Research Projects -
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スプライシング因子によるDNA編集酵素の活性調節機構の解明
2023.05 - 2024.09
公益財団法人 日本応用酵素協会 2023年度 酵素研究助成
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\50 （ Direct expense: \50 ）
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スプライシング因子によるDNA 編集酵素の活性調節機構の解明
2022.05 - 2023.09
公益財団法人 日本応用酵素協会 2022年度 酵素研究助成
Authorship：Principal investigator Grant type：Competitive
Grant amount：\100 （ Direct expense: \100 ）
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Antigen affinity-dependent regulation of B cell antigen receptor signaling
Grant number：20K05231 2020.04 - 2024.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
金山 直樹
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
本研究では、抗原レセプターと抗原との親和性に依存したシグナル調節機構を明らかにして、生体内の抗体産生系の新規な細胞選択機構を見し、これを応用して抗原レセプターシグナルの強度を細胞生存シグナルの強度に変換し、生体内での高親和性抗体の高効率な選択機構を模倣する技術を開発する。本研究では、DT40細胞を用いて抗原への親和性に依存した抗原レセプターシグナル調節機構を解明し、この知見を利用した有用な目的抗体の高効率選択技術を開発する。
抗原レセプター刺激に依存して誘導されるNR4A1 (nuclear receptor 4A1)の転写に必要なシグナル経路ついて、前年度明らかにしたCa2+イオンをセカンドメッセンジャーとするシグナル伝達経路の下流シグナル経路について各種阻害剤を用いて詳細に解析した。DT40細胞のNR4A1発現は、カルシウムシグナルのうち、CaMK経路には依存せず、カルシーニューリンとPKCの経路に依存していることが明らかになった。最終的な遺伝子の発現調節領域の同定とシグナル経路の関与も解析を進めている。
抗原レセプター刺激に依存して発現される遺伝子について、公的データベース上のDT40細胞を用いた関連研究のトランスクリプトーム解析データから絞り込んだ遺伝子群を、本研究の実験系においても検証したところ発現誘導される候補遺伝子のこれらの多くは、Ca2+イオンをセカンドメッセンジャーとするシグナル伝達経路に依存し、その下流経路は遺伝子によって異なっていることを見出した。これらがBCRの刺激強度と発現量の時間的変化にどのように関与しているかにについて現在、解析を進めている。 -
Grant number：16K14783 2016.04 - 2018.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
KANAYAMA Naoki
Grant amount：\3770000 （ Direct expense: \2900000 、 Indirect expense：\870000 ）
The affinity of antibodies is improved by somatic hypermutation on the immunoglobulin variable region gene. Although it has been shown that AID is essential for somatic hypermutation, it remains unclear how the AID-dependent mutation machinery works. In this study, functions of SRSF1-3, which is an isoform of the RNA splicing factor SRSF1 and essential for somatic hypermutation, were analyzed using a hypermutating B cell line. Results revealed that SRSF1-3 forms a protein complex with AID, and promotes somatic hypermutation through a mechanism linked to the C-terminal region of AID.
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Improvement of an animal cell-displaying technology by using a splicing factor
Grant number：15H04196 2015.04 - 2019.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Kanayama Naoki
Grant amount：\16640000 （ Direct expense: \12800000 、 Indirect expense：\3840000 ）
We have been developing an animal cell-displaying technology using the hypermutating B cell line DT40. In this study, we elucidated a function of a splicing factor, SRSF1, which we have previously found that is essential for hypermutation of the immunoglobulin gene, and developed a method to increase hypermutation efficiency by manipulation of SRSF1 expression.
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Analysis of a novel role of an RNA splicing factor in somatic hypermutation of the IgV gene
Grant number：26650126 2014.04 - 2016.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
Kanayama Naoki
Grant amount：\4030000 （ Direct expense: \3100000 、 Indirect expense：\930000 ）
In this study, we analyzed molecular mechanisms for SRSF1-3 to contribute to somatic hypermutation of the IgV gene. It is revealed that although isoforms SRSF1 and SRSF1-3 are different only in the C-terminal region, the C-terminal region of SRSF1-3 is not essential for SHM, suggesting that the conserved region might be involved in SHM. In addition, this study indicated that SRSF1-3 may have a role in regulating the nuclear export of AID during SHM processes.
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Antibody engineering in a hypermutaing B cell line
Grant number：24360343 2012.04 - 2015.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
KANAYAMA NAOKI, MAGARI Masaki
Grant amount：\12480000 （ Direct expense: \9600000 、 Indirect expense：\2880000 ）
Antibody is being applied for a next generation molecular targeting drug, and modified versions of antibodies, such as single chain antibodies, are also being developed. We have established an in vitro antibody generation system using a hypermutating chicken B cell line, DT40. In this study, we established a novel animal display system, in which any antibody or antibody variant of interest, even though it is derived from the other technology, can be introduced and expressed as a chimeric antibody with the human IgG1 constant region on DT40 cells, and then can be improved in its affinity with the mutation machinery of DT40 cells. This study will be useful for creating antibodies that have valuable activities as antibody drugs.
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Novel functions of ASF/SF2 in somatic hypermutation on the immunoglobulin gene.
Grant number：23657092 2011 - 2012
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
KANAYAMA Naoki
Grant amount：\3900000 （ Direct expense: \3000000 、 Indirect expense：\900000 ）
The affinity of antibodies for antigens is improved by somatic hypermutation (SHM) occurred on the immunoglobulin (Ig) gene. In this study, using the hypermutating chicken B cell line DT40, we found that an isoform of the alternative-splicing factor ASF/SF2, ASF3 is essential for SHM on the Ig gene. The results also suggest that ASF3 might have a role in the activation and targeting of the mutation machinery through the regulation of post-transcriptional processing on the Ig gene.
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ニワトリB細胞株を利用する抗体の分子進化システムの構築と応用
Grant number：15760589 2003 - 2004
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B) 若手研究(B)
金山 直樹
Grant amount：\3500000 （ Direct expense: \3500000 ）
本研究は、DT40細胞の抗体遺伝子改変能力を利用して、抗体の分子進化システムを構築することを目的としている。昨年度、DT40細胞株において抗体遺伝子への突然変異と遺伝子変換の導入を厳密かつ任意に制御するために、突然変異と遺伝子変換に必須の因子であるAID遺伝子の発現をCre/loxPシステムを用いた遺伝子組み換えによって制御できる細胞株の育種を達成した。この細胞は、導入したCre-ERにより、4-hydroxytamoxyfen(4-OHT)添加時にloxPで挟まれたAIDの発現をON/OFFする。AIDの発現はGFPの発現でモニターし、AID OFFの時はピューロマイシン耐性として選択できる。
本年度、この細胞の変異能力とスイッチ能力について評価した。4-OHTで48時間処理後、48時間追加培養したところ、OFF細胞から平均20%のGFP陽性細胞が出現した。このGFP陽性をセルソーターによって一細胞ずつ分離してAID ON細胞として培養した。2ヶ月間の継続培養後、ほぼすべてがGFP陽性であり、AIDの発現が安定して維持されていることが明らかになった。また、抗体軽鎖遺伝子上に蓄積された変異を解析したところ、解析した24クローン中13クローンで変異が認められ、DT40が本来有している能力に相当するあるいはそれ以上の変異能力を有していた。さらに、ON細胞を4-OHT処理したところ、平均50%のGFP陰性細胞が出現し、ピューロマイシン添加によりOFF細胞のみに純化できた。このOFF細胞から、再度の4-OHT処理でON細胞が出現し、ON細胞の単離、培養、OFF細胞へのスイッチが繰り返し可能であった。すなわち、この細胞を用いて、有用な変異体を取得後、AID OFFにより変異を固定し、再度ONにして抗体遺伝子に二次的変異を導入して改良することが可能になった。 -
Analysis and application of the capability of immune system to improve antigen-specificity of antibodies.
Grant number：12450334 2000 - 2002
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
OHMORI Hitoshi, KANAYAMA Naoki
Grant amount：\12700000 （ Direct expense: \12700000 ）
Recently, peripheral B cells have been shown to undergo secondary V(D)J rearrangement of Ig genes, but the physiological role of this event has not been fully elucidated. Here, we investigated whether rearrangement of L chain genes in the periphery is involved in the generation of high-affinity Abs. To test this possibility, we used a 17.2.25 rearranged VHDJH gene (VHT)-knockin mouse whose B cell diversity is limited due to the expression of the site-directed transgene. Immunization of the mouse with p-nitrophenylacetyl (pNP)-conjugated chicken γ-globulin (CGG) preferentially led to the production of anti-pNP IgG Abs comprised of non-VHT-encoded H chains and λ chains, which constituted a majority of high-affinity IgG to this hapten. We isolated three independent anti-pNP IgG1 mAbs (two bearing λ1 with high-affinity and one bearing κ with low-affinity), all of which used a common VHDJH containing an identical point mutation, thus suggesting that κ to λ1 replacement contributed to an increase of the Ab affinity. RAG-2 mRNA and the recombination signal sequence break reflecting the λ1 gene rearrangement were detected in the draining lymph node (LN) of immunized mice, but not of non-immunized animals. There was a close correlation between the levels of the λ gene rearrangement and λ^+ high-affinity anti-pNP IgG. Thus, our findings suggest that new rearrangement of λ genes in the periphery contributes to affinity maturation of anti-pNP IgG.
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トランスジェニックマウスの成熟B細胞を用いた代替軽鎖の機能解析系の構築と応用
Grant number：12750704 2000 - 2001
日本学術振興会 科学研究費助成事業 奨励研究(A) 奨励研究(A)
金山 直樹
Grant amount：\2200000 （ Direct expense: \2200000 ）
本年度は、平成12年度に確立したin vitro代替軽鎖発現系を用いて、トランスジェニックマウスのB細胞での代替軽鎖の発現について検討し、また、発現細胞の由来について野生型マウスを用いて検討して、以下のような成果が得られた。
1.B細胞レパトアが限定されたトランスジェニックマウスの脾臓B細胞を単離し、anti-CD40抗体およびIL-7で刺激したところ、λ5およびRAG2の発現がRT-PCR荷よって確認された。したがって、in vitroでの代替軽鎖はRAG2の発現は、マウスの系統やB細胞レパトアの大きさに関係なく起こる現象であり、トランスジェニックマウスを用いたin vitroの解析系は代替軽鎖およびRAGの機能解析に適していることが示された。
2.脾臓細胞中において代替軽鎖を発現する細胞集団を同定するため、未熟B細胞に発現する抗原を認識する493抗体でB細胞を分画して、代替軽鎖の発現を検討した。単離細胞中に最初から存在する代替軽鎖発現細胞は、多くが未熟B細胞である可能性が示されたが、それらを除去したB細胞においても、in vitro刺激に依存して代替軽鎖の発現が確認されたことから、末梢成熟B細胞において代替軽鎖が発現していることが示唆された。
今後、このトランスジェニックマウスを用いた代替軽鎖解析系を用いて、末梢B細胞における抗体遺伝子再構成の機構について詳細な検討をする予定である。