配分額：4290000円 （ 直接経費：3300000円 、 間接経費：990000円 ）

α1インテグリン欠損マウスを用いて、lysyl oxidase 阻害薬とアンジオテンシンIIの皮下投与による大動脈解離モデルの作成を行った。α1インテグリン欠損マウスにおける大動脈解離の発生率は有意に対照マウスに比べて低率であった。Ｃ57/ＢＬ6マウスを対照群として、腹部大動脈解離の遺伝子発現について、さらに詳細に検討をおこなったところ、炎症性サイトカイン、細胞外マトリックス分解酵素の発現もα1インテグリン欠損マウスで有意に低値であった。インテグリンα１から下流のシグナルについて、MAPK経路のリン酸化がインテグリンα１に関与していることが明らかとなった。

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配分額：3900000円 （ 直接経費：3000000円 、 間接経費：900000円 ）

黄斑円孔手術において内境界膜弁翻転法のメカニズムを解明した。サル眼の実験的な黄斑円孔に、内境界膜弁翻転法を行うことにより黄斑円孔の閉鎖過程を組織学的に検討した。内境界膜成分である4型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンが、ミュラー細胞（MIO-M1）の機能に与える影響について検討した。さらに、ミュラー細胞、およびヒト内境界膜における神経栄養因子の発現について検討した。これらの結果から、黄斑円孔手術の際に内境界膜はミュラー細胞を活性化させミュラー細胞の増殖及び遊走の足場として働くこと、活性化したミュラー細胞から神経栄養因子が発現されることにより、黄斑円孔の閉鎖に寄与する可能性が考えられた。

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配分額：4680000円 （ 直接経費：3600000円 、 間接経費：1080000円 ）

腹部大動脈瘤は発見されてもその進展を完全に抑制することは臨床上困難であり、一旦破裂するとその予後は極めて不良である。本研究では、腹部大動脈瘤の進展にα１インテグリンという細胞接着因子が関与することを、遺伝子改変ネズミを用いた実験で明らかにした。α１インテグリンが欠損すると、腹部大動脈瘤の破裂が有意に抑制された。α１インテグリンを標的とした新しい治療戦略の基盤となる結果が得られた。

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配分額：4940000円 （ 直接経費：3800000円 、 間接経費：1140000円 ）

本研究では、キサントフィルが網膜内に取り込まれる機構や、網膜の機能に果たす役割を明らかにすることを目的として、網膜を構成する細胞である網膜色素上皮細胞と網膜グリア細胞を用いて、キサントフィルの細胞内への取り込みとその経路、そして細胞の遊走に及ぼす影響について検討した。ルテインは濃度および時間依存性に細胞内に取り込まれることが明らかになった。既知のルテイン輸送経路を阻害してもルテインの取り込みに有意な変化はみられなかった。また、ルテインは細胞遊走に対して有意な影響を及ぼさなかった。今後、細胞内ルテインの代謝とルテインの役割について詳細に検討することが課題と考えられた。

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配分額：4810000円 （ 直接経費：3700000円 、 間接経費：1110000円 ）

大規模塩基配列計画のデータベースの検索より筋肉で発現している約千の遺伝子の中から候補となる受容体を数十に絞り込んだ。現在、その解析を進めている。また変異動物の組織学的な解析、細胞生物学的な解析により、XV/XVIII型コラーゲン変異個体では細胞骨格に大きな構造変化が起きていることがわかった。抗XV/XVIII型コラーゲン抗体の検索と反応条件の検討の結果、固定標本に対しても反応する条件を確立し、患者標本を用いて未知のXV/XVIII型コラーゲン関連ヒト疾患の検索を行った。現在、これらの結果をまとめている。

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配分額：4940000円 （ 直接経費：3800000円 、 間接経費：1140000円 ）

ヒト大動脈瘤組織におけるCD44の発現と細胞外マトリックス分解の関連の検討ならびに、腹部動脈瘤モデルを用いたCD44を介する炎症性遺伝子ネットワークの解明を行い、CD44が慢性炎症におけるヒアルロン酸分解産物によるシグナル伝達に重要な分子であることが明らかとなった。それによって、CD44を標的とした分子イメージングならびに薬物送達システム開発への基礎を固めることができた。

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配分額：5330000円 （ 直接経費：4100000円 、 間接経費：1230000円 ）

網膜色素上皮細胞（RPE）は網膜の恒常性を維持する多彩な生理機能を有しており、加齢黄斑変性では、加齢に伴うRPEの機能低下によって網膜の恒常性が破綻し、血管新生、網膜障害が起こり、視力が低下する。本研究では、ARPE-19とヒトiPS由来RPEに対して、慢性酸化ストレス負荷によってRPEの老化を誘導し、老化に伴うRPEの機能の変化を明らかにした。また、炎症モデルを用いてRPEの上皮間葉転換を誘導し、AMPKの活性化がRPEの上皮間葉転換を阻害することを明らかにした。

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配分額：19240000円 （ 直接経費：14800000円 、 間接経費：4440000円 ）

血液-脳関門の破綻や脳小血管の出血に基底膜の機能の異常が関与すること、及び、その分子機構を明らかにすることを目的とした。我々は、マウス静脈内に腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）を投与し、血液-脳関門の破綻を誘導する脳炎モデルを作製した。そして血液-脳関門の破綻および基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンの変化についてWestern blot法および免疫組織染色法を用いて継時的に解析を行った。解析の結果、継時的にＩＶ型コラーゲンは限定的に分解され、血液-脳関門の破綻と関連性のあることが示唆された。

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配分額：4420000円 （ 直接経費：3400000円 、 間接経費：1020000円 ）

アストログリアは脊髄損傷領域の周囲にグリア境界膜を形成し,組織修復に重要な役割を担うと考えられる.本研究では脊髄損傷モデルにおいて境界膜が炎症細胞浸潤の抑制に関与し,また炎症細胞の浸潤の拡大に血管周囲腔が関与することを明らかにした.また境界膜の成分のひとつ,IV型コラーゲンはアストログリアに対し,トロンボスポンジン-1の発現を増加させることを明らかにし,組織修復に促進的に働く可能性を示した.

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配分額：3300000円 （ 直接経費：3300000円 ）

整形外科において骨や手術時に挿入した人工物におこる感染症はしばしば難治性である。この難治性にはバイオフィルムが関与すると言われており、バイオフィルムは抗生剤の効果を減少させ、残存すると感染を再燃させる。マイクロバブルは下水管の洗浄や半導体におけるシリコンウエハーの洗浄に利用されている。マイクロバブルの粒径はバイオフィルムの狭間よりも小さく、バイオフィルムの除去に有用とされる。
昨年度明らかとなったバイオフィルム形成能が高い黄色ブドウ球菌を用いて、バイオフィルムの作成と洗浄の実験を行った。整形外科感染症のモデルとしてポリフィラメントの繊維成分を当初は用いていたが、慢性骨髄炎など生体骨内の環境を再現するためには不十分であったため、連通孔を有する人工骨にバイオフィルムを作成するモデルの検討を行った。連通孔を介して深部にまでバイオフィルムを作成するために陰圧下で培地を浸潤させること、培地にグルコースを混ぜることにより安定したバイオフィルムが作成可能であった。このバイオフィルムを作用させた人工骨を動物に移植することで容易に慢性骨髄炎モデルとすることができた。
また,昨年度から開発を進めてきたマイクロバブル発生装置については、条件の最適化や効率的な発生方法の検討を行ったが、マイクロバブルの持続時間が短かったため洗浄、滅菌が困難であった。そこで人工骨に作成したバイオフィルムのモデルに対してマイクロバブルの洗浄が有用かを検討するために、滅菌状態は維持できないがマイクロバブルを長時間安定して供給できる器械をレンタルし、洗浄実験を行い一定の効果を得た。
今後はオゾンを含有させたマイクロバブルでのin vitroでの洗浄実験と、in vivoでの洗浄実験を行い、臨床応用への研究を継続していく予定である。

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配分額：14400000円 （ 直接経費：14400000円 ）

脳実質内の毛細血管の連続した構造体fractoneを構成する分子の解析を行なった。また、マウス脳室下帯より神経幹細胞の同定と分離、さらにはその分化の制御機構を解析することを試みた。
[1]新しい基底膜様構造フラクトンの分子細胞生物学的解析
基底膜分子に特異的抗体を用いて免疫染色をすると、fractone構造にはラミニン、IV型コラーゲン等の分子が存在することが明らかとなった。しかし、それらの各鎖の分布には偏りが認められた。基底膜の周りに存在するfibronectinはfractone特有の染色像を示さなかった。脳や脊髄におけるfractoneの分布について調べたところ、脳室のほぼ全周に分布していたが、第三脳室の一部、第四脳室の一部では存在していなかった。また、このfractone構造は生後すぐの脳室周囲では観察されず、生後7日目から現れはじめ、生後14日目では脳室の外側壁に偏った分布を示した。さらに、特異抗体を用い免疫電子顕微鏡による解析を行ない、fractone構造に基底膜分子が存在することを認めた。
[2]マウス脳室下帯より神経幹細胞の同定と分離
成体マウス脳室下帯より神経幹細胞の分離を試みた。分離した神経幹細胞の基本的培養条件の設定を行い、bFGFなどのサイトカインを付加した接着性基質上での単層培養条件において、ニューロンへの分化誘導、アストロサイトへの分化誘導を試みた。さらに、マトリックス基質の調整のための基礎的な実験を行なった。
[3]in vitro細胞培養系を用いた細胞外マトリックスによる神経幹細胞の分化制御
成体マウスと胎児期マウスの側脳室壁神経幹細胞の分離を行い、安定したneurosphereを得ることができるようになった。また、増殖因子の除去を行ってから単層培養を行ない各種に基質上で細胞の分化誘導の解析の条件設定ができるようになった。

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配分額：3400000円 （ 直接経費：3400000円 ）

中枢神経系疾患では血液脳関門(BBB)の破綻を伴うがその分子機構はよく分かっていない.本研究は,中枢神経系疾患動物モデルを作製し,グリア境界膜の破綻とBBB破綻との関連性,さらにその破綻によって発現変化をきたす分子について解析し,グリア境界膜のBBBに対する重要性およびその形成と維持の分子メカニズムを明らかにすることを目的とした.本研究の成果によってグリア境界膜の働きが血液脳関門に重要であると示唆され,外傷モデルにおける血液脳関門不全が生じるメカニズムの一つを見出した.
1,中枢神経系疾患モデルの作製
外傷モデルとして「マウス脳凍結損傷モデル」及び「マウス脊髄損傷モデル」を確立した.
2,脊髄損傷モデルにおけるグリア境界膜の組織学的な解析
損傷組織の経時的な変化を組織染色,免疫組織染色によって解析した.limitrinは損傷後に速やかに消失し,壊死組織周辺の組織修復に伴いグリア境界膜への局在が回復した.さらに他のグリア境界膜構成分子についても観察した.これらの結果から,損傷によってグリア境界膜は破綻し,その後,修復されると示唆された.またグリア境界膜の構成単位である基底膜構築も変化し,血液脳関門不全の兆候を伴うことが明らかとなった.
3,limitrin遺伝子破壊マウスの作製と表現型解析
上記研究の結果からグリア境界膜の機能に重要と示唆された分子の一つである,limitrinの遺伝子破壊マウスを作製し,表現型解析を行った.

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配分額：15000000円 （ 直接経費：15000000円 ）

1 新しく発見したアグリカナーゼ遺伝子の発現検討
IL-1β刺激後した、培養軟骨肉腫細胞株・ヒト軟骨細胞・ヒト線維芽細胞よりそれぞれmRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCRにて、各アグリカナーゼの発現を定量的に比較検討を行った。線維芽細胞におけるADAMTS-9の発現増加と比較して、軟骨肉腫細胞株および軟骨細胞におけるADAMTS-9の発現増加は大であり、この新規アグリカナーゼは関節においてサイトカイン刺激で大きく誘導される遺伝子であることが明らかとなった。さらに、TNF-αとIL-1βの同時刺激により、ADAMTS9は相乗的に発現が増加することも明らかとなった。ADAMTS-9のmRNA発現レベルは他のどのADAMTSよりも強力であった。
2 アグリカナーゼに対する特異的抗体
ADAMTS-9に対するポリクローナル抗体を作成し、ウエスタンブロット法にて予想通りのサイズのバンドが得られた。IL-1β刺激後一過性にADAMTS-9タンパクが発現することが確認された。本抗体はWestern blotで利用可能であるが、免疫染色にはアフィニティカラムによる更なる精製などが必要と結論された。
3 アグリカナーゼノックアウトマウスの作製
海外共同研究にてES細胞への組み込みが終了しヘテロマウスの段階となった。
4 アグリカナーゼの誘導機構の解明
MAP kinase情報伝達経路の阻害剤(PD98059,SB203580)を添加し、IL-1β刺激による同経路のリン酸化がADAMTS-9の誘導にどう関与しているかを明らかにした。

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配分額：2800000円 （ 直接経費：2800000円 ）

血管新生を抑制するマルチプレキシンコラーゲンの性質を調べる意味で、以下の実験を行い、結果を得ることが出来た。マルチプレキシンコラーゲンの一つであるXVIII型コラーゲンは、そのカルボキシル末端の約250アミノ酸残基のNCドメインの中にはエンドスタチンとよばれ、腫瘍の周囲の血管新生を抑制することが1997年に初めて報告されてから、有望な抗がん作用を示す薬剤になりうる可能性を秘めていると思われて来た。しかしながら、いくつかの研究グループはその部分のペプチドに再現性を認めず、その作用機序を含め未解決の部分は多い。そこで、今回私どもは、XVIII型コラーゲンを多く産生する肝臓細胞株を探し出し、それをヌードマウスに打つことによって作られる腫瘍塊を作成した。そこで、XVIII型コラーゲンに特異的モノクローン抗体を担癌マウスに接種することにより、癌塊が増悪腫大するかどうかを観察することとした。その結果、この特異的モノクローン抗体はがん細胞をアポトーシスに導くことなく、肝癌の容積の増大を認めた。しかしながら、この特異抗体だけでは腫瘍細胞の増殖を促進することはなさそうであった。これらの結果は、エンドスタチンの抗腫瘍効果を支持する重要な所見であり、それだけでなく今回使用したものクローン抗体は、特異的にXVIII型コラーゲンに反応し、エンドスタチンの抗腫瘍効果を抑制することにまで至ったものであり、重要な知見であると思われる。

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配分額：14100000円 （ 直接経費：14100000円 ）

この2年間で私どもは、血液脳関門に関係すると思われる新規遺伝子リミトリンを同定し、これが血液脳関門と関係することを支持する結果を得た。私どもは、脳毛細血管系より脳以外血管系を引き算するという方法でcDNAsを単離し、ノーザンブロット法、シーケンス検索、等により脳毛細血管系に特異的cDNAsを選出した。さらに、数種類のクローンにつきアミノ酸配列を基に抗ペプチド抗体を作成し、その分布を調べると、ある抗体はマウス脳においてグリア境界膜に特異的に染まった。マウス脳の血管周囲グリア境界膜と脳表面グリア境界膜の両方のグリア境界膜に特異的に染まったため、私どもはこのcDNAが由来するタンパク質を、リミトリンと名付けた。このリミトリンは、膜貫通ドメインを有し、更にインムノグロブリンドメインを二つ持つため、インムノグロブリンスーパーファミリーに属することがわかった。In vivoでアストロサイトが産生することが予想され、免疫電子顕微鏡的観察によって、そのことが確認された。さらに、培養アストロサイトが大量にリミトリンを産生することも確認できた。生体脳では、血液脳関門が機能するのは脳実質内の毛細血管であるが、総ての毛細血管周囲で機能している訳ではなく、脳実質内の、いくつかの場所においては血液脳関門が機能していない場所がある。私どもはこれらの正中隆起やsubfornical organ等の場所においてリミトリンが発現しているかどうかを調べると、陰性であった。さらに、マウス脳実質損傷を作成し、その治癒過程でのリミトリン遺伝子の発現を観察すると、まず脳実質の損傷とともにリミトリンは発現停止し、その治癒過程では、損傷部位周辺の毛細血管新生とともにリミトリンが発現してくることを検知した。この現象は、リミトリンは血液脳関門の生理機能と直接関わっている可能性があるということが推測された。

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配分額：14000000円 （ 直接経費：14000000円 ）

1.リアルタイムPCR法によるADAMTS遺伝子の発現
岡山大学にて樹立されたヒト軟骨肉腫由来細胞株(OUMS-27)をインターロイキン(IL)-1β刺激下に培養し、ADAMTS遺伝子の発現を検討した。刺激後、6,12,24,48時間と経時的に細胞からmRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCRを行い、各ADAMTSの発現を定量的に比較した。内部標準コントロールとしてGAPDHを用いた。ADAMTS-1,2,3,4,5,6,7,8,9のプライマー設計及びリアルタイムPCRの条件設定を行った。アグリカナーゼとしては、ADAMTS-1,4,5が報告されているが、ADAMTS-1,4,5それぞれのOUMS-27細胞におけるIL-1βに対する反応は異なっていた。
また、細胞内情報伝達系の解析を行ったところ、MAPK-JNK pathwayが関与していることが明らかとなった。
2.特異的抗体の作製
ADAMTS-1に対する特異的抗体を2種類作成した。ADAMTS-1の2箇所のペプチドを抗原として家兎に免疫し、抗体を得た。特異性の評価は、IL-1β刺激していない培養OUMS-27細胞からタンパクを抽出し、ウエスタンブロッティングで行ったところ、約100kDaと70kDaのところに各一本ずつ明瞭なバンドを認めた。既報の通り、自己プロセッシングを受けているものと推察された。
3.ノックアウトマウス
海外共同研究者との間で、ノックアウトマウス作製を計画し、ES細胞への組み込みが完了した。

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配分額：2000000円 （ 直接経費：2000000円 ）

ADAMファミリーのうち、ADM-10とADAM-17はαセクレターゼ機能を持つことが知られているが、ADAMTSが同様な機能を持つか検討した。
まず、基礎的実験としてADAMTS-1はその遺伝子発現がリポポリサッカライド刺激により、各臓器において発現が上昇することから炎症において何らかの役割を持つことが示唆されている。そこで、ラット実験的心筋梗塞モデルを用いてADAMTS-1の発現形式をノーザンブロット法にて検討した。ADAMTS-1は非梗塞心臓では弱い発現しか認めなかったが、梗塞心においては、梗塞後6時間でその発現が大きく上昇していた。
マウス脳におけるADAMTSの発現をADAMTS-1〜7において検討したが、いずれもそれほど強くなかった。海外共同研究として、アミロイド前駆体蛋白を強制発現し、恒常的に発現する細胞株を樹立している、アラバマ大学Fukuchi教授らと共同実験を開始した。同細胞株は、通常の神経系細胞よりも過剰にアミロイド前駆体蛋白を発現している。これまでの検討によって過剰なアミロイド蛋白前駆体が細胞表面及び培養上清中に存在することが確認された。この実験系において過剰なアミロイド前駆体の切断がαセクレターゼによって制御されているかどうかを検討する目的でこの細胞系におけるαセクレターゼ発現の検討を開始した。実験の条件検討が複雑であり、切断の確認は困難であった。今後は、In vivoの系における実験系の確立およびアルツハイマー脳におけるADAMTSの発現解析が重要と考えられた。

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配分額：14700000円 （ 直接経費：14700000円 ）

1)Ten-m2特異的抗体の作製:Ten-m2 C末のアミノ酸配列から合成されたペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製した。他のTen-mの組み換え蛋白または組織切片染色により特異性は確認された。併せて他のTen-m蛋白に対するモノクローナルあるいはポリクローナル抗体を作製し、脳での発現を調べた。胎生期のTen-m2の発現に関しては他Ten-m遺伝子の発現とwhole mount in situで比較検討
2)マウス脳におけるTen-m2リガンドの検出:申請書に記述したTen-m2細胞外ドメイン組み換え蛋白をHEK293細胞に発現させ、脳抽出液よりリガンドの検索を行った。Ten-m2細胞外ドメインに結合する蛋白のバンドをSDS-PAGEにて確認しているが、同定は行われていない。
3)ヒトTen-m2遺伝子染色体座マッピング:G3 RHパネルにより、Ten-m2,3,4各遺伝子はそれぞれ5,4,11番染色体に位置することを明らかにし、OMIM等によりその遺伝子座にマップされた遺伝性疾患があるかどうかを検索したが、重要な候補は存在しなかった。
4)Ten-m2ノックアウトマウスの表現型解析:(1)II型膜貫通蛋白であるTen-m2の膜貫通ドメインに相当するエキソンにネオマイシン遺伝子断片を挿入することによりTen-m2ノックアウトマウスを作製した。現在、関連Ten-m遺伝子の発現、組織レベルの異常、phenotypeについて観察中である。Ten-m2遺伝子は確かにノックアウトされていることはmRNAレベル、タンパク質レベル両方共に確認された。胎児期E10.5以降に頭部に発現していることから胎児期の頭部発達に異常が見られる可能性も考えられたが、組織レベルではその異常は見られていない。(2)生後脳の成熟に伴う組織上の異常があるか野生型と比較を行ったが明らかな違いは見られなかった。申請時に計画したMonbaertsらの匂い受容体遺伝子(P2)ノックインマウスとの交配に入る前に神経軸索特異的タンパク質MBPの抗体染色により検討を行った.(3)他Ten-mファミリー遺伝子の機能的代償の可能性について、研究初年度に作製した各遺伝子特異的ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を使用して検討を行ったが有意な違いは認められなかった。
5)マウス脳におけるTen-m2リガンドの検出:(1)Ten-mファミリータンパクの細胞外ドメインは既存のタンパクのドメイン構造にホモロジーが少ない構造上ユニークなものと考えられ、その構造解析はリガンド検出に重要である。4メンバー全部をHEK293細胞で発現させ、電子顕微鏡観察すると全てジスルフィド結合を介した二量体を形成していることが分かった。論文作製中である。(2)匂上皮の投射には細胞外マトリックス分子が関与する可能性があるとされ、リガンド候補分子としてCSPG(コンドロイチン硫酸プロテオグリカン)を想定し発現解析関連遺伝子のクローニングを行った。その結果、ヒアルロン酸結合新規脳リンクプロテインをクローニングし、発現について論文化することができた。

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配分額：8200000円 （ 直接経費：8200000円 ）

基底膜の機能解析に関する三年間の研究結果として次のような研究結果が得られた。
1)Col4a遺伝子発現停止マウスの解析を行うことにより、α(IV)鎖の生体内における生物学的機能について推測することが出来た。col4a3遺伝子のノックアウトマウスを入手したのでこのマウスの解析を行なうことにより、IV型コラーゲン遺伝子の機能を解析する方法論を設定できた。また、他のcol4a遺伝子ノックアウトマウスの作成を新たに開始したので、IV型コラーゲン遺伝子の発現を完全に停止したマウスの表現系の解析が可能になった。
2)IV型コラーゲン分子の会合体様式の解析
新しい解析方法、コラーゲン部分を細菌コラゲナーゼで分解し、NC1ヘキサマー解析を、未変性コラーゲンを認識する特異的モノクローン抗体を用いた免疫沈降と、変性したコラーゲン鎖を認識する特異的モノクローン抗体を用いたウエスタンブロット解析により、生体内での高分子会合体様式の解析に成功した。その結果、腎糸球体ではα3α4α5鎖によるネットワークとα1α2によるネットワークが別々に構築されていることが分かった。他に平滑筋細胞周囲基底膜の解析も行ない、こちらはハイブリッドネットより構築されていることが分かった。
3)腎糸球体基底膜の解析によりその特異機能はα3α4α5鎖によるネットワークによることが明確になったが、同様のα3α4α5鎖会合体が脳脈絡叢基底膜にも存在することを明らかにした。これは上衣細胞が産生し、血液成分の濾過を行なうための基底膜のfiltration機能と大きく関わりあうことが判明した。

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配分額：13900000円 （ 直接経費：13900000円 ）

1)血管内皮細胞培養系での低酸素状態でのXVIII型コラーゲンの生合成変化
ヒト毛細血管内皮細胞および周辺細胞の培養系で、XVIII型コラーゲン遺伝子の発現を調べると、共に正常酸素濃度に比べて、低酸素状態ではXVIII型コラーゲン遺伝子の発現は、RNAでも蛋白レベルでも優位に低下していることが分かった。
2)In vivoにおけるエンドスタチン投与によりChondrosarcomaの縮小効果
ヌードマウスにヒトリコンビナントエンドスタチン(50μg/kg/day)を腫瘍周辺に三週間投与することによって、明らかにchondrosarcomaの増生が抑えられた。しかしながら、chondrosarcomaのcell lineであるOUMS-27の細胞培養系では、0-100ng/mlの濃度で投与したリコンビナントヒトエンドスタチンの増殖抑制効果、遊走活性に変化はなかった。bFGFおよびVEGFで活性化したHUVECの遊走活性は、エンドスタチンによって阻害された。エンドスタチンはI型コラーゲン上での血管内皮細胞の遊走活性、接着活性は阻害したが、増殖活性には影響がなかった。
3)XVIII型コラーゲンとXV型コラーゲンの血管基底膜上での発現部位の相違
XVIII型コラーゲン遺伝子の翻訳産物は、血管基底膜に認められた。アミノ酸配列、ドメイン構造が似ているXV型コラーゲンも同様に、血管基底膜に認められる。しかしながら、局在は微妙に違っていた。平滑筋細胞周囲基底膜にはどちらかもしくは両コラーゲンが存在したが、毛細血管周囲基底膜は、臓器組織によって、両方のコラーゲンもしくはXVIII型コラーゲンのみが存在した。このことは、両コラーゲン遺伝子の生理学的機能と関連があるかもしれない。

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配分額：2000000円 （ 直接経費：2000000円 ）

1 血管系特に毛細血管全体におけるXVIIIコラーゲンおよびXVコラーゲン遺伝子の発現
両コラーゲンは内皮細胞直下基底膜と血管壁に存在する平滑筋細胞周囲の基底膜であることがわかった。毛細血管内皮細胞下基底膜ではXVIII型とXV型を共通に発現するものが認められる.即ち腎や小腸粘膜、皮膚の毛細血管の内皮細胞下基底膜はXVIII型/XV型両者が共存する.しかしこれは組織臓器により異なり、肺胞壁、肝類洞、糸球体基底膜はXVIII型が主であり、他方胎盤、心臓、骨格筋、小腸筋層ではXV型が主であった.しかし、XVIII型/XV型両者の発現のない毛細血管は認められなかった.このように、毛細血管内皮細胞下基底膜のXVIII型とXV型の発現には多様性がある、XVIII型とXV型ともに発現するものが基本だが、類洞や糸球体基底膜のように特殊化した毛細血管ではXVIII型が優位に発現された.
2 基底膜IV型コラーゲンの新しい機能
IV型コラーゲンのα鎖は6種類あり、中央にコラーゲン部分、N末(NC2ドメイン)とC末(NC1ドメイン)に非コラーゲンドメインを有する。私達は、これらの6種類のα鎖のNC1ドメインをリコンビナントで作製し、これらを用いて血管内皮細胞の接着性と走化性をみたところ、α2、α3、α6鎖NC1ドメインにそれを抑制する活性が認められた。さらに、血管内皮細胞の接着と走化性はインテグリンαvβ1依存性であることが分かった。鶏胚の系(CAMアッセイ)でbFGFによって誘導された血管新生が、明らかにコントロールとくらべて優位に、リコンビナントα2、α3、α6鎖NC1ドメインによって抑制されるという結果を得た。このことは初めての報告であり、IV型コラーゲンの断片に新しい機能があることが明らかになったという意味で意義のある発見である。

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配分額：12900000円 （ 直接経費：12900000円 ）

私達は、上皮細胞/内皮細胞とマトリックスとの間に存在する基底膜を産生し、細胞とマトリックスとの間に挿入することによって、生体内と同じ構成の人工臓器を作製することを究極の目的とする。本研究では、IV型コラーゲンのα鎖構成分子作製のための基礎研究を行なってきた。
・平滑筋細胞周囲基底膜分子構成が臓器により異なる。臓器特有機能と相関する可能性がある。
・COL4A3とCOL4A4遺伝子の上流域の構造と発現制御の問題を、ヒトの遺伝子について解析し、二つの転写産物が二つのプロモーターから発現されていることを明らかにした。
・ウシ卵巣廬胞周囲の基底膜分子構成が発育段階によって異なってくることを示した。
・細胞培養系においてα1(IV)鎖とα2(IV)鎖の生合成を調べたところ、特にα2(IV)鎖がProMMP-9と相互作用していることをが明らかになった。
・正常乳腺上皮細胞と、癌化した上皮細胞下基底膜のIV型コラーゲン分子構成を見ると、正常ではα1/α2とα5/α6分子であるのが、癌化、浸潤度、悪性度によって分布が異なることが分かった。
・COL4A5遺伝子に変異が認められているイヌAlport症候群の例をを観察すると、mRNAレベルではα5(IV)鎖が減少しているのにα6(IV)鎖は正常と比べ変化がないが、タンパク質レベルでは両α鎖共に欠如している事が分かった。α6鎖産生が別の機序で行なわれ、α5/α6分子を形成している可能性を示していることが分かった。
・上皮細胞直下基底膜の分子構成が臓器により異なる。臓器特有機能と相関する可能性がある。
・複数のIV型コラーゲンのNC1ドメインには、血管新生を抑制する活性があり、腫瘍増生を抑えることを初めて示した。
・LMX1B遺伝子の変異で生じるNail patella症候群では腎糸球体基底膜に異常が起こるが、Lmxlb(-/-)マウスでは腎糸球体においてα3(IV)鎖とα4(IV)鎖が減少していることを突き止めた。さらにこの転写因子であるLMX1BがマウスとヒトのCOL4A4遺伝子の第一イントロンのエンハンサー様配列に結合するだけでなく、発現を上昇させることを明らかにした。

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