Research Projects -
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Molecular mechanisms of plant redox signaling that are mediated by reactive carbonyl species
Grant number：24H00504 2024.04 - 2027.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
真野 純一, 伊藤 隼哉, 村田 芳行, 梅澤 泰史, 仲川 清隆, 武宮 淳史, 松井 健二, 山内 靖雄
Grant amount：\28470000 （ Direct expense: \21900000 、 Indirect expense：\6570000 ）
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Identification of reactive carbonyl species receptors that regulate stomatal movement
Grant number：24KF0062 2024.04 - 2026.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for JSPS Fellows
村田 芳行, RHAMAN MOHAMMAD
Grant amount：\2000000 （ Direct expense: \2000000 ）
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Regulation of cytosolic alkalization and calcium elevation in guard cells
Grant number：22KF0267 2023.03 - 2025.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for JSPS Fellows
村田 芳行, 村田 芳行, ARIF MD. TAHJIB UL, ARIF MD. TAHJIB UL
Grant amount：\2300000 （ Direct expense: \2300000 ）
植物は、種々のストレス刺激によって気孔を閉口させる。アブシシン酸とジャスモン酸は、その気孔閉口に深く関わる植物ホルモンである。アブシシン酸とジャスモン酸は、孔辺細胞内のカルシウム濃度上昇や細胞質アルカリ化を引き起こし、その下流でのアニオンチャネル（S型、R型）やカリウムチャネルの活性化や不活性化を起こし、気孔閉口を誘導する。しかし、そのカルシウム濃度上昇と細胞質アルカリ化の制御機構は十分に明らかにされていない。本研究では、１）カルシウム濃度上昇と細胞質アルカリ化における細胞膜（原形質膜と液胞膜等）に存在するATPaseとPPase等のプロトン輸送体の役割、２）アニオンチャネルやカリウムチャネルの活性化や不活性化における細胞質アルカリ化の役割、３）アニオンチャネルの活性化によるカルシウム濃度上昇パターンの制御を明らかにすることを試みた。
種々の変異体を用いて、気孔閉口、細胞質アルカリ化、細胞内カルシウム上昇、アニオンチャネル活性、カリウムチャネル活性への影響を解析した。 -
活性カルボニル種とグルタチオンによる気孔閉口信号伝達の二次元的制御
Grant number：23K23569 2022.04 - 2026.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
村田 芳行, 宗正 晋太郎, 中村 俊之
Grant amount：\17810000 （ Direct expense: \13700000 、 Indirect expense：\4110000 ）
Islam (2016)らの方法に従い、サリチル酸処理した孔辺細胞または葉の表皮で生成した活
性カルボニル種を2,4-dinitrophenylhydrazineで標識後、HPLCで定量し、サリチル酸信号伝
達における活性カルボニル種の産生動態を解析した。アクロレインやHNEなど主要な活性カルボニル種の生成を検出した。また、活性カルボニル種消去剤や消去酵素（アルケナールリダクターゼ）によって、気孔閉口が阻害された。NADPHオキシダーゼ由来の活性酸素種をセカンドメッセンジャーとするアブシシン酸信号伝達やジャスモン酸信号伝達と同様に、アポプラスト（細胞壁）ペルオキシダーゼ由来の活性酸素種をセカンドメッセンジャーとするサリチル酸信号伝達においても活性カルボニル種が関与することを明らかにした。気孔閉口信号伝達を統合する因子として、活性カルボニル種が機能していることを明らかにした。また、アブシシン酸誘導気孔閉口ならびにジャスモン酸誘導気孔閉口と同様にサリチル酸誘導気孔閉口においても孔辺細胞内グルタチオンが気孔閉口を負に制御していることを明らかにし、その結果の一部をBiosci. Biotech. Biochem. (2022）に発表した。
また、サリチル酸処理した孔辺細胞で生成する活性カルボニル種の一つであるアクロレインを、蛍光色素アクロレインレッドで染色し、蛍光顕微鏡下で時空間的な活性カルボニル種（アクロレイン）生成の特徴を解析している。また、同時にDNPHによる測定結果との比較を行っている。 -
活性カルボニル種とグルタチオンによる気孔閉口信号伝達の二次元的制御
Grant number：22H02303 2022.04 - 2026.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B)
村田 芳行, 宗正 晋太郎, 中村 俊之
Grant amount：\17810000 （ Direct expense: \13700000 、 Indirect expense：\4110000 ）
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植物における代謝とストレス応答の調和の取れた成長を可能にする新たなシグナル分子
Grant number：21K19087 2021.07 - 2024.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽) 挑戦的研究(萌芽)
村田 芳行
Grant amount：\6500000 （ Direct expense: \5000000 、 Indirect expense：\1500000 ）
気孔の開閉は、植物が陸上で生育する上で極めて重要である。その運動は、植物ホルモンによって制御されているが、リンゴ酸によっても制御されています。本研究では、リンゴ酸が誘導する気孔閉口における原形質膜アニオンチャネルSLAC1の細胞外リンゴ酸感知機構の完全解明を進めている。
アフリカツメガエルの卵母細胞を用いた実験より、リンゴ酸が直接SLAC1を活性化していることを明らかにした。また、リンゴ酸は、孔辺細胞内のカルシウム濃度上昇を引き起こし、カルシウム依存性の信号伝達経路を活性化することを明らかにした。これらの結果から、これら両方の経路を介して、気孔閉口を誘導していることを示す知見を得た。また、SLAC1のリンゴ酸感知にかかわると予想されるにドメインの絞り込んだ。 -
イネの穂数と稔実歩合に関与する耐塩性遺伝子の作用機構と集積効果の解明
Grant number：20H02969 2020.04 - 2024.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(B) 基盤研究(B)
平井 儀彦, 冨田 朝美, 村田 芳行
Grant amount：\17940000 （ Direct expense: \13800000 、 Indirect expense：\4140000 ）
塩害地におけるイネの収量向上のためには，長期塩条件での収量形質に関する耐塩性機構および関連遺伝子の解明が必要である．そこで，コシヒカリの遺伝的背景に第2染色体の一部がIR64 の染色体に置換された系統の SL2007とコシヒカリを交配して得られた後代系統を用いて，長期塩条件下での収量形質に関わるQTL解析を行った．その結果，第2染色体上に精籾重および穂数に対するQTLが検出され，精籾重に関するQTLは2.5Mbの領域に，穂数に関するQTLは0.6Mbの領域に絞り込まれた．さらに精籾重の維持に関わるQTL領域の絞り込みを行ったところ，同領域に出穂期関連遺伝子が含まれ，準同質遺伝子系統間で出穂日のずれが生じ，開花期の稔実に関わる生理的実験，ならびに耐塩性候補遺伝子の検討が困難であった．
また，コシヒカリの遺伝背景にノナボクラ由来の穂数の維持に関わる染色体領域で組換えが生じた系統を用いて，QTL領域の絞り込みと遺伝子の発現解析を行った結果，明確な候補遺伝子が見いだせなかった．そこで，過去のQTL解析の再検討を行った結果，推定されたQTL領域はこれまで解析をしていない領域を含む約2.5Mbであることがわかった．このため，この耐塩性領域の絞り込みに向けて，準同質遺伝子系統を複数作出した．
また，イネの耐塩性に関わる生理的要因の検討するため，様々な塩条件下で生育させ，植物体のイオン含有率と生育および枯死との関係を調べたところ，植物体のCl-含有率は，生育と枯死部割合と密接に関係することが示唆された． -
Biochemical mechanism of reactive carbonyl signaling in plants
Grant number：20H03278 2020.04 - 2023.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Mano Jun'ichi
Grant amount：\17940000 （ Direct expense: \13800000 、 Indirect expense：\4140000 ）
We found the following facts. (1) RCS suppresses the plasma membrane H+-ATPase activity/activation in the guard cell and thereby inhibit the blue light-responsive stomata opening. (2) RCS act as a signal to start leaf senescence. The aldehyde oxidase in the leaf suppresses the initiation of senescence by scavenging RCS such as acrolein. (3) Salt stress-induced growth inhibition of plants was suppressed by the scavenging of RCS with the exogenously added carbonyl scavenger dipeptides, indicating that the RCS accumulation is a critical cause of salt stress-related tissue injury. (4) Several glutathione transferase Tau class isozymes in Thellungiella halophila and Lotus japonicus show substrate specificity for RCS such as acrolein and HNE, as do those in Arabidopsis thaliana. (5) Alkenal reductase (AER), which resides in the cytosol, can scavenge some of apocarotenoids, which are generated in the chloroplast and act as a retrograde signal, suggesting a signal-regulating role of AER.
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How do plants utilize reactive carbonyl species as specific redox signals?
Grant number：17H03700 2017.04 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
MANO Jun'ichi
Grant amount：\17680000 （ Direct expense: \13600000 、 Indirect expense：\4080000 ）
Reactive carbonyl species (RCS), decomposition products of lipid peroxides, mediate oxidative damage and oxidative signal in plants as downstream products of reactive oxygen species (ROS). To elucidate the regulation and function of RCS signal, we examined their metabolism and actions. Following results were obtained. (1) The enzymatic activity of 20 tau isozymes of glutathione transferase (GST) for RCS were examined. A half the tested isozymes scavenged RCS, suggesting that RCS are major endogenous substrates of GST. (2) Addition of ROS or RCS to Arabidopsis thaliana roots induced auxin-responsive genes and induced lateral root (LR). Thus ROS and its downstream products RCS constitute a feed-forward loop of the auxin signal for LR formation. (3) In ROS-triggered programmed cell death (PCD) of tobacco cells, an RCS reductase was found inactivated by ROS at a very early stage. This suggests that the reductase is a ROS sensor to facilitate RCS signal for PCD.
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シロイヌナズナにおけるエリシター誘導機構閉口へＭＡＰキナーゼの関与
Grant number：12F02390 2012.04 - 2015.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特別研究員奨励費 特別研究員奨励費
村田 芳行, KHOKON Md. Atiqur Rahman, KHOKON M.
Grant amount：\2300000 （ Direct expense: \2300000 ）
陸生高等植物の葉の表皮に存在する気孔は、多くの植物病原菌の侵入経路となっている。微生物の侵入を阻止するために、孔辺細胞は微生物由来エリシターを認識し、孔辺細胞エリシター信号伝達を介して、気孔閉口を誘導する。しかしながら、シロイヌナズナにおけるエリシター誘導気孔閉口へのＭＡＰキナーゼの関与は十分に明らかにされていない。
本研究では、材料にシロイヌナズナMAPキナーゼ変異体を用いて、エリシターが誘導する気孔閉口へのMAPキナーゼの関与を明らかにすることを目的とした。実験では、気孔運動（気孔閉口と開口阻害）、セカンドメッセンジャー産生（活性酸素種産生、一酸化窒素産生、細胞質カルシウム濃度上昇、細胞質アルカリ化）、イオンチャネル活性（原形質膜非選択性カルシウムチャネル活性化、S型アニオンチャネル活性化、原形質膜内向き整流性カリウムチャネル阻害）の変化を調べた。また、エリシターとして、キトサンと酵母エリシターを用いた。
活性酸素種産生はH2DCF-DAを、一酸化窒素産生はDAF2-DAを、カルシウム濃度上昇はYC3.6を、そして、アルカリ化はBCECF-AMを用いて測定した。
エリシター誘導気孔閉口にMAPキナーゼが関与することを明らかにした。また、他の刺激に対するMAPキナーゼの関与について知見を得た。さらに、異種発現系を用いて、エリシター誘導気孔閉口へのMAPキナーゼの関与について調べ、直接的なチャネル活性の制御はないことを明らかにした。 -
Oxidation of ion transporters induced by salt stress in higher plants
Grant number：22380044 2010 - 2012
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
MURATA Yoshiyuki
Grant amount：\18460000 （ Direct expense: \14200000 、 Indirect expense：\4260000 ）
A number of ion transporters are involvedin uptake of nutrients from roots and gas exchange of stomata that are vital for higher plants to grow. Potassium channel is one of requisite channels that function on maintenance of ratio of potassium to sodium in salt-stressed plants. Environmental stresses induce oxidative stress to damage physiological function of plant cells. However, cellular mechanisms remain to be clarified. In this study, we examined effects of reactive oxygen species and aldehydes on plant potassium channels.
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耐塩性に関与した塩ストレスによる植物のイオンチャネルタンパク質の修飾・酸化
Grant number：08F08099 2008 - 2009
日本学術振興会 科学研究費助成事業 特別研究員奨励費 特別研究員奨励費
村田 芳行, HOQUE M.A., HOQUE M. A.
Grant amount：\1600000 （ Direct expense: \1600000 ）
塩ストレスが誘導する活性酸素種(過酸化水素など)やアルデヒド(メチルグリオキザールなど)の生成は、タンパク質や脂質の酸化を引き起こし、また、プロリンやベタインが、活性酸素種消去やアルデヒド消去に関与する酵素の活性を向上させる。一方、耐塩機構において、細胞内からのカリウムの流出に深く関与する原形質膜外向き整流性カリウムチャネルの活性の制御が重要であり、また、細胞の信号伝達に重要である原形質膜カルシウム(非選択性カチオン)チャネルが酸化還元に関わる過酸化水素やNADPHによって活性が制御されている。
本年度は、「耐塩性に関与した塩ストレスによる植物のイオンチャネルタンパク質の修飾・酸化」の解析を目的として、以下の成果を得た。
1)耐塩性に深く関与するタンパク質に着目し、塩ストレスによって産生が誘導されるアルデヒド(特に、メチルグリオキザール)や活性酸素種(過酸化水素)によるタンパク質の修飾・酸化が及ぼす活性への影響を調べた。いくつかのタンパク質の活性が大きく変化することを明らかにした。
2)アルデヒドや活性酸素種による修飾・酸化されるタンパク質のアミノ酸残基の同定をMALDI-TOF MSを用いて行なった。現在、ペプチド断片の調整等の検討を行ない、アルデヒドで修飾されたアミノ酸残基を同定し、結晶構造解析の結果より、活性への関与する可能性が高い位置にあるアミノ酸であることがわかった。 -
Abscisic acid-induced stomatal closure
Grant number：17078006 2005 - 2009
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
MURATA Yoshiyuki, MORI Izumi
Grant amount：\79500000 （ Direct expense: \79500000 ）
Stomatal movement is closely involved in drought tolerance and absorption of nutrients. In this study, we analyzed mechanism of stomatal closure induced by abscisic acid to find new signaling components including proteins and low molecule compounds.
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アブシジン酸誘導による気孔閉口における活性酸素種の役割
Grant number：14704018 2002 - 2003
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(A) 若手研究(A)
村田 芳行
Grant amount：\28990000 （ Direct expense: \22300000 、 Indirect expense：\6690000 ）
アブシジン酸誘導による気孔閉口における活性酸素種の役割に関して以下の結果を得た。特に、エリシター応答に関して重要な知見を得、その成果をPlant Physiology(2002)に掲載した。また、一酸化窒素やエリシター応答に関する知見を得、農芸化学会2004年度大会で発表し、さらに、これらの知見を投稿する予定である。
エリシター応答:種々のエリシターがシロイヌナズナ気孔の閉口を誘導することを明らかにした。パッチクランプ法を用いて、エリシターによって原形質膜カルシウムチャネルの活性化が起き、その活性化には細胞質のNADPHが必要であることを明らかにした。NAD(P)Hオキシダーゼ阻害剤であるDPIによって、エリシター誘導の気孔閉口が阻害されることを明らかにした。また、細胞内カルシウム濃度測定によって、エリシターが孔辺細胞内のカルシウム濃度の上昇を誘導することを明らかにした。また、気孔閉口の可逆性はともに高濃度でなくないことを明らかにした。このエリシターによる気孔閉口機構がアブシジン酸による気孔閉口機構と極めて類似していることを明らかした。
原形質膜NAD(P)Hオキシダーゼ:シロイヌナズナにおいて、過酸化水素の生成に先立ち生成するスーパーオキサイド生成に関与する2つNAD(P)Hオキシダーゼがアブシジン酸によって誘導される気孔閉口に深く関与していた。エリシターとの関係についての知見も得た。
一酸化窒素の役割:アブシジン酸誘導気孔閉口において、一酸化窒素がセカンドメッセンジャーとして機能していることを明らかにした。しかし、これまでに他のグループの報告に反する結果となり、パッチクランプ法とイエローカメレオンを用いた細胞内カルシウム測定法を用い、アブシジン酸誘導において働くカルシウムチャネルへの一酸化窒素の影響を調べ、情報を集めている。 -
Development of measurement of selenium and phytoremidiation to selenium
Grant number：13660065 2001 - 2002
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
SHIMOISHI Yasuaki, MURATA Yoshiyuki
Grant amount：\2300000 （ Direct expense: \2300000 ）
1. Development of measurement of selenium
1) Synthesis of fluorescent ortho-diamino-aromatic compounds : 1, 2-diaminophenazine were synthesized from 1, 2-phenylenediamine and 1, 2-diaminoanthragarol were synthesized from gallic acid and 3, 4-diaminobenzoic acid.
2) Measurement of selenium(IV) using 2, 3-diaminonaphthalene : This compound allowed detection of 0.8 ng/l selenium with a fluorometer.
3) Measurement of selenium(IV) using the fluorescent compounds : Selenium was measured using 9, 10-diaminophenanthrene, 1, 2-diaminoanthraquinone, 1, 2-diaminophenazine and 1, 2-diaminoanthragarol. Piazselenols from these compounds were so hydrophobic that the piazselenols could not be dissolved in water on fluorescent measurement.
4) Perspective : It is necessary to improve hydrophobicities of these compounds shown in 3) in order to apply these compounds to measurement of selenium.
2. Plant tolerant to selenium
1) Selenium sensitivity of wild type plants : Arabidopsis thaliana Colombia was employed as a material. Sodium selenate did not affect seed germination up to 1 mM but even 150 μM Na_2SeO_4 induced chlorosis.
2) Mutation and screening : The concentration of Na_2SeO_4 to screen tolerant mutants was 500 μM. Three putative mutants were isolated from EMS lines and T-DNA tagged lines.
3) Analysis of mutants : These mutants were being crossed with the parental wild type. One of them was not a mutant at the same locus of sel1. -
高等植物の耐塩機構における原形質膜カリウム・ナトリウム輸送系の制御
Grant number：11760049 1999 - 2000
日本学術振興会 科学研究費助成事業 奨励研究(A) 奨励研究(A)
村田 芳行
Grant amount：\2100000 （ Direct expense: \2100000 ）
高等植物の耐塩機構において、細胞レベルで、カリウム・ナトリウムイオンバランスの維持、個体レベルでの、水の蒸散の制御は、その中心的役割を果たしており、これらの制御には、原形質膜のカリウムチャネルが深く関与している。また、その原形質膜カリウムチャネルの制御には、カルシウムイオンが関与している。本研究では、タバコ培養細胞およびシロイヌナズナ孔辺細胞を材料として、以下の成果を得た。
1 タバコ培養細胞を材料として、塩ストレスによって細胞内に蓄積するプロリンと細胞内カリウム・ナトリウムイオンバランスとの相関を調べ、負の相関が得られ、プロリンの蓄積は、細胞内のイオンバランスの崩壊、つまり、バランスを維持するためのカリウム・ナトリウム輸送に深く関与していることが明らかになった。(Soil.Sci.Plant Nutr.46;257-263、投稿準備中)
2 細胞内のカリウム・ナトリウムイオンバランスの維持に重要な役割を果たしている原形質膜カリウムチャネルは、細胞外のカルシウムに強く制御されている。このカルシウムによる制御を詳細に調べるために、原形質膜でのカルシウム結合挙動を、塩ストレス適応細胞と非適応細胞とで測定し、比較した。その結果、非適応細胞において、ナトリウムによって解離しやすかったカルシウムが、適応細胞においては、ナトリウムによって解離しにくくなっていた。(Plant Cell Physiol.46;1286-1292)
3 アブシジン酸誘導の気孔の閉口には、細胞内のカルシウムの上昇が必須である。シロイヌナズナ孔辺細胞を材料として、この細胞内カルシウムの上昇を媒介する原形質膜カルシウムチャネルを同定し、また、アブシジン酸によって産生が誘導される過酸化水素によって、このカルシウムチャネルが活性化されることを明らかにした。(Nature 406;731-734) -
植物ホルモンシグナリング
1998
科学研究費補助金
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植物の環境ストレス耐性
1994