Research Projects -
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がん遺伝子パネル検査の全国登録データを利用した悪性骨軟部腫瘍の網羅的遺伝子解析
Grant number：23K08632 2023.04 - 2026.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C)
國定 俊之, 中田 英二, 藤原 智洋
Grant amount：\4550000 （ Direct expense: \3500000 、 Indirect expense：\1050000 ）
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Basic research for the establishment of adequate sequence of chemotherapy in the treatment of advanced soft tissue sarcoma
Grant number：22K09436 2022.04 - 2025.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
山根 弘路, 中西 秀和, 瀧川 奈義夫, 國定 俊之, 越智 宣昭
Grant amount：\4030000 （ Direct expense: \3100000 、 Indirect expense：\930000 ）
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新規肉腫バイオマーカーを利用したリキッドバイオプシーの臨床応用
Grant number：19K09650 2019.04 - 2022.03
日本学術振興会 科学研究費助成事業 基盤研究(C) 基盤研究(C)
國定 俊之
Grant amount：\4290000 （ Direct expense: \3300000 、 Indirect expense：\990000 ）
粘液線維肉腫（MFS）患者、非MFS肉腫患者、健常人の血清RNAを用いてmicroarray解析を行った。細胞株はNMFH-1、NMFH-2、およびヒト間葉系幹細胞(hMSC)を用いた。患者血清、細胞株培養上清由来RNA、NMFH-1の担癌マウス血清由来RNAを用いてqRT-PCR解析を行い、MFSにおける分泌型miRNAを検討した。microarray解析により5種類、qRT-PCRにより5種類のうち3種類のmiRNAが健常人よりMFS患者の血清において有意に高く発現していた。さらに術後にも低下するmiRNAを選別した。このmiRNAはMFS細胞株培養上清、担癌マウス血清においてcontrolと比較し有意に発現が高く、腫瘍サイズと有意な相関関係を認めた。次に、MFS細胞株培養上清より抽出したexosome分画の解析を行い、これらを用いmigration assay、ヒト由来正常線維芽細胞(NF)を用いたinvasion assayによる機能解析を行った。MFS細胞株培養上清由来exosome分画においてもその発現は高かった。migration assayではexosome投与による肉腫細胞自身の移動能増加は認めなかったが、invasion assayではNFに腫瘍由来exosomeを暴露した群でコントロール群より肉腫細胞の浸潤性が増強された。MFSの患者血清・培養上清から分泌型miRNAを特定し、新規バイオマーカーとなりうる可能性が示された。さらにこのmiRNAは肉腫由来exosomeに内包されることが示され、肉腫細胞自身に作用するのではなく、周囲正常細胞に作用することで易浸潤環境を作っていると考えられた。すなわち腫瘍由来exosomeによるパラクライン効果の存在が示唆された。
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Grant number：17K10969 2017.04 - 2020.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Morita Takuya
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
Infiltrative tumor growth into adjacent soft tissues is a major cause of the frequent recurrence of sarcoma, and no useful biomarkers are available for tumor monitoring. The aim of the present study was to identify fibroblasts.
Serum miRNA expression may represent a novel diagnostic target for monitoring of highly aggressive sarcoma. Furthermore, exosomal miRNA could act as a transfer messenger to adjacent cells and mediate the infiltrative nature of sarcoma, revealing a crosstalk between tumor cells and normal cells in the tumor microenvironment. -
Identification of diagnostic biomarker and novel fusion genes of bone and soft tissue sarcoma
Grant number：16H02676 2016.04 - 2021.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (A) Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
Matsuda Koichi
Grant amount：\46410000 （ Direct expense: \35700000 、 Indirect expense：\10710000 ）
In this research project, we conduced genome analysis and functional analysis of bone and soft tissue tumors to elucidate their molecular pathogenesis and developing new therapeutics. Through a collaborative network of Japan sarcoma genome consortium consisting of 28 medical institutions and 14 research institutes, pairs of tumor and normal tissue of 20 target diseases (dedifferentiated liposarcoma, giant synovial cell tumor, epithelial sarcoma, and osteoblastoma etc) were collected and RNA sequence and whole exome sequence of more than 400 samples was performed. As a result, CTDSP1 / 2-DNM3OS fusion (dedifferentiated liposarcoma) was identified as a disease-specific fusion gene. We also identified frequent CBL mutations in tenosynovial giant cell tumors and useful prognostic markers for Desmoid tumors.
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Identification of molecular targets for liquid biopsy in patients with bone and soft tissue sarcoma
Grant number：16H05449 2016.04 - 2019.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Ozaki Toshifumi, OCHIYA Takahiro, YOSHIOKA Yusuke, UEDA Koji, UEHARA Takenori
Grant amount：\17550000 （ Direct expense: \13500000 、 Indirect expense：\4050000 ）
Lack of circulating biomarker is a crucial problem for bone and soft tissue sarcomas. To improve prognosis in patients, identification of sensitive circulating biomarkers is important, since current diagnostic modalities have limitations in monitoring tumor or drug sensitivity during/after treatments for bone and soft tissue sarcomas. In our study, we identified the circulating exosomal marker by proteomic analysis using Ewing sarcoma cell culture media and serum samples from Ewing sarcoma patients. In patients with osteosarcoma, we identified serum miR-25-3p as a circulating biomarker that is secreted from OS cells. Serum miR-25-3p levels reflected tumor response to chemotherapy and recurrence, and were significantly correlated with prognosis in patients. We also identified serum miR-92b-3p as a diagnostic target of liquid biopsy for synovial sarcoma. Overall, our data indicated promising diagnostic role of circulating miRNAs and exosomes for bone and soft tissue sarcomas.
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Grant number：16K10862 2016.04 - 2019.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Kunisada Toshiyuki
Grant amount：\4550000 （ Direct expense: \3500000 、 Indirect expense：\1050000 ）
Our study demonstrated that OBP-702 has much stronger anti-tumor effect compared to OBP-301, and sensitizes radiotherapy to various types of osteosarcoma cell lines. We recently identified that OBP-702 induces profound apoptosis through p53-dependent BAX upregulation and E1A- dependent p21 and MDM2 downregulation in epithelial malignant cells. This study revealed further molecular mechanisms of synergistic antitumor effect of OBP-702 with radiation; p53-dependent apoptosis, downregulation of the anti-apoptotic BCL-2 family proteins and interruption of the cellular DNA repair mechanism. Currently, a Phase I/II clinical study of OBP-301 in combination with radiation against esophageal cancer patients is underway in Japan, and preclinically OBP-702 provides more profound therapeutic potentials than OBP-301 in various tumors. Thus, OBP-702 would provide a novel treatment strategy for STS and wide application of radiotherapy for localized as well as advanced musculoskeletal sarcoma.
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Grant number：15K10446 2015.04 - 2018.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Sugiu Kazuhisa
Grant amount：\4680000 （ Direct expense: \3600000 、 Indirect expense：\1080000 ）
Despite major advances in the treatment of bone and soft tissue sarcoma, those patients often show the refractory to conventional treatment, leading to poor prognosis. Therefore, the enhancement of sensitivity to radiotherapy is needed to improve the clinical outcome of bone and soft tissue sarcoma patients. We recently revealed that a tumor-specific, replication-competent oncolytic adenovirus Telomelysin (OBP-301) kills human sarcoma cells. In this study, we investigated the combination effect of Telomelysin and radiotherapy against human bone and soft tissue sarcoma cells. Combination with Telomelysin and radiotherapy showed more profound antitumor effect compared to monotherapy in vitro and in vivo. These results suggest that combination with Telomelysin and radiotherapy provides a novel therapeutic strategy for bone and soft tissue sarcoma.
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p53-expressing oncolytic adenovirus enhances the anti-tumor effect of chemotherapy and radiotherapy
Grant number：25293323 2013.04 - 2016.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Ozaki Toshifumi, KUNISADA TOSHIYUKI, FUJIWARA TOSHIYOSHI, FURUMATSU TAKAYUKI, TAKEDA KEN
Grant amount：\17810000 （ Direct expense: \13700000 、 Indirect expense：\4110000 ）
Despite major advances in the treatment of bone and soft tissue sarcomas, some patients show a poor response to chemotherapy and radiotherapy, leading to a poor prognosis. We recently developed the p53-expressing oncolytic adenovirus, OBP-702. And we confirmed OBP-702 effectively killed human osteosarcoma cells. In the present study, we evaluated the efficacy of combined treatment with OBP-702 and chemotherapy or radiotherapy on human bone and soft tissue sarcoma cells. OBP-702 enhanced the anti-tumor effect of chemotherapy and radiotherapy.
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Grant number：25462333 2013.04 - 2016.03
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Kunisada Toshiyuki, OZAKI Toshifumi
Grant amount：\4810000 （ Direct expense: \3700000 、 Indirect expense：\1110000 ）
We previously developed an oncolytic adenovirus, OBP-301, in which the hTERT gene promoter drives the expression of the E1A and E1B genes. A phase I clinical trial of OBP-301 was conducted in the United States on patients with advanced solid tumors, and a phase II clinical trial is being conducted in our hospital on patients with advanced esophageal cancer. In this study, we revealed the cytopathic activity of OBP-301 in bone and soft tissue sarcoma cells. Moreover, OBP-301 enhanced chemosensitivity to doxorubicin and cisplatin in human osteosarcoma cells. The antitumor effect of OBP-301 was remarkable on human osteosarcoma orthotopic xenograft model; however, bone destruction could not be prevented by OBP-301 monotherapy. Combination treatment with OBP-301 and zoledronic acid showed a synergistic antitumor effect, and prevented bone destruction. Our data indicates that OBP-301 is a promising antitumor reagent for the treatment of bone and soft tissue sarcomas
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Analysis of Genomic Aberrations in Osteosarcoma : comparison of age and location
Grant number：20390400 2008 - 2010
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
OZAKI Toshifumi, KUNISADA Toshiyuki, SUGIHARA Shinsuke, MORIMOTO Yuki
Grant amount：\9750000 （ Direct expense: \7500000 、 Indirect expense：\2250000 ）
Osteosarcoma is the most common primary solid tumor of bone, which can be characterized by a high level of genetic instability and rarely resistanct to conventional treatments. This study focused on the chromosome aberrations and the changes of gene expressions influencing on the specific tumor site, the histopathological subtypes, and the prognosis. We hypothesized that the DNA copy number changes in the domain of chromosomal instability may be related to the tumorigenesis of osteosarcoma. The chromosomal instabilities of osteosarcoma were studied using the array CGH method for each age and location. We identified that there were more DNA deletion in extremities patients than in trunk patients. We detected several gene regions which may lead to different biological tumorigenic process between young and elderly patients.
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Grant number：20591781 2008 - 2010
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C) Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
KUNISADA Toshiyuki, ANDOU Masami, SUGIYAMA Hiroshi, SHIMAO Daisuke
Grant amount：\4420000 （ Direct expense: \3400000 、 Indirect expense：\1020000 ）
We developed a novel type of X-ray dark field imaging (DFI). We examined a disarticulated distal femur and a shoulder joint with surrounding soft tissue and skin, both excised from a human cadaver. Articular cartilage of the disarticulated distal femur was obvious on DFI, but not on standard X-ray images. Furthermore, DFI allowed visualization in situ of articular cartilage of the shoulder while covered with soft tissue and skin. The gross appearance of the articular cartilage on the dissected section of the proximal humerus was identical to the cartilage shown on the DFI image. These results suggested that DFI could provide a clinically accurate method of assessing articular cartilage. Hence, DFI would be a useful imaging tool for diagnosing joint disease such as osteoarthritis.
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上皮間葉移行における腫瘍浸潤能獲得の解明とヒストン修飾と腫瘍悪性化の関連性
Grant number：19659379 2007 - 2009
日本学術振興会 科学研究費助成事業 挑戦的萌芽研究 挑戦的萌芽研究
尾崎 敏文, 国定 俊之, 古松 毅之
Grant amount：\3100000 （ Direct expense: \3100000 ）
今回の研究では、我々が確立した腫瘍組織浸潤モデルマウスを使用し、軟部腫瘍におけるヒストン修飾と腫浸潤能獲得との関連性をEpithelial-Mesenchymal Transition (EMT;上皮間葉移行)の理論のもと、HDAC複合体関連因子によるE-Cadherinの発現調節の解析を目的とする。
21年度 に、ヒストン修飾とEMT関連遺伝子の発現、SYO-1細胞の初代培養細胞からの新たな細胞株の樹立(SYO-1e細胞)を行った。アセチル化ヒストンH4に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降法(ChIP assay ; Chromatin Immunoprecipitation Assay)により,p21プロモーター領域の結合について検討を行った。
HDAC阻害剤添加により、RT-PCR法では,p21mRNAはHDAC阻害剤添加により継時的に発現が増強された。また,Western blotによりp21の蛋白発現においても継時的に発現が増強された。また、ChIP assayではHDAC阻害剤添加によりp21プロモーター領域のp53結合ドメインへの結合を認め、p21蛋白発現を制御すると考えられた。
分離されたSYO-1e細胞はin vitroにおいて、上皮様形態を示し、上皮系マーカーの発現を認めたが、HDAC阻害剤によるE-cadherin遺伝子の発現変化に差を認めなかった。現在In vivoにおける滑膜肉腫細胞株の細胞間接着能について検討している。今後さらに条件を検討しHDAC関連因子におけるE-cadherin発現調整を検討し軟部腫瘍におけるヒストン修飾と腫瘍浸潤能獲得について研究を続ける。 -
X線暗視野法による新しい整形外科的画像診断法の開発と臨床応用
Grant number：18791040 2006 - 2007
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B) 若手研究(B)
國定 俊之
Grant amount：\3400000 （ Direct expense: \3400000 ）
屈折原理を用いる「X線暗視野法」を利用して、さまざまな関節(解剖体)の撮影を行った。被写体として、皮膚や筋肉などの軟部組織が付着したより生体に近い状態で撮影するため、御遺体より摘出した各関節標本を撮影し、正確に軟骨が撮影可能な条件設定を試みた。単純X線と同様に、どのように関節を配置し、どの方向でX線を照射するかが、きれいな関節軟骨の撮影の重要なポイントになるため、将来の臨床応用のためにも、個々の関節での最適な撮影方法を設定する必要がある。
肩、指および膝関節の撮影を行った。肩関節は関節軟骨が撮影可能であるかの実験であったため、肩関節に関節症変化の少ない関節を選んで撮影した。その結果、我々の開発したX線暗視野法で正確に関節軟骨の撮影が可能であることが証明された。そこで膝関節の撮影では、軟骨変性の撮影を目指し、変形性関節症を認める膝関節を用いた。肩関節と同様に、入射角度を変化させることにより、膝関節の関節軟骨を撮影することができた。しかし、膝関節では、関節内に半月板や靭帯が存在し、関節軟骨の面積も大きいため、肩関節と同じ条件ではきれいな関節軟骨の像が得られなかった。そこで、X線暗視野法の装置の改良を行った。この改良により、暗視野の条件をより安定させることが可能となり、より解像度の高い画像の撮影が可能となった。さらに、視野も90×99mmと拡大され、より大きな被写体の撮影も可能となった。この改良と平行して、数回のマシンタイムを使って膝関節の関節軟骨の撮影を行い、実験を重ねることで、解像度の高い膝関節の関節軟骨の撮影が可能となった。また、preliminaryであるが、断層撮影を行なうことに成功した。最終的な被爆量は、通常の腰椎の単純X線像とほぼ同等の被爆量が達成されており、安全面でも問題のないことが証明された。 -
Array Comparative Genomic Hybridization of Enchondroma and Grade 1 Chondrosarcoma
Grant number：18390417 2006 - 2007
Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B) Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
OZAKI Toshifumi, KUNISADA Toshiyuki
Grant amount：\5970000 （ Direct expense: \5400000 、 Indirect expense：\570000 ）
Background and Aims: It is difficult to make pathological diagnosis between enchondroma and low grade chondrosacoma because of similar histology. Array comparative genomic hybridization (CGH), which is a useful tool to detect various gains and losses of gene copy number, provides important information about the genesis of specific diseases. We performed array CGH to identify the difference of genomic alterations between enchondroma and grade 1 chondrosarcoma.
Methods: We performed array CGH to assess the copy number changes in frozen specimens of 9 enchondroma (EC) and 8 grade 1 chondrosarcoma (CS),those were collected surgically and diagnosed histologically. We analyzed genomic alterations of enchondroma and grade 1 chondrosarcoma and those related genetic changes, and focused on the specific copy number change detected in more than half cases of each histological type (EC:〓25/9 cases, CS:〓24/8cases).
Results: Genetic imbalances were found in all samples. There were similar copy number changes between two groups. Array CGH showed specific genetic imbalances of20 gains and 14 losses in enchondroma, and 41 gains and 16 losses in grade 1 chondrosarcoma. The most common regions of gain of gene copy in both samples were 2q12.1-2(60%),6p22(60%),7q11.2(53%),15q13.2( 53%),21q22.1(60%)and 22q13.3(60%),and the most common regions of loss were 1q21.3(87%),6p21.3( 73%),7q22.1(60%), 19q13.2(67%),20q11.2( 93%),and 20q13.1-2(80%). The specific regions detected in enchondroma were 9q34 and 13q12, and those detected in those chondrosarcoma,11p15.4,12q13.2,17q12, and 13q14. Gain of WDR5 was observed in seventy-eight percent of enchondroma. Gain of CHK2 was observed in all grade I chondrosarcoma, and gain of DTX3 was observed in seventy-five percent. These genes may be candidate genes related to the progression of grade I chondrosarcoma.
Conclusion: We demonstrated several specific genomic alternations detected in enchondroma and grade 1 chondrosarcoma using array CGH, although there were more similar genomic alterations between both tumors. In this study, array-CGH identified gain of CHK2, RARA, and DTX3 in grade I CS, and gain of WDR5 in enchondroma. CHK2 and WDR5 gene may be a target of tumor progression in grade I CS and EC. -
ChIP-CGH法の開発、骨軟部肉腫におけるクロマチン修飾の網羅的解析
Grant number：17659469 2005 - 2006
日本学術振興会 科学研究費助成事業 萌芽研究 萌芽研究
尾崎 敏文, 国定 俊之
Grant amount：\1700000 （ Direct expense: \1700000 ）
昨年度はChIp(Chromatin Immuno-Precipitation)-CGH(comparative genomic hybridization)法の条件を元に、ChIp-CGHの条件および精度を確認するため、滑膜肉腫細胞株SYO-1を用いて実験を行った。SYO-1細胞にヒストンアセチル化阻害剤FK228を投与し、ヒストンのアセチル化を誘導し、ChIp-CGH法でヒストンアセチル化の検出を行えるか検証した。
本年度は、ヒストンのアセチル化の状態をより詳細に検出するためにマイクロアレイを用いて、アレイCGHを行った。ChIp-CGH法で用いたDNAを用いて、DOP-PCR法を用いてDNAの増幅を行った後、Cydyeにて蛍光標識し(ChIp DNA とInput DNA)、Operon社製OpArrayにハイブリダイズさせた。その後Agilent DNA Microarray Scannerで取り込み後、Feature Extraction Softwareを用いて数値化した。Log ratio+/-2.0以上をgain(高アセチル化)、loss(低アセチル化)と判定した。
アレイCGHでの結果は、ChIp-CGH法の結果と異なる傾向にあった。ChIp-CGH法ではメタファーゼ上で全染色体を網羅的に検索可能であるが、アレイCGHではすべての領域を網羅していないためと考えられる。そのため、ChIp-CGH法で検出された領域を選択したカスタムアレイを選択するべきである。
ChIp-CGH法を用いてヒストンアセチル化領域の検出が可能であった、しかし検出感度の問題があり、遺伝子を特定するには至らない。そのため、より詳細に遺伝子を検出するためには、特定した領域のデレイCGHを行うべきである。 -
骨軟部腫瘍における新しい光感受性物質を用いた光線力学療法の有用性に関する研究
Grant number：15790792 2003 - 2004
日本学術振興会 科学研究費助成事業 若手研究(B) 若手研究(B)
國定 俊之
Grant amount：\3400000 （ Direct expense: \3400000 ）
1.滑膜肉腫細胞株(SYO-1),軟骨肉腫細胞株(OUMS-27)に対する光線力学療法の効果の検討
(1)ATX-S10・Na(II)を用いた光線力学療法による細胞形態の変化の蛍光顕微鏡下の観察
SYO-1細胞,OUMS-27細胞ともにATX-S10・Na(II)に暴露後にレーザー照射を行った場合に核の濃縮,分裂像が観察された.またTUNEL染色で陽性細胞が観察され光線力学療法による細胞死にapoptosisが関与することが示唆された。
(2)細胞死がApoptosisによるものかNecrosisによるものかの検討
Caspase assayを行った。SYO-1細胞では低濃度のATX-S10・Na(II)に暴露された方がレーザー強度にかかわらずCaspase活性が高く,ATX-S10・Na(II)の高濃度の場合に比べapoptosisが起こる傾向にあることが示された。OUMS-27細胞でもCaspase活性の上昇が認められたが,高濃度,低濃度の場合で優位な差は認めなかった。
2.ヌードマウス皮下腫瘍{滑膜肉腫細胞株(SYO-1),軟骨肉腫細胞株(OUMS-27)}に対する光線力学療法の効果の検討
(1)in vivoにおける腫瘍内へのATX-S10・Na(II)の取り込みの経時的変化
SYO-1細胞およびOUMS-27細胞担癌マウスの尾静脈よりATX-S10・Na(II)注射後,3時間でATX-S10・Na(II)の蛍光は観察されたが6時間以降では観察されなかった。
(2)光線力学療法後,腫瘍の縮小効果および腫瘍の増大速度抑制が認められた。組織学的にはレーザー照射群で壊死,繊維化した部分が観察された。
これらの結果より、ATX-S10・Na(II)は骨軟部腫瘍治療に有用である可能性があり、今後臨床応用へ向けての更なる実験を行う予定である。