸透性が良いと判断した。
    さらに、X線吸収性を持つ微小タンパクとして、メタロチオネインを候補とした。pETベクターにMT cDNAを組み込んだコンストラクトを構築し、BE21株に形質転換し、R8-MTタンパクを精製した。タンパク質の安定発現のため、GSTタンパク質との融合タンパクとして発現し、プレシジョンプロテアーゼにより切断後回収するほうが良い結果を得た。しかし、金含有タンパクの精製までには至らなかった。
    MRI検出プローブ作製を同時に進行させた。CSBP(R8)ペプチドに金属器レート剤のDOTAを結合させ、そこにGdを配位させる方法をとった。精製し、マスによる分子量同定を行なった。R8-DOTA(Gd)溶液はTI短縮効果を認めた。
    健常マウスと関節炎モデルマウス関節軟骨のイメージング(大橋・西田)
    イヌ大腿骨頭を摘出し、0.4mM R8-DOTA(Gd)に浸漬させ、1.5T MRIによる造影を行なった。同造影剤を含まない溶液での対照では関節軟骨が造影されなかったが、同し撮影条件で軟骨部の造影ができた。

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  • 細胞膜透過ペプチドベクターを用いたsiRNA溶出ステントの開発

    研究課題/領域番号:18500364  2006年 - 2007年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    大橋 俊孝, 廣畑 聡, 松井 秀樹, 新留 琢朗, 森 浩二

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    配分額:4020000円 ( 直接経費:3600000円 、 間接経費:420000円 )

    1.ラット血管平滑筋細胞を使ったコーティング法の最適化(大橋・新留)
    モデルsiRNA薬剤(蛍光ラベルsiRNA,)導入のためのステント表面修飾用最適コーティング法の検討をおこなった。Tiの酸化膜に硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)を結合させるコーティングを選択した。さらに、硫酸化GAGに塩基性PTDペプチドが結合することを水晶発信子(QCM)法により定量した。さらに、細胞を播種し細胞内取り込み量を蛍光量にて定量して評価したが、コントロールと比して、取り込み量の差を十分に認められなかった。播種して接着する時間までのHeparinへの結合安定性・持続性が不十分であると想定された。
    2.ラット血管平滑筋細胞を使ったsiRNA導入効果の確認(大橋・松井)
    siRNA導入が機能的に十分発現・機能抑制に働いているかを確認する。サイトカイン誘導により、再狭窄時に増殖する内膜平滑筋細胞から様々な遺伝子が発現誘導されてくる。
    ターゲットとしたのは、メタロプロテアーゼの一種のADAM-TS遺伝子である。IL-1刺激により発現が6時間後に上昇する。プローモーター上流域に転写因子NFAT結合部位が存在し、NFAT阻害剤(1 □M)で、ADAM-TS遺伝子発現が低下した。NFATの脱リン酸化と核内移行が再狭窄遺伝子発現に関与することがわかった。
    3.ラット血管再狭窄モデルにおけるsiRNAステントによる治療 (廣畑・森)
    Tiステントを入手しステントクリンプで工夫して折りたたみ、バルーンカテーテルに装着しラット総腸骨動脈への挿入実験を行った。このプロトタイプは極小化と動作柔軟性がまだ不十分であるため、血管障害を引き起こし、留置成績は大動脈より良くなかった。

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  • びまん性平滑筋腫瘍を来す疾患の原因遺伝子の探索

    研究課題/領域番号:17659412  2005年 - 2006年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  萌芽研究

    二宮 善文, 大橋 俊孝, 猶本 良夫, 内藤 一郎

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    配分額:3300000円 ( 直接経費:3300000円 )

    Alport-leiomyomataosis(AS-DL)症候群はAlport症候群にみられる諸病変と主に食道に発生する平滑筋病変を合併するX染色体性優性遺伝の疾患であり、その原因として、我々の報告を含めてCOL4A5,COL4A6上流の部分欠損との関連が論じられてきた。岡山大学医学部倫理委員会審査とAS-DL症候群の女性患者本人承諾のもと、患者および長男より末梢血DNAの提供を得、COL4A5,COL4A6遺伝子部分の変異および免疫組織学的解析を行った。昨年度194kbの欠失範囲を大まかに同定した。
    本年度は
    1.新しい症例での194kb deletionからbreak pointを同定した。Break point sequenceからnon-homologous recombinationであると判明したが、反復配列の一種であるLINE elementの関与が示唆された。
    2.消化管基底膜でのCOL4A5,COL4A6発現:悪性腫瘍手術時に摘出される組織の正常部を用い食道、胃、小腸、大腸皮膚基底膜の免疫染色を行った。AS-DLの平滑筋肉腫の多発する食道、胃の平滑筋周囲基底膜には発現しているが、ほかでは陰性と判断した。COL4A5,COL4A6の発現と何らかの有意な関係が推測される。
    3.発現メカニズムについて:本疾患はCOL4A5&6の発現している平滑筋において、その上流部が欠失すると、優性遺伝的に良性平滑筋腫瘍が発生。増殖する。また、多くのアルポート症候群にあるCOL4A5の変異により、α5鎖ペプチドの欠失とα5/a5/a6分子が欠失するにもかかわらず、平滑筋腫瘍は発生しない。これらから、本疾患はコラーゲン分子のLoss of Functionでなく何らかの遺伝子のGain of Function によると考える。本疾患を含めたCOL4A5&6共通欠失部分にインスレータ一結合部位を想定した。インスレーターであるCTCFの結合が推定される配列をその部分に認めた。

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  • 脳リンクプロテインによる脳実質ヒアルロン酸-CSPG複合体の機能制御

    研究課題/領域番号:17046012  2005年 - 2006年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特定領域研究

    大橋 俊孝, 別宮 洋子

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    配分額:4400000円 ( 直接経費:4400000円 )

    1.Bral2/Haln4ノックアウトマウスの神経周囲網マトリックス分子発現への影響:まず、Northern blottingと免疫組織学的方法でBral2/Hapln4遺伝子発現がないことを確認した。我々は先に発表した論文(Bekku et al.,Mol.Cell.Neurosci.,2003)で、Bral2/Hapln4の神経周囲網(PNN)へのタンパク質局在を報告し、ヒアルロン酸結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるbrevicanとの共局在を示した。Bral2/Hapln4ノックアウトマウスでは抗brevican抗体の神経核でのPNN様の染色性が大きく低下し、diffuseになっていることが確認できた。しかしながら、reticulotegmental nucleus of the pons (RtTg)ではBral2欠損マウスでbrevicanのPNN様の発現パターンが一部のみdiffuseになっていたことから、RtTgにおいてはBral2以外のLPが補償している可能性も考えられる。
    2.PNN形成におけるBral2/Haln4の役割:我々はBral2/Hapln4ノックアウトマウスのBral2/Hapln4遺伝子のエキソンにtauLacZ遺伝子をノックインしている。すなわち、+/-マウスではBral2/Hapln4遺伝子の転写活性に従い、Bral2発現神経軸索をX-gal染色でき、同時にBral2タンパク質は免疫染色できる。脳の神経回路の中でも単純な回路を持つ小脳に焦点を当て発現細胞とタンパク質局在の関係についての情報収集を行った。X-galの染色はtauの発現に依存しており、本来軸索に染まるはずであるが、プルキンエ細胞においては樹状突起もX-galで染色されてしまい、関係を可視化することはできなかった。これは、もともとプルキンエ細胞では樹状突起でもtauが発現しているためであると考えられる。しかしながら、小脳核においてBral2タンパクのみの発現が見られる細胞と、Bral2mRNAとBral2タンパクの両方の発現が見られる神経細胞が存在していた。これはBral2発現神経細胞とBral2タンパクの局在が必ずしも一致していないことを示す。このことから、Bral2mRNAの発現部位とタンパク発現部位が異なっていることがわかり、Bral2mRNA発現細胞の終末でタンパクが発現することが更に強く示唆された。
    またBral2/Hapln4欠損マウスにおいてはbrevicanのPNN様の発現パターンがdiffuseになるという結果を得ている。Bral2/Hapln4は一部の神経回路の神経核に特異的に発現している。Bral2の欠損により、brevican以外のプロテオグリカンのPNNの局在に影響する結果も観察できたが、その度合いは神経核ごとにより異なる。
    Bral2の欠損により各々の会合体破壊がおこることから、ランビエ絞輪周囲あるいは神経周囲膜の細胞外微小環境において特異的会合体形成に必須であることがわかった。

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  • 新しい基底膜様構造フラクトンの機能と脳室下帯神経幹細胞の分化制御

    研究課題/領域番号:16390048  2004年 - 2005年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    二宮 善文, 米澤 朋子, 大橋 俊孝, 廣畑 聡, 大塚 愛二, 内藤 一郎

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    配分額:14400000円 ( 直接経費:14400000円 )

    脳実質内の毛細血管の連続した構造体fractoneを構成する分子の解析を行なった。また、マウス脳室下帯より神経幹細胞の同定と分離、さらにはその分化の制御機構を解析することを試みた。
    [1]新しい基底膜様構造フラクトンの分子細胞生物学的解析
    基底膜分子に特異的抗体を用いて免疫染色をすると、fractone構造にはラミニン、IV型コラーゲン等の分子が存在することが明らかとなった。しかし、それらの各鎖の分布には偏りが認められた。基底膜の周りに存在するfibronectinはfractone特有の染色像を示さなかった。脳や脊髄におけるfractoneの分布について調べたところ、脳室のほぼ全周に分布していたが、第三脳室の一部、第四脳室の一部では存在していなかった。また、このfractone構造は生後すぐの脳室周囲では観察されず、生後7日目から現れはじめ、生後14日目では脳室の外側壁に偏った分布を示した。さらに、特異抗体を用い免疫電子顕微鏡による解析を行ない、fractone構造に基底膜分子が存在することを認めた。
    [2]マウス脳室下帯より神経幹細胞の同定と分離
    成体マウス脳室下帯より神経幹細胞の分離を試みた。分離した神経幹細胞の基本的培養条件の設定を行い、bFGFなどのサイトカインを付加した接着性基質上での単層培養条件において、ニューロンへの分化誘導、アストロサイトへの分化誘導を試みた。さらに、マトリックス基質の調整のための基礎的な実験を行なった。
    [3]in vitro細胞培養系を用いた細胞外マトリックスによる神経幹細胞の分化制御
    成体マウスと胎児期マウスの側脳室壁神経幹細胞の分離を行い、安定したneurosphereを得ることができるようになった。また、増殖因子の除去を行ってから単層培養を行ない各種に基質上で細胞の分化誘導の解析の条件設定ができるようになった。

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  • 新規アグリカナーゼのリウマチ性関節炎における役割と診断的応用

    研究課題/領域番号:15390459  2003年 - 2004年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    廣畑 聡, 二宮 善文, 大橋 俊孝, 米澤 朋子, 西田 圭一郎

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    配分額:15000000円 ( 直接経費:15000000円 )

    1 新しく発見したアグリカナーゼ遺伝子の発現検討
    IL-1β刺激後した、培養軟骨肉腫細胞株・ヒト軟骨細胞・ヒト線維芽細胞よりそれぞれmRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCRにて、各アグリカナーゼの発現を定量的に比較検討を行った。線維芽細胞におけるADAMTS-9の発現増加と比較して、軟骨肉腫細胞株および軟骨細胞におけるADAMTS-9の発現増加は大であり、この新規アグリカナーゼは関節においてサイトカイン刺激で大きく誘導される遺伝子であることが明らかとなった。さらに、TNF-αとIL-1βの同時刺激により、ADAMTS9は相乗的に発現が増加することも明らかとなった。ADAMTS-9のmRNA発現レベルは他のどのADAMTSよりも強力であった。
    2 アグリカナーゼに対する特異的抗体
    ADAMTS-9に対するポリクローナル抗体を作成し、ウエスタンブロット法にて予想通りのサイズのバンドが得られた。IL-1β刺激後一過性にADAMTS-9タンパクが発現することが確認された。本抗体はWestern blotで利用可能であるが、免疫染色にはアフィニティカラムによる更なる精製などが必要と結論された。
    3 アグリカナーゼノックアウトマウスの作製
    海外共同研究にてES細胞への組み込みが終了しヘテロマウスの段階となった。
    4 アグリカナーゼの誘導機構の解明
    MAP kinase情報伝達経路の阻害剤(PD98059,SB203580)を添加し、IL-1β刺激による同経路のリン酸化がADAMTS-9の誘導にどう関与しているかを明らかにした。

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  • 視神経跳躍伝導におけるランビエ絞輪外マトリックスの役割

    研究課題/領域番号:15591857  2003年 - 2004年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    大橋 俊孝, 二宮 善文, 李 勝天

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    配分額:3500000円 ( 直接経費:3500000円 )

    1.Bral1ノックアウトマウス視神経ランビエ絞輪の組織学的・形態学的検討
    (1)ランビエ絞輪外マトリックス構造形成・維持への影響:光学および電子顕微鏡レベルでの観察により、ランビエ絞輪、側絞輪、髄鞘の構造およびアストロサイト突起のランビエ絞輪への接着には野生型と大きな変化は見られなかった。
    (2)Naチャンネルの分布に与える影響について:側絞輪の分子(例えばcaspr等)が欠損すると側絞輪の構造異常だけでなく、絞輪のNaチャンネルの集積、発生過程でのNaチャンネルのアイソフォームの変化異常が観察される。絞輪のテネイシンR分子を介したNaチャンネルへの影響の可能性が考えられたが、Bral1ノックアウトマウスでは影響はなかった。しかしながら、電気生理学的伝導速度には優意な速度減少が生じた。
    (3)新たな発見として、中枢神経の種類によってそのランビエ絞輪外マトリックスに局在するマトリックスタンパク質の種類が異なること、それらはBral1/Hapln2のノックアウトにより、ランビエ絞輪への局在が失われることを見つけた。
    2.ランビエ絞輪外マトリックス形成機構の解明:上記Bral1/Hapln2ノックアウトマウスに加え、テネイシンRノックアウトマウスなどと比較し、ランビエ絞輪外マトリックス形成機構を検討した。総括すると、ランビエ絞輪外マトリックス分子は傍絞輪形成(特にセプテイトジャンクション)やNaチャンネルのクラスター化には影響を与えないが、絞輪外のマトリックス環境には大きな変化をもたらす。これらの形成分子はランビエ絞輪外に局在するヒアルロン酸に依存するものであり、それをさらに安定化するものとしてBral1/Hapln2が重要な役割をはたすものと考えられる。現在のところ、ランビエ絞輪外のイオン環境を制御しているという仮説を立てている。今後の課題として、この微小環境でのイオン濃度変化の計測・検出法の開発検討が考えられる。

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  • 脳リンクプロテインによる脳実質コンドロイチン硫酸プロテオグリカン複合体の機能制御

    研究課題/領域番号:15040215  2003年 - 2004年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特定領域研究

    大橋 俊孝, 二宮 善文

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    配分額:3500000円 ( 直接経費:3500000円 )

    1.Bral1/Hapln2ノックアウトマウス解析:ランビエ絞輪外マトリックス分子は傍絞輪形成やNaチャンネルのクラスター化には影響を与えないが、絞輪外のマトリックス環境には大きな変化をもたらす。これらの形成分子はランビエ絞輪外に局在するヒアルロン酸に依存するものであり、それをさらに安定化するものとしてBral1/Hapln2が重要な役割をはたす。
    2.Hapln3/Lp3の脳実質での発現解析:Haplnの中で発現解析の最も遅れていたHapln3について、特異的抗体作製を行い、その抗体を用いてマウス成体脳での発現解析を行った。脳実質での発現は認められないが、ある程度の大きさの動静脈の平滑筋周囲にversicanと共発現しているものである。脳実質瘢痕形成時などの病態での発現は不明であるが、この結果、正常マウス成体脳実質での主なHapln遺伝子はHapln2,Hapln4となる。
    3.Bral2/Hapln4ノックアウトマウス作製:前年度までに行った我々の実験からBral2/Hapln4は神経特異的で、神経細胞周膜とよばれるマトリックスを構成する分子の1つであることが明らかとなった。本年度の研究計画としてBral2/Hapln4ノックアウトES細胞の樹立とノックアウトマウス個体の作製を目標とした。ES細胞の樹立、キメラマウス個体の作製は順調に行われたが、野生型マウスとの交配による、生殖系列マウスの作製に時間をとり、なかなか生殖系列の完成が成功しなかった。現在、交配による複数の♀からF1世代マウスが出産したところである。+/-マウスの存在がこの中に期待される。
    4.マウス以外のHapln遺伝子解析モデル動物解析について:前年度我々は、発生期におけるHapln遺伝子および関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子の機能解析モデルとして、ゼブラフィッシュを用い遺伝子クローニングと発現解析、遺伝子停止(ノックダウン)実験をversican, dermacan, aggrecanを題材に行った。さらに、今年度はHapln1/Crtl1遺伝子クローニングと発現解析をおこない、Hapln1/Crtl1遺伝子はマウス等と同様に胎生期脳に発現していることを確認した。ゼブラフィッシュの特色を生かしたモデル動物になりうることを試行した。具体的には、モルフォリノによるノックダウンのほかに、トランスジェニックフィッシュ作製が有効手段となることを確認した。
    以上のように、いくつかの遺伝子学的手法により、脳に発現するHapln遺伝子の機能解析が進んだ。

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  • 血液脳関門における血管内皮細胞下基底膜の役割

    研究課題/領域番号:14370434  2002年 - 2003年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    二宮 善文, 廣畑 聡, 大橋 俊孝, 米澤 朋子, 大塚 愛二

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    配分額:14100000円 ( 直接経費:14100000円 )

    この2年間で私どもは、血液脳関門に関係すると思われる新規遺伝子リミトリンを同定し、これが血液脳関門と関係することを支持する結果を得た。私どもは、脳毛細血管系より脳以外血管系を引き算するという方法でcDNAsを単離し、ノーザンブロット法、シーケンス検索、等により脳毛細血管系に特異的cDNAsを選出した。さらに、数種類のクローンにつきアミノ酸配列を基に抗ペプチド抗体を作成し、その分布を調べると、ある抗体はマウス脳においてグリア境界膜に特異的に染まった。マウス脳の血管周囲グリア境界膜と脳表面グリア境界膜の両方のグリア境界膜に特異的に染まったため、私どもはこのcDNAが由来するタンパク質を、リミトリンと名付けた。このリミトリンは、膜貫通ドメインを有し、更にインムノグロブリンドメインを二つ持つため、インムノグロブリンスーパーファミリーに属することがわかった。In vivoでアストロサイトが産生することが予想され、免疫電子顕微鏡的観察によって、そのことが確認された。さらに、培養アストロサイトが大量にリミトリンを産生することも確認できた。生体脳では、血液脳関門が機能するのは脳実質内の毛細血管であるが、総ての毛細血管周囲で機能している訳ではなく、脳実質内の、いくつかの場所においては血液脳関門が機能していない場所がある。私どもはこれらの正中隆起やsubfornical organ等の場所においてリミトリンが発現しているかどうかを調べると、陰性であった。さらに、マウス脳実質損傷を作成し、その治癒過程でのリミトリン遺伝子の発現を観察すると、まず脳実質の損傷とともにリミトリンは発現停止し、その治癒過程では、損傷部位周辺の毛細血管新生とともにリミトリンが発現してくることを検知した。この現象は、リミトリンは血液脳関門の生理機能と直接関わっている可能性があるということが推測された。

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  • がん特異的遺伝子導入法を用いた血管新生阻害治療の試み

    研究課題/領域番号:14030056  2002年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  特定領域研究

    廣畑 聡, 大橋 俊孝

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    配分額:6400000円 ( 直接経費:6400000円 )

    本研究の目的は、がん休眠療法の遺伝子治療の開発である。IV型コラーゲンα3鎖のNC1ドメインは、tumstatinとも呼ばれ、血管新生阻害作用を持つことが報告されている。しかしながらIV型コラーゲンα3鎖のNC1ドメインを治療に利用するにあたっては、同部位がGoodpasture症候群の自己抗原認識部位であることから、がん特異的な遺伝子発現が重要と考えられた。
    そこでhTERT(ヒトテロメラーゼ遺伝子)のプロモーター領域を組み込んだベクターにIV型コラーゲンα3鎖のNC1ドメインを下流に位置することにより、がん細胞特異的遺伝子導入法を試みた。コントロールとして、LacZをいれたベクターによる検討では、hTERTの発現がない細胞である正常内皮細胞には、観察しえた限りではX-gal染色は見られなかった。内皮細胞の他に心臓由来線維芽細胞を用いた実験でも同様の結果が得られた。がん細胞(PC-3,DU145)においてのみ、LacZの発現が見られた。この結果は、CMVベクター下にLacZを挿入した(細胞特異性がない)ものを用いたものと比較して著しい差は認められなかった。
    NC1ドメインの遺伝子発現効率は、LacZ細胞とほぼ同等であると考えられたが、タンパクレベルの発現は充分なものではなかった。血管新生阻害効果を治療応用するには、発現効率を高めることが必須であり、アデノウイルスを用いた新しい発現カセットを作成が重要と考えられた。

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  • 新アグリカナーゼの同定と特異的抗体・ノックアウトマウス作製-リウマチ性関節炎の早期診断へ-

    研究課題/領域番号:13470312  2001年 - 2002年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    廣畑 聡, 米澤 朋子, 大橋 俊孝, 二宮 善文, 百田 龍輔

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    配分額:14000000円 ( 直接経費:14000000円 )

    1.リアルタイムPCR法によるADAMTS遺伝子の発現
    岡山大学にて樹立されたヒト軟骨肉腫由来細胞株(OUMS-27)をインターロイキン(IL)-1β刺激下に培養し、ADAMTS遺伝子の発現を検討した。刺激後、6,12,24,48時間と経時的に細胞からmRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCRを行い、各ADAMTSの発現を定量的に比較した。内部標準コントロールとしてGAPDHを用いた。ADAMTS-1,2,3,4,5,6,7,8,9のプライマー設計及びリアルタイムPCRの条件設定を行った。アグリカナーゼとしては、ADAMTS-1,4,5が報告されているが、ADAMTS-1,4,5それぞれのOUMS-27細胞におけるIL-1βに対する反応は異なっていた。
    また、細胞内情報伝達系の解析を行ったところ、MAPK-JNK pathwayが関与していることが明らかとなった。
    2.特異的抗体の作製
    ADAMTS-1に対する特異的抗体を2種類作成した。ADAMTS-1の2箇所のペプチドを抗原として家兎に免疫し、抗体を得た。特異性の評価は、IL-1β刺激していない培養OUMS-27細胞からタンパクを抽出し、ウエスタンブロッティングで行ったところ、約100kDaと70kDaのところに各一本ずつ明瞭なバンドを認めた。既報の通り、自己プロセッシングを受けているものと推察された。
    3.ノックアウトマウス
    海外共同研究者との間で、ノックアウトマウス作製を計画し、ES細胞への組み込みが完了した。

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  • ADAMTSによるアミロイド前駆体蛋白のプロセッシングと細胞外基質への影響

    研究課題/領域番号:13877097  2001年 - 2002年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  萌芽研究

    廣畑 聡, 米澤 朋子, 大橋 俊孝, 二宮 善文, 百田 龍輔

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    配分額:2000000円 ( 直接経費:2000000円 )

    ADAMファミリーのうち、ADM-10とADAM-17はαセクレターゼ機能を持つことが知られているが、ADAMTSが同様な機能を持つか検討した。
    まず、基礎的実験としてADAMTS-1はその遺伝子発現がリポポリサッカライド刺激により、各臓器において発現が上昇することから炎症において何らかの役割を持つことが示唆されている。そこで、ラット実験的心筋梗塞モデルを用いてADAMTS-1の発現形式をノーザンブロット法にて検討した。ADAMTS-1は非梗塞心臓では弱い発現しか認めなかったが、梗塞心においては、梗塞後6時間でその発現が大きく上昇していた。
    マウス脳におけるADAMTSの発現をADAMTS-1〜7において検討したが、いずれもそれほど強くなかった。海外共同研究として、アミロイド前駆体蛋白を強制発現し、恒常的に発現する細胞株を樹立している、アラバマ大学Fukuchi教授らと共同実験を開始した。同細胞株は、通常の神経系細胞よりも過剰にアミロイド前駆体蛋白を発現している。これまでの検討によって過剰なアミロイド蛋白前駆体が細胞表面及び培養上清中に存在することが確認された。この実験系において過剰なアミロイド前駆体の切断がαセクレターゼによって制御されているかどうかを検討する目的でこの細胞系におけるαセクレターゼ発現の検討を開始した。実験の条件検討が複雑であり、切断の確認は困難であった。今後は、In vivoの系における実験系の確立およびアルツハイマー脳におけるADAMTSの発現解析が重要と考えられた。

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  • 精神分裂病原因候補遺伝子としての脳特異的新規リンクモジュール遺伝子解析

    研究課題/領域番号:13877151  2001年 - 2002年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  萌芽研究

    大橋 俊孝, 氏家 寛, 二宮 善文

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    配分額:2000000円 ( 直接経費:2000000円 )

    1.第1染色体に連鎖する精神分裂病患者家系の検索
    本邦では遺伝子連鎖解析のための精神分裂病家系のDNAサンプル集めは実質的に困難であり、多くの家系を持つ海外の研究室との共同研究を試みた。Peltonenらの持つフィンランド人精神分裂病家系において第1染色体に連鎖する家系があるかどうか共同研究として検索を行ってもらった。その結果1番染色体長腕上に2つの遺伝子マーカーに連鎖する2家系を同定した。それらは染色体1q32-q42の範囲内に位置するため、本プロジェクトのBRAL1,BCAN両遺伝子は除外されたが、第1染色体上にも精神分裂病家系の連鎖する座位が複数存在することを示し、引き続き他の精神分裂病家系の連鎖解析を行うことの重要性を示唆している。
    2.BRAL遺伝子の発現解析
    マウスで相同遺伝子Bral1をクローニングし、さらにBral1特異的抗体を作成することによりその発現を詳細に調べた。その成果は論文化(Mol.Cell.Neurosci.)することが出来た。Bral1 mRNAは神経細胞が発現しており、そのタンパク質の発現は中枢神経ランビエ絞輪に局在していた。さらにその局在はヒアルロン酸(HA)結合型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのversican V2とcolocalizeすることを示した。ランビエ絞輪は神経の活動電位の発生と跳躍伝導に重要であることが知られている。我々はBral1が絞輪の細胞外部において、陰性に荷電したヒアルロン酸にversicanコアプロテインを固定し、電位依存性NaチャンネルによりNaイオンが細胞内外に出入りし活動電位を生ずるための細胞外環境を整えている役割をしていると考えている。以上の内容は学会・シンポジウムにも取り上げられ議論された。
    リンクモジュール遺伝子に共通したモチーフを指標として、新規リンクモジュール遺伝子である脳リンクプロテインBral2遺伝子をクローニングした。マウスBral2のmRNA, proteinレベルの詳細な発現解析と免疫組織化学的解析より、Bral2は神経核においてbrevicanと共存し、その機能維持に重要であることを見い出した。これは本年度日本生化学会において報告された。

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  • 嗅覚神経回路におけるTen-m2遺伝子の役割に関する分子生物学的アプローチ

    研究課題/領域番号:12470356  2000年 - 2001年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    大橋 俊孝, 米澤 朋子, 二宮 善文

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    配分額:14700000円 ( 直接経費:14700000円 )

    1)Ten-m2特異的抗体の作製:Ten-m2 C末のアミノ酸配列から合成されたペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製した。他のTen-mの組み換え蛋白または組織切片染色により特異性は確認された。併せて他のTen-m蛋白に対するモノクローナルあるいはポリクローナル抗体を作製し、脳での発現を調べた。胎生期のTen-m2の発現に関しては他Ten-m遺伝子の発現とwhole mount in situで比較検討
    2)マウス脳におけるTen-m2リガンドの検出:申請書に記述したTen-m2細胞外ドメイン組み換え蛋白をHEK293細胞に発現させ、脳抽出液よりリガンドの検索を行った。Ten-m2細胞外ドメインに結合する蛋白のバンドをSDS-PAGEにて確認しているが、同定は行われていない。
    3)ヒトTen-m2遺伝子染色体座マッピング:G3 RHパネルにより、Ten-m2,3,4各遺伝子はそれぞれ5,4,11番染色体に位置することを明らかにし、OMIM等によりその遺伝子座にマップされた遺伝性疾患があるかどうかを検索したが、重要な候補は存在しなかった。
    4)Ten-m2ノックアウトマウスの表現型解析:(1)II型膜貫通蛋白であるTen-m2の膜貫通ドメインに相当するエキソンにネオマイシン遺伝子断片を挿入することによりTen-m2ノックアウトマウスを作製した。現在、関連Ten-m遺伝子の発現、組織レベルの異常、phenotypeについて観察中である。Ten-m2遺伝子は確かにノックアウトされていることはmRNAレベル、タンパク質レベル両方共に確認された。胎児期E10.5以降に頭部に発現していることから胎児期の頭部発達に異常が見られる可能性も考えられたが、組織レベルではその異常は見られていない。(2)生後脳の成熟に伴う組織上の異常があるか野生型と比較を行ったが明らかな違いは見られなかった。申請時に計画したMonbaertsらの匂い受容体遺伝子(P2)ノックインマウスとの交配に入る前に神経軸索特異的タンパク質MBPの抗体染色により検討を行った.(3)他Ten-mファミリー遺伝子の機能的代償の可能性について、研究初年度に作製した各遺伝子特異的ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を使用して検討を行ったが有意な違いは認められなかった。
    5)マウス脳におけるTen-m2リガンドの検出:(1)Ten-mファミリータンパクの細胞外ドメインは既存のタンパクのドメイン構造にホモロジーが少ない構造上ユニークなものと考えられ、その構造解析はリガンド検出に重要である。4メンバー全部をHEK293細胞で発現させ、電子顕微鏡観察すると全てジスルフィド結合を介した二量体を形成していることが分かった。論文作製中である。(2)匂上皮の投射には細胞外マトリックス分子が関与する可能性があるとされ、リガンド候補分子としてCSPG(コンドロイチン硫酸プロテオグリカン)を想定し発現解析関連遺伝子のクローニングを行った。その結果、ヒアルロン酸結合新規脳リンクプロテインをクローニングし、発現について論文化することができた。

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  • 基底膜コラーゲン遺伝子の機能解析に関する共同研究

    研究課題/領域番号:11694280  1999年 - 2001年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    二宮 善文, 米澤 朋子, 百田 龍輔, 大橋 俊孝, 植木 靖好

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    配分額:8200000円 ( 直接経費:8200000円 )

    基底膜の機能解析に関する三年間の研究結果として次のような研究結果が得られた。
    1)Col4a遺伝子発現停止マウスの解析を行うことにより、α(IV)鎖の生体内における生物学的機能について推測することが出来た。col4a3遺伝子のノックアウトマウスを入手したのでこのマウスの解析を行なうことにより、IV型コラーゲン遺伝子の機能を解析する方法論を設定できた。また、他のcol4a遺伝子ノックアウトマウスの作成を新たに開始したので、IV型コラーゲン遺伝子の発現を完全に停止したマウスの表現系の解析が可能になった。
    2)IV型コラーゲン分子の会合体様式の解析
    新しい解析方法、コラーゲン部分を細菌コラゲナーゼで分解し、NC1ヘキサマー解析を、未変性コラーゲンを認識する特異的モノクローン抗体を用いた免疫沈降と、変性したコラーゲン鎖を認識する特異的モノクローン抗体を用いたウエスタンブロット解析により、生体内での高分子会合体様式の解析に成功した。その結果、腎糸球体ではα3α4α5鎖によるネットワークとα1α2によるネットワークが別々に構築されていることが分かった。他に平滑筋細胞周囲基底膜の解析も行ない、こちらはハイブリッドネットより構築されていることが分かった。
    3)腎糸球体基底膜の解析によりその特異機能はα3α4α5鎖によるネットワークによることが明確になったが、同様のα3α4α5鎖会合体が脳脈絡叢基底膜にも存在することを明らかにした。これは上衣細胞が産生し、血液成分の濾過を行なうための基底膜のfiltration機能と大きく関わりあうことが判明した。

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  • エンドスタチンの血管内皮細胞増殖抑制効果の機構

    研究課題/領域番号:11470274  1999年 - 2001年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    二宮 善文, 米澤 朋子, 百田 龍輔, 大橋 俊孝, 植木 靖好

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    配分額:13900000円 ( 直接経費:13900000円 )

    1)血管内皮細胞培養系での低酸素状態でのXVIII型コラーゲンの生合成変化
    ヒト毛細血管内皮細胞および周辺細胞の培養系で、XVIII型コラーゲン遺伝子の発現を調べると、共に正常酸素濃度に比べて、低酸素状態ではXVIII型コラーゲン遺伝子の発現は、RNAでも蛋白レベルでも優位に低下していることが分かった。
    2)In vivoにおけるエンドスタチン投与によりChondrosarcomaの縮小効果
    ヌードマウスにヒトリコンビナントエンドスタチン(50μg/kg/day)を腫瘍周辺に三週間投与することによって、明らかにchondrosarcomaの増生が抑えられた。しかしながら、chondrosarcomaのcell lineであるOUMS-27の細胞培養系では、0-100ng/mlの濃度で投与したリコンビナントヒトエンドスタチンの増殖抑制効果、遊走活性に変化はなかった。bFGFおよびVEGFで活性化したHUVECの遊走活性は、エンドスタチンによって阻害された。エンドスタチンはI型コラーゲン上での血管内皮細胞の遊走活性、接着活性は阻害したが、増殖活性には影響がなかった。
    3)XVIII型コラーゲンとXV型コラーゲンの血管基底膜上での発現部位の相違
    XVIII型コラーゲン遺伝子の翻訳産物は、血管基底膜に認められた。アミノ酸配列、ドメイン構造が似ているXV型コラーゲンも同様に、血管基底膜に認められる。しかしながら、局在は微妙に違っていた。平滑筋細胞周囲基底膜にはどちらかもしくは両コラーゲンが存在したが、毛細血管周囲基底膜は、臓器組織によって、両方のコラーゲンもしくはXVIII型コラーゲンのみが存在した。このことは、両コラーゲン遺伝子の生理学的機能と関連があるかもしれない。

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  • 新生血管の構築と基底膜コラーゲンの新しい機能

    研究課題/領域番号:11877121  1999年 - 2000年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  萌芽的研究

    二宮 善文, 米澤 朋子, 百田 龍輔, 大橋 俊孝, 植木 靖好

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    配分額:2000000円 ( 直接経費:2000000円 )

    1 血管系特に毛細血管全体におけるXVIIIコラーゲンおよびXVコラーゲン遺伝子の発現
    両コラーゲンは内皮細胞直下基底膜と血管壁に存在する平滑筋細胞周囲の基底膜であることがわかった。毛細血管内皮細胞下基底膜ではXVIII型とXV型を共通に発現するものが認められる.即ち腎や小腸粘膜、皮膚の毛細血管の内皮細胞下基底膜はXVIII型/XV型両者が共存する.しかしこれは組織臓器により異なり、肺胞壁、肝類洞、糸球体基底膜はXVIII型が主であり、他方胎盤、心臓、骨格筋、小腸筋層ではXV型が主であった.しかし、XVIII型/XV型両者の発現のない毛細血管は認められなかった.このように、毛細血管内皮細胞下基底膜のXVIII型とXV型の発現には多様性がある、XVIII型とXV型ともに発現するものが基本だが、類洞や糸球体基底膜のように特殊化した毛細血管ではXVIII型が優位に発現された.
    2 基底膜IV型コラーゲンの新しい機能
    IV型コラーゲンのα鎖は6種類あり、中央にコラーゲン部分、N末(NC2ドメイン)とC末(NC1ドメイン)に非コラーゲンドメインを有する。私達は、これらの6種類のα鎖のNC1ドメインをリコンビナントで作製し、これらを用いて血管内皮細胞の接着性と走化性をみたところ、α2、α3、α6鎖NC1ドメインにそれを抑制する活性が認められた。さらに、血管内皮細胞の接着と走化性はインテグリンαvβ1依存性であることが分かった。鶏胚の系(CAMアッセイ)でbFGFによって誘導された血管新生が、明らかにコントロールとくらべて優位に、リコンビナントα2、α3、α6鎖NC1ドメインによって抑制されるという結果を得た。このことは初めての報告であり、IV型コラーゲンの断片に新しい機能があることが明らかになったという意味で意義のある発見である。

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  • 人工臓器作製を目指した基底膜再構築の基礎研究

    研究課題/領域番号:10557113  1998年 - 2000年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    二宮 善文, 米澤 朋子, 百田 龍輔, 大橋 俊孝, 植木 靖好

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    配分額:12900000円 ( 直接経費:12900000円 )

    私達は、上皮細胞/内皮細胞とマトリックスとの間に存在する基底膜を産生し、細胞とマトリックスとの間に挿入することによって、生体内と同じ構成の人工臓器を作製することを究極の目的とする。本研究では、IV型コラーゲンのα鎖構成分子作製のための基礎研究を行なってきた。
    ・平滑筋細胞周囲基底膜分子構成が臓器により異なる。臓器特有機能と相関する可能性がある。
    ・COL4A3とCOL4A4遺伝子の上流域の構造と発現制御の問題を、ヒトの遺伝子について解析し、二つの転写産物が二つのプロモーターから発現されていることを明らかにした。
    ・ウシ卵巣廬胞周囲の基底膜分子構成が発育段階によって異なってくることを示した。
    ・細胞培養系においてα1(IV)鎖とα2(IV)鎖の生合成を調べたところ、特にα2(IV)鎖がProMMP-9と相互作用していることをが明らかになった。
    ・正常乳腺上皮細胞と、癌化した上皮細胞下基底膜のIV型コラーゲン分子構成を見ると、正常ではα1/α2とα5/α6分子であるのが、癌化、浸潤度、悪性度によって分布が異なることが分かった。
    ・COL4A5遺伝子に変異が認められているイヌAlport症候群の例をを観察すると、mRNAレベルではα5(IV)鎖が減少しているのにα6(IV)鎖は正常と比べ変化がないが、タンパク質レベルでは両α鎖共に欠如している事が分かった。α6鎖産生が別の機序で行なわれ、α5/α6分子を形成している可能性を示していることが分かった。
    ・上皮細胞直下基底膜の分子構成が臓器により異なる。臓器特有機能と相関する可能性がある。
    ・複数のIV型コラーゲンのNC1ドメインには、血管新生を抑制する活性があり、腫瘍増生を抑えることを初めて示した。
    ・LMX1B遺伝子の変異で生じるNail patella症候群では腎糸球体基底膜に異常が起こるが、Lmxlb(-/-)マウスでは腎糸球体においてα3(IV)鎖とα4(IV)鎖が減少していることを突き止めた。さらにこの転写因子であるLMX1BがマウスとヒトのCOL4A4遺伝子の第一イントロンのエンハンサー様配列に結合するだけでなく、発現を上昇させることを明らかにした。

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  • 軟骨細胞分化を誘導する因子のクローニングに関する研究

    研究課題/領域番号:10877227  1998年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  萌芽的研究

    二宮 善文, 植木 靖好, 百田 龍輔, 大橋 俊孝

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    配分額:2000000円 ( 直接経費:2000000円 )

    本研究は、肢芽発生過程において、軟骨新生を誘導する分化機構を分子の変化として捉えるために、軟骨分化誘導因子をクローニングすることを目的として、現在までに鶏胚の肢芽Stagc20(間葉系細胞)とStage24(軟骨細胞系)からmRNAを抽出し、前者からcDNAライブラリーを作製、後者から引き算し、残りのcDNAをPCRで増幅することにより前者に陽性であって後者に陰性であるクローンを選び出し、これらのクローンについて、そのポリペゾチド構造、遺伝子構造と発現様式を検索し、性質を調べ、軟骨を誘導する機能を有するか否かを調べてきた。取得クローンについて:1)間葉系細胞mRNAと軟骨細胞系mRNAを用いたノザンプロット、2)データーベースによる既報の情報の入手、3)重複久ローン単離により翻訳部位のアミノ酸配列、4)鶏胚全身in situハイブリダイゼーションによる発現パターンの検索、を行ってきた。間葉系細胞と軟骨細胞RNAを抽出し、引算ハイブリダイゼーションPCR法によって、前者に陽性であって後者に陰性であるcDNAクローンを選び出した結果、このなかで興味ある発現パターンを示すいくつかのクローンについて重点的に、ポリペプチド構造と発現部位の同定、他の軟骨特異的遺伝子群との発現時期の比較、等の性質を詳細に検討してきた。得られた複数のクローンが間葉系細胞RNAに強くハイブリダイズし、これらのなかに間葉系細胞を軟骨へと分化を誘導する因子が含まれていることを示唆した。

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  • び慢性食道平滑筋腫の分子生物学的解明の試み

    研究課題/領域番号:09671309  1997年 - 1998年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    大橋 俊孝, 植木 靖好, 百田 龍輔, 二宮 善文, 吉岡 秀克

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    配分額:3000000円 ( 直接経費:3000000円 )

    び慢性食道平滑筋腫の病因、平滑筋の分化増殖とIV型コラーゲンの関係を分子生物学的に解明することを目標として研究を行ってきた。
    1. アルポート症候群合併び慢性食道平滑筋腫(DL+AS)患者遺伝子変異解析
    我々はDL+AS患者においてCOL4A5/COL4A6遺伝子上流17kbに及ぶ欠失を同定し、その詳細な切断点を解析した。その結果、欠失にはトポイソメラーゼI型、II型の関与が考えられた。また、この患者は体細胞モザイクであった。この欠失は既に報告されている症例で最小のものであり、DL+ASの発症機序解明に有力な手がかりになると考えられる。
    2. アルポート症候群合併び慢性食道平滑筋腫(DL+AS)患者平滑筋腫の免疫組織学的解析
    上記DL+AS患者の食道平滑筋腫及び腎組織基底膜をIV型コラーゲンα鎖特異的モノクローナル抗体を用いて染色した。α5(IV),α6(IV)鎖は腫瘍組織の大部分において染色されなかった。このことはCOL4A5/COL4A6遺伝子の欠失した平滑筋が優位に増殖した事を意味する。
    3. IV型コラーゲンα6(IV)鎖(col4a6)ノックアウトマウスの表現型解析
    col4a6ノックアウトマウスマウスでは生後約1年後においても食道及び他の平滑筋臓器に平滑筋腫は見つかっていない。col4a6遺伝子のみの欠失ではDLが発症しない可能性を示唆している。
    4. AS+DLモデルマウス作製および解析:ヒトAS+DL患者のCOL4A5/COL4A6遺伝子上流欠失ゲノムクローンのトランスジェニックマウスを作製し、col4a6ノックアウトマウスと掛け合わせる実験を行った。ヒトにみられた表現型が再現できるか注目した。第2イントロン中の第3の遺伝子の存在とそのdeletionによるドミナントネガティブな影響がみられる可能性がある。
    5. ヒトCOL4A6第2イントロンに存在する遺伝子の検索:イントロン2をカバーするBACコンティグを作製しエキソントラップを行い新規エキソン6つを単離した。これらのクローンを用い、食道等のcDNAライブラリーのスクリーニング・ノザンプロット等を行い発現臓器の検討した。

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  • 軟骨・非軟骨細胞におけるV/XI型コラーゲンα鎖遺伝子の特異的発現機構の解析

    研究課題/領域番号:09671497  1997年 - 1998年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(C)

    吉岡 秀克, 松尾 哲孝, 調 恒明, 百田 龍介, 大橋 俊孝, 二宮 善文

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    配分額:3200000円 ( 直接経費:3200000円 )

    in vivo及びin vitroでα1(XI)鎖コラーゲン遺伝子の転写調節機構を解析する目的で、マウスα1(XI)遺伝子の5'flanking領域のDNA断片を単離した。その結果、ヒトの場合と同様に複数の開始点が存在し、プロモーター領域にはTATAboxやCCAAT boxは認められず、複数のSp1結合部位が存在した。このDNA断片をルシフェラーゼ及びβ-gal遺伝子の上流につないだ。プロモーター領域のDNA断片は-5kbまでのもの(long form)と、-536bPまでのもの(Short form)の二種類を作製した。さらにこれらの四種類のコンストラクトを用いてレポーター遺伝子の下流に第一イントロンの三つのSma断片(上流より3.5kb、3.0kb、7.0kb)をつないだ。これらを用いて、ウシ大動脈平滑筋細胞及びヒト軟骨肉腫培養細胞にトランスフエクションを行いプロモーター活性をみた。その結果、平滑筋細胞においても、軟骨細胞においてもShort promoter(-536bp)の活性が、long Promoter(-5kb)の活性より高かった。又、第一イントロンの三つのSma断片はいづれの細胞においてもShort promoterの活性を抑制させる傾向にあった。
    一方、このα1(XI)鎖遺伝子のN末酸性領域の機能を解析する目的で、この領域をコードする各エクソン欠損させたコンストラクトを作製した。このコンストラクトを横紋筋肉腫細胞(A204)、軟骨肉腫細胞(LTC)、腎由来細胞(293)にトランスフェクションし、そのスプライシングパターンをin vitroで調べた。その結果、腎由来細胞ではエクソン6A-7-8をとるパターンが主要なもので、エクソン6Bによりコードされる転写産物は見られなかった。横紋筋肉腫細胞ではエクソン6A-7-8の他にエクソン7-8のパターンも見られた。一方、軟骨肉腫細胞では五種類のパターンが見られた。このin vitroの実験と平行させてin vivoの実験を行うために、エクソン6A、6Bの各々を欠損させたマウスをhomologous recombination法で作製中である。

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  • 遺伝子破壊法によるIV型コラーゲンの機能解析に関する共同研究

    研究課題/領域番号:09044308  1997年 - 1998年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  国際学術研究

    二宮 善文, 百田 龍輔, 大橋 俊孝, ラインハルト フェスラー, コルド ブラケブッシュ, アティラ アゾディ, ブラケブッシュ コード, アゾディ アティラ, フェスラー ラインハルト

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    配分額:5100000円 ( 直接経費:5100000円 )

    Co14a6遺伝子ノックアウトマウスのヘテロ接合体およびホモ接合体を得ることができた。これらのマウスにおいてCo14a6遺伝子のRNA転写、タンパク翻訳活性について詳細に検索した。その結果、転写は認められず、遺伝子発現停止実験が成功したことを意味した。ノックアウトマウスと正常マウスの間の形質変化があるかどうかの検索を進めたところ、現在に顕著な差異は認めていない。
    α鎖特異抗体を用いて、α1/α2、α3/α4/α5とα5/α6の三種の分子構成があることを特異抗体を用いた免疫二重染色法によって明らかにした。特に腎糸球体と肺胞基底膜はα3/α4/α5、皮膚および腎ボーマン嚢基底膜はα5/α6分子で構成され、これらの分子を含む超分子会合体でつくられる基底膜とその臓器における機能との関係がありそうである。さらに責任遺伝子がCOL4A5であるアルポート症候群の解析によって、ひとつのα鎖が変異を示すと他のα鎖が細胞内で分解されることから、上記のα3/α4/α5とα5/α6の構成分子が存在することが再確認された。
    アルポート症候群に食道下部平滑筋症が合併する大変稀な症例を日本国内で見つけだし、詳細な解析を実施した。その結果、欠失部分はCOL4A5とCOL4A6上流域17kbに及ぶことがわかった。欠失周辺にはトポイソメラーゼコンセンサス配列が存在し、これらは大きな欠失の修復に関与したことが推定された。

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  • 基底膜新コラーゲン鎖の構成する分子,会合体及び生物学的機能

    研究課題/領域番号:08457154  1996年 - 1997年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  基盤研究(B)

    二宮 善文, 百田 龍輔, 大橋 俊孝, 吉岡 秀克

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    配分額:8800000円 ( 直接経費:8800000円 )

    マウスcol4a6遺伝子断片を単離するためにマウス129genomic libraryのスクリーニングを行った。その結果マウスcol4a6遺伝子断片TSg6(約18.3kb)を得た。これを詳細に解析すると、ヒトCOL4A6遺伝子に見られるようなalternative transcriptsは存在しないことがわかった。Col4a6遺伝子の発現停止マウスを作成するために、col4a6エクソン2のなかにNeoR遺伝子を挿入した形のvectorを作成し、ホモロガスリコンビネーションによって129Svマウス由来R1-ES細胞にトランスフェクションし、G418でスクリーニングしNeoR遺伝子陽性細胞を得た。ホモロガスリコンビネーションの判定はgenomic Southern-blottingによって行った。その細胞をC57BL/6胚盤胞に注入、DBF1擬妊娠マウス子宮に移入、キメラマウスの作成を行った。その後交配を繰り返し、heterozygote、homozygoteを得、現在その形質変化を観察する実験を行っている。また、col4a6遺伝子発現については特異抗体をもちいて免疫染色を行ったところ、陰性の結果を得ており、col4a6遺伝子の発現停止実験は成功した。
    α鎖特異抗体を用いて、分子構成としてα1/α2とα3/α4/α5/とα5/α6の三種があることを特異抗体を用いた免疫二重染色法によつて明らかにした。
    また、アルポート症候群に食道下部平滑筋症が合併する大変稀な症例を日本国内で見つけだし、詳細な解析を実施した。その結果、COL4A5遺伝子のイントロン1の一部、エクソン1、両遺伝子の遺伝子間部分、COL4A6遺伝子エクソン1'、イントロン1'、エクソン2、およびエクソン2、イントロン2の一部が欠失していることが判明した。また、その欠失部分は17kbに及ぶことがわかった。欠失の周辺にはトポイソメラーゼIおよびトポイソメラーゼIIコンセンサス配列が存在することが判明した。これらの配列は17kbにおよぶ大きな欠失が生じた際、それを修復するための機構と考えられる。

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  • 血液脳関門をマトリックスの分子構築として理解する試み

    研究課題/領域番号:08877223  1996年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  萌芽的研究

    二宮 善文, 百田 龍輔, 大橋 俊孝

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    本研究は、選択的透過性を有する脳血液関門がアストロサイトから分泌されるシグナルによって、基底膜を産生する内皮細胞に影響を及ぼし、脳以外の毛細血管周囲基底膜と異なる分子構成による超分子会合体が作り上げられているという考えに基づいて、血液脳関門の本能が細胞外マトリックス分子と細胞間の相互作用で説明することにある。具体的に以下の結果を得た。
    1)脳毛細血管と脳以外の毛細血管(腸間膜)よりRNAを抽出した。これを無細胞系のタンパク翻訳を行うと、多くのポリペプチドが共通のバンドとして認識されるが、一方で、確かにいくつかのペプチドが異なっていることがわかった。これらのバンドが異なる超分子会合体を構成している可能性がある。
    2)ヒト脳毛細血管と脳以外の毛細血管について、α1(IV)-α6(IV)コラーゲン鎖に対する特異的モノクローン抗体を用いて蛍光染色すると、α1(IV)鎖とα2(IV)鎖の存在が明らかになった。脳毛細血管と脳以外の毛細血管について、α(IV)鎖の分布の差は特に認められなかったが、現在さらに詳細の解析を行っている。
    3)脳毛細血管と脳以外の毛細血管より抽出したRNAを鋳型にして、種々のプライマーを用いてDifferential display法を行い、いくつかの異なるバンド認められたので、現在これらをクローニングしている。

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  • 肺胞基底膜のIV型コラーゲンの分子種と遺伝子発現

    研究課題/領域番号:08877098  1996年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  萌芽的研究

    百田 龍輔, 吉岡 秀克, 大橋 俊孝

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    配分額:1900000円 ( 直接経費:1900000円 )

    今年度、我々の研究は以下のような進展が見られた
    1)IV型コラーゲンα4遺伝子転写産物の発現について
    IV型コラーゲンα4の遺伝子転写産物に関して、我々のこれまでの結果から第1エキソンの異なる2つの転写産物(1と1')が存在することがわかっているが、Northern blot法と定量的RT-PCR法によって、これらの転写産物をそれぞれ独立に検出する系を確立することに成功した。
    これによりIV型コラーゲンα4遺伝子転写産物の発現について、以下のような知見を得た。
    i)2つの転写産物は、基底膜に富む様々な組織において発現している。
    上皮細胞由来の細胞株、基底膜を多く含む組織中で発現が見られた。中でも特に発現が顕著なのは、肺胞の上皮細胞由来の細胞株であった。
    ii)競争的PCR法により転写産物1と1'の転写産物の発現の差について比較を行ったところ、ある種の細胞についてこれらの発現量に100倍もの差が見られた。
    こうした発現の差が、組織特異的プロモーターによるものと考え、更に検討を重ねている。
    2)レポーター遺伝子による、IV型コラーゲンα4遺伝子のプロモーター領域の解析
    α4の転写産物1と1'のそれぞれのプロモーターの活性を見るためのレポーター遺伝子の設計と作製を行った。当初の計画であるルシフェラーゼ遺伝子を用いた測定に先立ち、CAT遺伝子による解析も進行中である。エキソン1'、エキソン1それぞれの上流の2kbをカバーするゲノム断片をCAT遺伝子につないだコンストラクトを作製した。このコンストラクトに基づき、さらに他のコラーゲン遺伝子の例でも見られるようなイントロン1内の転写調節配列の存在の可能性も含めて、数種類のコンストラクトを現在作成中である。

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  • 基底膜の生物学的機能

    研究課題/領域番号:07044268  1995年 - 1996年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  国際学術研究

    二宮 善文, オウ スーク・ポール, ウオルマン マット, アプラ スニール, 百田 龍輔, 大橋 俊孝, オルセン ビヨン, スーク ポール・オウ, マット ウォルマン, スニール アプラ, ビヨン オルセン, マット ウオルマン

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    配分額:4000000円 ( 直接経費:4000000円 )

    1)マウスライブラリーからα6(IV)cDNAの重複クローンを得、マウスα6(IV)鎖ポリペプチドの全アミノ酸の一次構造を決定することが出来た。その結果、以前に我々が決定したヒトα6(IV)鎖ポリペプチドの全アミノ酸の一次構造と類似であることがわかった。
    2)マウスα6(IV)ポリペプチドのアミノ酸配列より特異抗体を作成し、マウスにおいてもヒトと同じようなα6(IV)ポリペプチドの組織分布を示すかどうかについて検索したところ、基本的にはヒトの分布と類似していた。但し局所においては、例えば腎糸球体基底膜等では多少の分布の相違が観察された。また、他のα鎖との対照的な発現の違いは顕著であった。さらには、対となる遺伝子col4A1/col4a2 col4A3/col4a4 col4A5/col4a6については、いくつかの臓器を除けば、各々同調的な発現様式が観察された。
    (3)α鎖特異的モノクローン抗体を用いた組織分布より、6α鎖が構成する分子種を推定することが出来た。その結果、α1(IV)とα2(IV)、α3(IV)とα4(IV)とα5(IV)、α5(IV)とα6(IV)、そしてα4(IV)のホモトリマ-の四種類の分子種が存在すると思われる。このことは、α鎖特異抗体を用いた二重染色によって、また、アルポート症候群などの遺伝性の疾患の症例を用いて染色することによって確かめることが出来た。
    4)マウスα6(IV)遺伝子の解析を進めたところ、エクソン31の択一的スプライシングが起こっていることを突き止めた。現在この択一的スプライシングが組織特異的に生じている現象か否かを検証している。
    5)ヒトのアルポート症候群に合併する食道下部平滑筋症の症例において、20kb足らずの大きな塩基配列の欠損が検証された。詳細にこの塩基配列の欠損部位を検索すると、COL4A5遺伝子のイントロン1の一部、エクソン1、COL4A5とCOL4A6両遺伝子の上流部分、COL4A6遺伝子エクソン1'、イントロン1'、エクソン1、イントロン1、エクソン2そしてイントロン2の一部が欠失していることが判明した。さらに、イントロン2には、食道下部の平滑筋細胞増殖に関連のある遺伝子の存在が示唆された。現在この平滑筋細胞増殖に関連のある遺伝子の存在を究明しつつある。
    6)ノックアウトマウス作成のため、マウス遺伝子断片よりエクソン2を除き、変りにNeo^R遺伝子を挿入したコンストラクトを構築した。ホモロガスリコンビネーションによってコンストラクトの導入された幹細胞を選択した。このような幹細胞を胚盤胞に注入することによりキメラマウスを作成することが出来た。現在、ヘテロ接合体およびホモ接合体の形質変化の検索を進めている。

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  • 腎糸球体基底膜におけるマトリックス分子構築と遺伝子発現

    研究課題/領域番号:07671251  1995年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  一般研究(C)

    大橋 俊孝, 吉岡 秀克, 二宮 善文

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    配分額:2200000円 ( 直接経費:2200000円 )

    1.マウスα6(IV)鎖遺伝子(col4a6)及びα5(IV)鎖遺伝子(col4a5)上流プロモーター領域遺伝子断片のクローニング
    マウスα6(IV)鎖及びα5(IV)鎖cDNAをプローブとして129SVJマウスのゲノムDNAライブラリーをスクリーニングし、両遺伝子上流プロモーター領域を含むクローンTSg6を分離した。
    2.col4a6及びcol4a5遺伝子発現調節機構の解析
    上記クローンTSg6を解析したところ、col4a5のエキソン1とcol4a6のエキソン1,2が含まれてした。しかしながら、ヒトでみられた第一エキソンの択一的スプライシングはマウスα6(IV)鎖遺伝子ではみられなかった。現在、col4a6上流DNA断片をCAT遺伝子及びLacZ遺伝子に連結したconstructを作製し遺伝子発現調節機構解析を行なっているところである。
    3.col4a6遺伝子のノックアウトマウスの作製
    第1項で得られたcol4a6断片を利用して、col4a6のエキソン2部分にNeo^r遺伝子を挿入し、null mutationの改変を導入するターゲティングconstructを作成した。ES細胞ヘターゲティングconstruct DNAの注入後、サザンブロティングにより相補的遺伝子組換えの起こっているES細胞クローンを選別し、胚盤胞へ注入した。現在、キメラマウスの誕生を待っている段階である。
    4.Alport症候群,(平滑筋腫との合併症),Goodpasture症候群の病因と各α(IV)鎖との関連を調べる。
    ヒトα6(IV)鎖遺伝子の構造解析プロジェクトから決定されたエクソン・イントロン構造を基に、平滑筋腫との合併を伴ったAlport症候群患者の白血球DNAを用いて、α6(IV)鎖遺伝子及びα5(IV)鎖遺伝子の欠失領域の解析を行なっている。両遺伝子のイントロン1にまたがって欠失した症例が発見できた。さらに、細かい欠失部分解析を行なっている。これらの遺伝子解析によりこの症例の病因解析が進展すると期待される。

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  • XI型コラーゲン分子の軟骨及び非軟骨細胞における特異的発現機構の解析

    研究課題/領域番号:07671593  1995年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  一般研究(C)

    吉岡 秀克, 大橋 俊孝, 二宮 善文

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    配分額:2200000円 ( 直接経費:2200000円 )

    私たちはヒトコラーゲンα1(XI)鎖のcDNAプローブを用いて、クロスハイブリダイゼーション法にて重視するマウスα1(XI)鎖をコードするcDNAを得て、その全一次構造を決定した。その結果、予想されるマウスproα1(XI)鎖のアミノ酸は1769個であり、そのN末に35個のシグナルペプチドが存在した。ヒトとのアミノ酸レベルのホモロジーは93%であり、N末、中央螺旋部及びC末の領域構造、N-及びC-プロペプチドのシステイン、及び架橋に関与するリジン等の重要な構造はすべて保持されていた。わずかにマウスのN-プロペプチドにおいてアミノ酸が一個少ないのみであった。
    一方、このcDNAプローブを使用し、マウス胎児期における発現をノーザンブロット法、RT-PCR法及びin situ hybridization法で調べた。その結果、RT-PCR法を用いると11日目胎児にはすでにこの遺伝子の発現がみられた。ノーザンブロット法ではヒトと同様に7.3kb及び6.3kbの転写産物がみられ、18日目胎児では軟骨組織ばかりでなく、脳、皮膚、頭蓋骨の非軟骨組織でも発現していた。さらに、in situ hybridizationを行うと、これらの組織に発現が認められたばかりでなく、心臓弁部、舌骨格筋、大動脈平滑筋、腸管平滑筋、歯芽、耳小胞等にも発現がみられ、この遺伝子が軟骨組織ばかりでなく、広く非軟骨組織にも発現していることが証明された。
    さらに、N-プロペプチド部分はヒト同様、塩基性、酸性及び短い螺旋領域よりなっていたが、酸性領域をコードするエクソンは胎児の軟骨や頭蓋骨においては複雑な選択的スプライシングを受けており、この現象が内軟骨性骨化或は膜性骨化過程に関与している可能性が示唆された。

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  • 基底膜に会合するIV型コラーゲン分子とそれをコードする遺伝子発現の特性

    研究課題/領域番号:06454250  1994年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  一般研究(B)

    二宮 善文, 大橋 俊孝, 吉岡 秀克

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    配分額:7600000円 ( 直接経費:7600000円 )

    本年度施行した研究によって、当初掲げた研究目的の大半を達成することができた.
    1)ヒトα4(IV)鎖のアミノ酸一次構造を決定することができた.
    α4(IV)鎖をコードするcDNAの重複クローンを単離し、ヒトα4(IV)鎖のアミノ酸一次構造を決定することができた.
    2)α6(IV)鎖をコードする遺伝子の上流域の構造決定とα5(IV)遺伝子との関係を明かにした.
    ヒトα6(IV)鎖のアミノ酸一次構造を決定し報告した.さらにこれらのcDNAをもとに遺伝子DNAの構造を決定しつつある.私どもはα6(IV)鎖をコードする遺伝子の上流域にα5(IV)鎖をコードする遺伝子が存在しており、しかもこれらの遺伝子が反対向きに並んでいることをつきとめた.さらに興味あることは、α6(IV)鎖をコードする遺伝子の発現は通常の遺伝子発現と異なって、二つのRNA転写産物が存在することがわかった.このことはおそらくは二つのプロモーターが存在しこれらが組織特異的な発現に関係しているであろうことが想像される.
    3)α(IV)鎖特異的抗体の作製を行いIV型コラーゲン6遺伝子の発現様式を明かにした.
    上述のα4(IV)鎖およびα6(IV)鎖の一次構造より推定される特異抗体を作製に適する部位を同定し合成ペプチドを作製、このペプチドに対するモノクローン抗体を作製した.抗体は各々特異的であり、ウェスタンブロット、各組織の免疫染色法でこれらの特異的なα(IV)鎖の存在部位を特定することができた.その結果α1(IV)およびα2(IV)鎖はすべての基底膜に存在すること、α3(IV)およびα4(IV)鎖は限定された部位にしか発現されないが常にこの二つの遺伝子は同時に発現することがわかった.さらにα5(IV)およびα6(IV)鎖は限定された部位に必ずしも同時には発現しないことがわかった.この部位特異的発現が上述の二プロモーターの存在と関連があることが想像される.

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  • 遺伝性腎基底膜疾患に関するIV型コラーゲンの分子生物学的研究

    研究課題/領域番号:06770869  1994年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  奨励研究(A)

    大橋 俊孝

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    配分額:1100000円 ( 直接経費:1100000円 )

    申請者は本研究の申請時の目的として、1)α6(IV)鎖,α4(IV)鎖遺伝子構造の決定2)遺伝性腎糸球体基底膜疾患の遺伝子変異の検索を掲げた。その結果、
    1)α6(IV)鎖全遺伝子を含む重複クローンを単離し、全遺伝子構造を決定した(文献2,3参照)。さらに、その中の最上流の遺伝子断片の解析により、α6(IV)鎖遺伝子(COL4A6)とα5(IV)鎖遺伝子(COL4A5)はbidirectional promoterにより転写制御され、COL4A6はAlternativeなpromoterによって発現制御されることを初めて報告した(文献1参照)。この結果は、従来知られていたα1(IV)鎖遺伝子(COL4A1)とα2(IV)鎖遺伝子(COL4A2)と同様にその他α(IV)鎖遺伝子でもbidirectional promoterにより転写制御されていることを初めて示したものである。また、Alternativeなpromoterの存在はCOL4A6の組織特異的発現に関与すると推測される。
    2) 1)の結果をもとに、まずα6(IV)鎖遺伝子およびα5(IV)鎖遺伝子の関与する遺伝性疾患の家系解析に有用なマーカーとして(CA)nマーカーを検索した。1)で単離したCOL4A6断片から(CA)n配列を発見し、3つがマーカーとして有効であると判断された(投稿準備中)。また、疾患検索の準備としてPCR-SSCP実験を行なうため、全エキソンをはさむようにプライマーを設計した。これらは遺伝性腎糸球体基底膜疾患のみならず、最近関連性が示唆されたびまん性平滑筋腫の責任遺伝子としてのα6(IV)鎖遺伝子の変異の検索に有効であると思われる。

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  • VIII型コラーゲンの生物学的機能

    研究課題/領域番号:06044154  1994年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  国際学術研究

    二宮 善文, MATT Warman, O;ENA Jacenk, SUNEEL Apte, 大橋 俊孝, 村垣 泰光, BJORN Olsen

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    配分額:2500000円 ( 直接経費:2500000円 )

    これまで私共はEC(Endothelial Cell)コラーゲンとして知られていたVIII型コラーゲンα1およびα2鎖の構造、ヒト染色体上の位置、発現細胞等について調べてきたが、今回は培養内皮細胞による発現様式、培養皮膚ケラチノサイトによる合成、さらにトランスジェーニックマウスによるVIII型コラーゲンのマウスin vivoにおける発現について検討したので報告する.
    ヒト大動脈内皮細胞、帯内皮細胞を酵素処理により細胞を単離し、培養に供し、典型的な内皮細胞を得た.継代を繰り返し、10代程度になると細胞が偏平化する.この細胞を用いて全RNA中のα1(VIII)およびα2(VIII)鎖をコードするmRNAを調べると、生体から単離して培養に供し、細胞が偏平化するまで両遺伝子が発現していることがわかった.さらにI型コラーゲン、III型コラーゲン、V型コラーゲンをコードするmRNAについても発現していることがわかった.またラット腹部大動脈より平滑筋細胞を単離し、培養して数継代目にヘパリンを投与し、平滑筋細胞の産生するコラーゲンを調べたところ、75kDaのサイズの、細菌性コラゲナーゼで消化されるコラゲナーゼ鎖が検出された.これがヘパリン投与することによってコラーゲン鎖の産生は20〜30倍増強される.このコラーゲン鎖の同定については、研究代表者らはVIII型コラーゲンではないかと推測しているが未だ照明はされていない.
    以前の実験でマウスにおいてノザンプロット法でα1(VIII)およびα2(VIII)mRNAが存在することを示したが、今回ヒト皮膚由来のケラチノサイトを培養し、細胞から抽出した全RNAに対してヒトVIII型コラーゲンのプローブを反応させると明かに同じサイズのRNAに反応した.また、マウスの皮膚組織に対してin situハイブリダイゼーションを行うと、皮膚のケラチノサイトに対して強い陽性所見を得た.このことよりケラチノサイトがVIII型コラーゲンの産生細胞であることが判明した.
    VIII型コラーゲン遺伝子がどの組織に発現するかを見極めるための実験としてマウスプロモーター領域をLac Z遺伝しをレポーター遺伝子として接続しトランスジェーニックを作成し、検討を繰り返したところ、いくつかのトランスジェーニックマウスの系統が得られた.系統によってレポーター遺伝子の発現が異なっていたので、今回は直接マウス胎児を用いてin situハイブリダイゼーションを行ったところ、基本的にレポーター遺伝子の発現していた臓器および組織にはすべて強い陽性所見が得られたので、VIII型コラーゲン遺伝子発現をねらったトランスジェーニックマウス実験の正当性が証明された.

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  • 基底膜の組織特異的機能とマトリックス分子の多様性

    研究課題/領域番号:04454564  1992年 - 1993年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業  一般研究(B)

    二宮 善文, 大橋 俊孝, 吉岡 秀克

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    配分額:6900000円 ( 直接経費:6900000円 )

    基底膜の組織特異的機能とマトリックス分子の多様性を知る目的で、私どもは基底膜の重要な構成成分であるIV型コラーゲンの分子とその構成鎖について新しい知見を得ることができた.申請時に述べた目的のうち、α4(IV)鎖ポリプペチドのアミノ酸一次構造はcDNAのクローニングによってほぼ全体が明らかに成りつつある.またこれをコードする遺伝子構造はC末のNC1をコードする4エクソンについては構造が明らかになった.その結果α2(IV)鎖をコードする遺伝子と酷似していることがわかった.この遺伝子の染色体上の位置は染色体2q35-37.1であることがわかった.さらにα4(IV)鎖ポリペプチドをコードするmRNAは他のα(IV)鎖をコードするmRNAと比べ、優位に大きいことが明らかになった.
    特筆すべきことはこのα4(IV)鎖ポリペプチドをコードするcDNAのクローニングの過程で、未知のcDNAを得ることができたことである.つまり上記のα4(IV)cDNAの解析から偶数系列に属し、X染色体に存在するもう一つの遺伝子が存在するかも知れないことを予想していた私どもは、low stringencyの条件で、新しいα6(IV)鎖をコードするcDNAを単離することができた.しかもこの遺伝子がX染色体上に存在するだけでなく、面白いことに、α5(IV)鎖をコードする遺伝子と対になって同じ遺伝子座に、逆向きに存在していることがわかった.またα6(IV)鎖をコードする転写産物は二つ存在し、alternativeに発現開始されるプロモーターが存在することが明らかとなり、α6(IV)鎖とα5(IV)鎖をコードする遺伝子の発現部位と、コラーゲン分子としてどのような鎖構成なのか、さらにはこれらの分子が構築する超分子会合体がどのように組織特異的な基底膜を構成していくかという問題の糸口をつかむことができた.

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担当授業科目

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メディア報道

  • 2023年度(入学生対象)O-NECUS秋季セミナー

    岡山大学HP  2022年11月14日